制备纯化的晶体CCI-779的方法
本发明的背景
本发明提供了纯化的晶体CCI-779和制备其的方法。
与3-羟基-2-(羟甲基)-2-甲基丙酸的雷帕霉素42-酯(CCI-779)是一种雷帕霉素的酯，已经证明其对于体外和体内模型中的肿瘤生长具有显著的抑制效果。已经证明CCI-779在许多应用中是有效的，包括作为治疗中枢神经系统癌症、血癌、乳腺癌、前列腺癌症、黑素瘤、神经胶质瘤和恶性胶质瘤的抗癌剂。
CCI-779可以延迟发展为肿瘤的时间或肿瘤复发时间，其是更典型的细胞生长抑制剂而不是细胞毒素剂。认为CCI-779具有与西罗莫司(Sirolimus)相似的作用机理。CCI-779与抑制酶mTOR(雷帕霉素的哺乳动物靶标，又名FKBP12-雷帕霉素相关蛋白(FRAP))的胞浆蛋白FKBP结合并形成复合物。抑制mTOR激酶活性可以抑制许多信号转导途径，包括细胞素-激发的细胞增殖、调节细胞周期的G1期的一些关键蛋白的mRNAs的转译和IL-2引起的转录、引起细胞周期从G1至S发展的抑制。导致G1-S期阻滞的CCI-779的作用机理对于抗癌药物来说是全新的。
在体外，已经显示CCI-779可以抑制许多组织学不同的肿瘤细胞的生长。中枢神经系统(CNS)癌症、血癌(T细胞)、乳腺癌、前列腺癌症和黑素瘤系列对CCI-779最敏感。该化合物可以抑制细胞周期的G1期中的细胞。
裸鼠的体内试验已经证明，CCI-779针对不同组织类型的人类肿瘤异种移植具有活性。神经胶质瘤对CCI-779特别敏感，并且该化合物在裸鼠的常位神经胶质瘤模型中具有活性。人类体外恶性胶质瘤细胞系的生长因子(血小板-衍生的)-引起的刺激，可以由CCI-779显著地抑制。一些人类胰腺肿瘤在裸鼠中以及体内研究的两种乳腺癌系列之一的生长，也可以由CCI-779抑制。
已经利用一些重结晶方法来纯化CCI-779，其制备的CCI-779含有不合格量的杂质。产生更纯化的CCI-779的其它方法包括色谱纯化，其提供更纯的CCI-779形式。然而，这些色谱提纯法不能放大，来制备任何可观数量的纯化CCI-779，并且这样做在财政上也是不利的。
本领域需要的是制备纯化形式的CCI-779的替代方法，尤其是更大规模进行的方法。
附图的简要说明
图1提供了按照本发明制备的纯化的晶体CCI-779的代表性样本的差示扫描量热热谱图。
图2提供了按照本发明制备的纯化的晶体CCI-779的代表性样本的X射线衍射图。
本发明概述
在一方面，本发明提供了纯化的晶体CCI-779。
在进一步方面，本发明提供了纯化的晶体CCI-779，该方法不包括色谱法。
在另一个方面，本发明提供了纯化的晶体CCI-779，其纯化不包括色谱法。
在进一步方面，本发明提供了制备纯化的晶体CCI-779的方法。
在另一个方面，本发明提供了纯化CCI-779的方法。
在进一步方面，本发明提供了检测CCI-779的结晶和/或纯化的方法。
在下面其优选实施方案的详细说明中，进一步描述了本发明的其它方面和优点。
本发明的详细说明
本发明提供了制备具有良好结晶度的纯化的晶体CCI-779的方法。该方法也可以成功地大规模地进行，不会不利地影响CCI-779产物的纯度，并且具有良好的收率。
纯化CCI-779的良好结晶度可以促进纯化CCI-779的稳定性提高和比较久的保存期限，并且含有更少的氧化杂质。在一个实施方案中，本发明的纯化的晶体CCI-779在大约1个月期间内的降解小于大约3％、小于大约2％或小于大约1％。优选，纯化的晶体CCI-779在大约3个月期间内保持大于97％强度(strength)，且更优选在大约5℃下保持大约6个月(利用高效液相色谱法(HPLC)(或其它技术)测定)。在至多大约70℃的高温下，优选至多大约51℃，更优选温度至多大约25℃，和至多大约60％的较大相对湿度，最优选温度在大约5℃或其组合，可以类似地保持强度(strength)。在一个实施方案中，在大约25℃温度和大约60％的相对湿度下，按照本发明制备的纯化结晶CCI-779可以保持高达大约3个月的稳定性，且更优选高达大约6个月。
按照本发明制备的纯化的晶体CCI-779典型地含有小于0.6％wt/wt的氧化杂质。优选，纯化CCI-779还含有小于0.1％wt/wt的苯基硼酸和小于大约0.3％wt/wt的丙酮。本文使用的术语“氧化杂质”是指在纯化的晶体CCI-779的固体试样中，由于残余苯基硼酸的降解产生的杂质。
纯化的晶体CCI-779典型地具有差示扫描量热(DSC)热谱图，其具有大于大约165℃的吸热峰。优选，吸热峰在大约165℃、166℃、167℃、168℃、169℃或170℃。类似地，纯化的晶体CCI-779的X射线衍射(XRD)峰图典型地包含在2θ处的峰(面积强度大于大约25％±2θ的0.2)(peaksat 2θwith an area intensity of greater than about 25％±a 2θof 0.2)。例如，纯化的晶体CCI-779的XRD图在约7.7、9.0、11.4、12.6、13.3、15.0、15.4、16.2、66.5、34.8、43.7、31.4和58的2θ处典型地具有峰。
在一个实施方案中，本发明提供了纯化的晶体CCI-779，其具有DSC热谱图，热谱图具有大于大约165℃的吸热峰；和XRD峰图，其在大约7.7、9.0、11.4、12.6、13.3、15.0、15.4、16.2、66.5、34.8、43.7、31.4和58的2θ处具有峰。
在另一个实施方案中，本发明提供了纯化的晶体CCI-779，其包括小于大约0.6％wt/wt的苯基硼酸。
A.制备纯化的晶体CCI-779的方法
本发明还提供了制备纯化的晶体CCI-779的方法。本发明的方法有利地提供了纯化的晶体CCI-779的方法，不使用色谱法进行纯化。本方法还大规模地提供了纯化的晶体CCI-779。
在本发明方法中的第一步包括：将未纯化的CCI-779在第一溶剂中溶解。优选，CCI-779可以高度溶于第一溶剂中。典型地，第一溶剂是酮。在一个实施方案中，第一溶剂是丙酮、甲基乙基酮、二乙酮或甲基异丁基酮。在进一步实施方案中，第一溶剂是丙酮。在另一个实施方案中，第一溶剂是甲基乙基酮，还有其它的。然而，通过使用本发明的教导，本领域技术人员能够容易地选择用于本发明的合适的第一溶剂。一旦溶于第一溶剂中，典型地将溶液过滤，以除去任何固体粒子。
本文使用的术语“未纯化的CCI-779”或“粗品CCI-779”是指较小纯度和/或结晶形态的CCI-779。有许多制备未纯化的或粗品CCI-779的方法，包括US专利Nos.5,362,718和6,277,983，本文将其引入作为参考。或者，CCI-779可以商业购买(例如Wyeth)。未纯化的或粗品CCI-779可以是非微粉化或微粉化的，如US专利申请出版物No.US-2005-0152983-A1所述，本文将其引入作为参考。
然后从过滤的溶液中除去第一溶剂，典型地使用减压，任选在加热的存在下。本领域技术人员能够容易地调节除去第一溶剂的条件，或能够使用其它方法来除去第一溶剂。
一旦除去第一溶剂，典型地获得CCI-779泡沫体、固体或其组合。典型地，痕量的第一溶剂残留在残余CCI-779泡沫体、固体或其组合中。然而，获得的泡沫体、固体或其组合形式的CCI-779可能在其中没有任何第一溶剂。在一个实施方案中，CCI-779是非晶形的。在另一个实施方案中，CCI-779是部分晶体。
然后将除去第一溶剂之后所获得的CCI-779溶于第二溶剂中。优选，CCI-779在第二溶剂中比在第一溶剂中的溶解性低。将CCI-779溶于最小数量的第二溶剂中。术语“最小数量”是指能够溶解(dissolution)大部分CCI-779的第二溶剂的最小体积。或者，首先将CCI-779溶于较大数量的第二溶剂中，而后使用本领域技术人员已知的技术(包括减压)来减少溶液的体积。本领域技术人员也能够容易地判明何时溶液体积已经减少到可接受的数量。
适宜地，通过肉眼观察来确定CCI-779在第二溶剂中的溶解性。典型地，目视检查包含CCI-779和第二溶剂的溶液，以保证大部分CCI-779溶解。本领域技术人员能够容易地使用技术来实现CCI-779在第二溶剂中的进一步溶解。或者，利用分析装置例如混浊度探针或聚焦束反射系数测量(![]()
探针)来测定固体CCI-779的溶解性。在一个实施方案中，第二溶剂是醚。在另一个实施方案中，第二溶剂具有与乙醚的极性相似的极性。在进一步实施方案中，第二溶剂是乙醚。将CCI-779在第二溶剂中溶解之后，还任选将溶液过滤。
一旦溶解，测定第一溶剂(典型地是丙酮)在第二溶剂/CCI-779的溶液中的含量。优选，第一溶剂的含量小于大约4vol％，且更优选丙酮的含量小于大约3vol％。典型地，使用HPLC测定第一溶剂在第二溶剂中的含量。如果第一溶剂在溶液中的含量超过4vol％，使用减压除去第二溶剂，任选在加热的存在下，以重新形成固体CCI-779。用第二个等份的第二溶剂来处理固体CCI-779，并再次测定第一溶剂的含量。重复这些步骤，直到第一溶剂在CCI-779/第二溶剂的溶液中的含量小于4vol％为止。典型地，在达到可接受的第一溶剂含量之前，将第二溶剂至少除去一次。
除了测定丙酮含量之外，本发明还提供了测定纯化的CCI-779在第二溶剂中结晶之前的成核点的方法。本文使用的术语“成核”是指由CCI-779的第二溶剂例如醚的过饱和溶液自发形成晶体CCI-779。“成核点”，即成核开始的点，典型地利用聚焦束反射系数测量![]()
采测定，其中有许多![]()
仪器在本领域可得到，并且用于本发明中，包括![]()
D600L或S400![]()
系统。使用![]()
仪器可以确保CCI-779晶体产物的高结晶度和纯度。典型地，当溶液中形成的CCI-779粒子的弦(chord)数对于粒子大小为1至5微米的纯化的晶体CCI-779大于1500弦(chord)/秒时，达到成核点。
本文使用的术语“弦”是指通过粒子横截面的直线路径，并且是粒子长度的平均尺度。本领域技术人员还可以简单地将弦描述为对粒子宽度的测定。优选，本文使用的术语“弦”是指CCI-779结晶粒子。本文使用的术语“弦数”是指某一弦长或尺寸级分的粒子数目。
可以通过改变![]()
仪器测定期间的成核保持时间来调节成核点，直到达到所需要的弦数为止。如果在本发明中使用清除剂，“成核保持时间”是指加入清除剂之前CCI-779保持在第二溶剂中的时间。如果本发明方法省略了清除剂，“成核保持时间”是指加入反溶剂之前CCI-779保持在第二溶剂中的时间。优选通过检测如上所述的![]()
信号来测定成核点。
一旦第一溶剂在第二溶剂中达到所需含量且已经达到成核点，任选加入清除剂，以除去残余的苯基硼酸。本发明人已经发现，残余苯基硼酸可以在CCI-779的固体试样中降解，由此导致氧化杂质的形成，其可以引起CCI-779的分解，特别是在储存期间。优选，清除剂是戊二醇，并加入到包含第二溶剂和CCI-779的溶液中。
纯化的CCI-779的结晶作用可以在纯化期间的各个阶段开始，并可以在一个过程中与另一个过程不同。典型地，加入第二溶剂之后开始结晶。优选，结晶(i)在第二溶剂中测定第一溶剂期间开始，(ii)在测定成核点期间开始，或二者结合。
加入任选的清除剂之后，加入反溶剂，以获得固体纯化的晶体CCI-779或还没有在溶液中结晶的纯化晶体CCI-779。本文使用的术语“反溶剂”是指最低限度地或不能溶解纯化的晶体CCI-779的溶剂。如果在本方法中使用清除剂，将反溶剂加入到包含第二溶剂、CCI-779和清除剂的溶液中。如果本方法中不使用清除剂，将反溶剂加入到包含第二溶剂和CCI-779的溶液中。在一个实施方案中，反溶剂是烃，优选直链或支链饱和烃。典型地，烃具有大约6至大约10个碳原子。在一个实施方案中，除了别的以外烃是庚烷、2-甲基戊烷、正己烷和其组合。在另一个实施方案中，烃是庚烷。在另一个实施方案中，反溶剂是庚烷，并且进一步包括其它烃。
本发明人发现，纯化的晶体CCI-779的结晶度和收率受丙酮含量、诱导期和加入反溶剂的影响。具体地说，以低丙酮水平、长诱导期并且非线性加入反溶剂获得了高收率的高度结晶纯化的CCI-779。
本文使用的短语“诱导期”是指加入第一溶剂和起始加入反溶剂之间的一段时间。在一个实施方案中，诱导期大约为0.5至大约5小时。在又一个实施方案中，诱导期大约为1至3小时。然而，诱导期是非常可变的，并且取决于要求获得第一溶剂在第二溶剂中的可接受含量的时间量、和![]()
仪器测定期间调节成核时间所需要的时间量。
本文使用的术语“非线性的”是指反溶剂加入速度，该速度随时间而变化。优选，将反溶剂最初慢慢地加入到第二溶剂中，而后随着时间的推移提高加入速度。本发明人已经发现，如果反溶剂的初始加入太快，具有不良流速的CCI-779的少量针状粒子形成油状、细粉、差的结晶物质，或形成细粉非晶材料，由此表明初级成核。反溶剂的非线性加入还会产生形成晶体纯化的CCI-779，其具有一致的形貌和大小。在一个实施方案中，晶体纯化的CCI-779是以棒状结晶粒子形式制备的。在另一个实施方案中，晶体纯化的CCI-779包括长度大约10至大约100微米的粒子。
本文使用的术语“初级成核”是指没有形成CCI-779晶体粒子的CCI-779的沉淀。该术语不同于藉此形成晶体CCI-779的CCI-779的结晶作用。
优选，将反溶剂的流速归一化，并以反溶剂加入速度(L/hr)与粗品CCI-779量(kg)的1∶1比例表示。然而，本领域技术人员还能够容易地使用较低的流速。典型地，以大约2L/小时/千克粗品CCI-779的速度起始加入反溶剂。而后，提高反溶剂加入速度，优选提高至大约3L/小时/千克粗品CCI-779。可以保持这种提高的反溶剂加入速度，或此后升至更快的加入速度，例如大约11L/小时/千克粗品CCI-779。在一个实施方案中，在大约120至大约240分钟期间内加入反溶剂。在另一个实施方案中，在大约180分钟期间内加入反溶剂。在进一步实施方案中，以1L/小时/千克粗品CCI-779的速度起始加入反溶剂，由此在第二个小时内升至3L/小时/千克粗品CCI-779的速度，最后，在最后30分钟升至11L/小时/千克粗品CCI-779的速度。
使用本领域技术人员已知的技术收集纯化的晶体CCI-779，包括但不限于过滤、倾析、离心，还有其它的技术。一旦收集，任选将纯化的晶体CCI-779用反溶剂、第二溶剂或其组合洗涤一次或多次。在一个实施方案中，用醚和反溶剂洗涤纯化的晶体CCI-779。在另一个实施方案中，用乙醚和庚烷溶液洗涤纯化的晶体CCI-779。一旦收集和任选洗涤，使用本领域技术人员已知的技术干燥纯化的晶体CCI-779，任选使用如上关于未纯化CCI-779的所述微粉化技术进行微粉化。典型地，将按照本发明制备的纯化的结晶CCI-779微粉化，以制备小于大约30微米的粒子。
还可以通过重复本发明方法的步骤，将纯化的晶体CCI-779进一步纯化。
在一个实施例中，本发明提供了纯化CCI-779的方法，包括：(i)将CCI-779在酮中溶解；(ii)将步骤(i)的产物过滤；(iii)从步骤(ii)的产物中除去酮；(iv)将步骤(iii)的产物在醚中溶解；(v)测定步骤(iv)产物中的酮含量，其中如果酮含量大于4vol％，除去醚并重复步骤(iv)和(v)；(vi)利用聚焦束反射系数测量来测定步骤(iv)产物的成核点，调节成核保持时间，直到1至5微米的CCI-779粒子的弦数大于1500弦/秒为止；(vii)任选将戊二醇加入到步骤(vi)的产物中；(viii)将反溶剂加入到步骤(vii)的产物中；和(ix)收集纯化的晶体CCI-779，其中用所述纯化的CCI-779任选重复步骤(i)至(ix)和/或步骤(iv)至(ix)。
在另一个实施例中，本发明提供了纯化CCI-779的方法，包括：(i)将未纯化的CCI-779在丙酮中溶解；(ii)将步骤(i)的溶液过滤；(iii)从步骤(ii)的产物中除去丙酮；(iv)将步骤(iii)的产物在乙醚中溶解；(v)测定步骤(iv)产物中的丙酮含量，其中如果丙酮大于4vol％，除去乙醚并重复步骤(iv)和(v)；(vi)利用聚焦束反射系数测量来测定步骤(iv)产物的成核点，调节成核保持时间，直到1至5微米的CCI-779粒子的弦数大于1500弦/秒为止；(vii)任选将戊二醇加入到乙醚中；(viii)在120到240分钟期间内将庚烷加入到步骤(vii)的产物中；(ix)收集纯化的CCI-779；和(x)在大约25到大约50℃温度下，减压干燥纯化的CCI-779，其中步骤(iv)之后，步骤(vii)进行大约0.5到大约5小时，其中用所述纯化的CCI-779任选重复步骤(i)至(x)和/或(iv)至(ix)。
在进一步实施例中，本发明提供了检测CCI-779的结晶的方法，包括(i)将未纯化的CCI-779在第一溶剂中溶解；(ii)从步骤(i)的产物中除去第一溶剂；(iii)将步骤(ii)的产物在第二溶剂中溶解；(iv)测定步骤(iii)产物中的第一溶剂含量，其中如果第一溶剂的含量大于预定的溶剂含量，除去第二溶剂并重复步骤(ii)和(ii)；(v)利用聚焦束反射系数测量来测定CCI-779在第二溶剂中的成核点，调节成核保持时间，直到弦数相同或大于预定成核弦数为止。
B.包括纯化的晶体CCI-779的组合物
本发明还提供了组合物，优选药物组合物，其包括单独或与未纯化的CCI-779组合的纯化的晶体CCI-779。组合物典型地包括药学可接受的载体，但还可以包括其它合适组分。典型地，其它组分是惰性体，并不妨碍组合物所需组分的功能。由此，本发明组合物可以进一步包括其它助剂、糖浆剂、酏剂、稀释剂、粘合剂、润滑剂、表面活性剂、成粒剂、崩解剂、软化剂、金属螯合剂、pH值调节剂、表面活性剂、填充剂、崩解剂和其组合，还有其它的助剂。
助剂可以包括但不限于调味剂、着色剂、防腐剂和辅助抗氧化剂，辅助抗氧化剂可以包括维生素E、抗坏血酸、丁羟甲苯(BHT)和丁羟茴醚(BHA)。
粘合剂可以包括但不限于：聚乙烯吡咯烷酮，纤维素，甲基纤维素，羟甲基纤维素，羧甲纤维素钙，羧甲基纤维素钠，羟丙基纤维素，羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯，非结晶的纤维素，聚丙基吡咯烷酮，聚乙烯吡咯烷酮(聚维酮，PVP)，凝胶，阿拉伯树胶和阿拉伯胶，聚乙二醇，淀粉，糖例如蔗糖、高岭土、葡萄糖和乳糖，胆固醇，黄芪胶，硬脂酸，明胶，酪蛋白，卵磷脂(磷脂)，十六醇十八醇混合物，鲸蜡醇，鲸蜡基酯蜡，葡萄糖结合剂，糊精，甘油单油酸酯，单硬脂酸甘油酯，甘油基棕榈酸硬脂酸酯，聚氧乙烯烷基醚，聚氧乙烯蓖麻油衍生物，聚氧乙烯硬脂酸酯，聚乙烯醇，和明胶，还有其它的。在一个实施方案中，粘合剂是聚乙烯吡咯烷酮。
润滑剂可以包括轻无水硅酸、滑石粉、硬脂酸、十二烷基硫酸钠、硬脂酸镁和硬脂酰富马酸钠，还有其它的。在一个实施方案中，润滑剂是硬脂酸镁。
成粒剂可以包括但不限于：二氧化硅，淀粉，碳酸钙，果胶，交聚维酮，和聚维酮，还有其它的。
崩解剂可以包括淀粉，羧甲纤维素，取代的羟丙基纤维素，碳酸氢钠，磷酸钙，柠檬酸钙，淀粉羟基乙酸钠，预糊化淀粉或交聚维酮，还有其它的。
软化剂可以包括但不限于：十八醇，貂油，鲸蜡醇，油醇，异丙基月桂酸酯，聚乙二醇，橄榄油，凡士林，棕榈酸，油酸，和十四烷基豆蔻酸酯。
表面活性剂可以包括聚山梨酸酯，脱水山梨醇酯，泊洛沙姆或十二烷基硫酸钠。在一个实施方案中，表面活性剂是十二烷基硫酸钠。
金属螯合剂可以包括生理学可接受的螯合剂，包括依地酸、苹果酸或富马酸。在一个实施方案中，金属螯合剂是依地酸。
还可以使用pH值调节剂，以调节包含CCI-779的溶液的pH值至大约4至大约6。在一个实施方案中，将包含CCI-779的溶液的pH值调节至大约pH值4.6。pH值调节剂可以包括生理学可接受的试剂，包括枸橼酸、抗坏血酸、富马酸或苹果酸和其盐。在一个实施方案中，pH值调节剂是枸橼酸。
可以在本发明组合物中使用的额外填充剂包括甘露糖醇、磷酸钙、预糊化淀粉或蔗糖。
C.使用纯化的晶体CCI-779的方法
本发明进一步提供了给患者递送纯化CCI-779的方法，其中该方法包括给予按照本发明的纯化CCI-779。
纯化的晶体CCI-779的剂量要求可以根据所存在症状的严重程度和所治疗具体患者来改变。治疗可以从小于纯化的晶体CCI-779的最佳剂量的小剂量开始。此后，增加剂量，直到在这种情况下达到最佳效果为止。根据所治疗个体患者的感受，执行医师可以确定精确剂量。通常，最优选以通常得到有效效果而不引起任何无法接受的伤害或有害副作用的浓度来给予纯化的晶体CCI-779。例如，纯化的晶体CCI-779的有效量通常是例如大约0.1至大约50毫克，大约10毫克至大约30毫克，或大约0.5至大约2毫克。
因此，纯化的晶体CCI-779可以用作抗肿瘤剂，尤其是用于治疗肉瘤和恶性肿瘤、星形细胞瘤、前列腺癌症、乳腺癌、结肠癌、小细胞肺癌、卵巢癌、中枢神经系统癌症、黑素瘤、神经胶质瘤、恶性胶质瘤和成人T细胞白血病/淋巴瘤。纯化的晶体CCI-779还用于治疗或抑制移植排斥，例如肾脏、心脏、肝脏、肺、骨髓、胰腺(胰岛细胞)、角膜、小肠和皮肤异源移植和心脏瓣膜异种移植；移植物抗宿主疾病；自身免疫疾病例如狼疮、类风湿性关节炎、糖尿病、重症肌无力和多发性脑硬化；用于治疗炎症疾病，例如牛皮癣、皮炎、湿疹、皮脂溢、炎症性肠病、肺部炎症(包括哮喘，慢性阻塞性肺病，肺气肿，急性呼吸困难综合征，支气管炎等等)和眼睛葡萄膜炎；霉菌感染；高增殖血管疾病，例如再狭窄、移植血管动脉粥样硬化、心血管疾病、大脑血管病、周围性血管疾病例如冠状动脉病，脑血管疾病，动脉硬化，动脉粥样硬化，非粥样的动脉硬化，或由引起免疫介导的血管伤害、中风或多发性脑梗塞性痴呆的细胞活动造成的血管壁损伤。
可以使用药学有效量的纯化的晶体CCI-779，将纯化的晶体CCI-779配制成适合于所需要递送途径的任何形式。例如，纯化的晶体CCI-779可以通过下列途径递送：例如口服，表皮，透皮，支气管内，鼻内，静脉内，肌注，皮下，肠胃外，腹腔内，鼻内，阴道，直肠，舌下，颅内，硬膜外，气管内或通过持续释放递送。优选口服递送。
例如，可以配制口服给予的纯化的晶体CCI-779，以片剂、胶囊、微胶囊、可分散性粉剂、颗粒或悬浮液的形式，其含有例如从大约0.05至5％悬浮剂，包含例如从大约10至50％糖的糖浆剂，和包含例如从大约20至50％乙醇的酏剂，等等。根据容易制备和给予的观点，优选的药物组合物是固体组合物，特别是片剂和硬填充的或充液胶囊。
还可以胃肠外或腹膜内给予纯化的晶体CCI-779。游离碱形式的纯化的晶体CCI-779或药理学可接受盐的溶液或悬浮液，可以在适宜与表面活性剂例如羟丙基纤维素混合的水中制备。分散体还可以在甘油、液体、聚乙二醇和其混合物(在油中)中制备。在普通储存和使用条件下，这些制剂含有防腐剂，以阻止微生物的生长。典型地，这种无菌可注射溶液或悬浮液在等渗介质中含有从大约0.05至5％的悬浮剂。这种药物制剂可以在与载体的组合中含有例如从大约25至大约90％活性组分，更通常在大约5％和60％重量之间。
在另一个实施方案中，以无菌可注射溶液、悬浮液、分散体和粉末(其是容易从注射器离开的流体)形式，静脉内、肌肉内、皮下、胃肠外和腹膜内递送纯化的晶体CCI-779。这种可注射的组合物是无菌的，在制备和储存条件下稳定的，和无微生物例如细菌和真菌沾染操作的。
载体可以是含有例如水、醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇)、油类、和其混合物的溶剂或分散介质。优选液体载体是水。在一个实施方案中，油是植物油。任选地，液体载体包含悬浮剂。在另一个实施方案中，液体载体是等渗介质，并且包含0.05至大约5％悬浮剂。
在进一步实施方案中，以常规栓剂形式直肠递送纯化的晶体CCI-779。
在另一个实施方案中，以常规栓剂、乳膏、凝胶、环形物或涂渍子宫内节育器(IUD)的形式阴道递送纯化的晶体CCI-779。
在又一个实施方案中，以气溶胶形式鼻内或支气管内递送纯化的晶体CCI-779。
在进一步实施方案中，透皮递送纯化的晶体CCI-779，或通过使用包含纯化的晶体CCI-779和任选载体的透皮膜片持续释放，载体对于纯化的晶体CCI-779是惰性的，对于皮肤是非毒性的，并使递送的纯化的晶体CCI-779系统的吸收入血液中。这种载体可以是乳膏、油膏、糊剂、凝胶或闭合装置。乳膏和油膏可以是粘性液体或半固体乳剂。糊剂包括分散在石油产品或亲水性石油产品中的吸附粉末。进一步的，可以使用许多闭合装置，将纯化的晶体CCI-779释放入血液中，并包括半透膜(覆盖含有活性试剂的储库)或包含反应性试剂的基质。
为了避免患者需要每天使用药物，使用持续递送装置可以是合乎需要的。本文使用的术语“持续递送”指的是延迟活性剂(即晶体CCI-779)的释放，直到放置在递送环境中之后，而后持续释放药剂。许多持续递送装置在本领域是已知的，并且包括水凝胶(US专利Nos.5,266,325；4,959,217；5,292,515)，渗透泵(US专利Nos.4,295,987和5,273,752和欧洲专利No.314,206，还有其它的)；疏水性的膜物质，例如亚乙基甲基丙烯酸酯(EMA)和亚乙基乙烯乙酸酯(EVA)；生物再吸收聚合物系统(国际专利公开说明书No.WO 98/44964和US专利Nos.5,756,127和5,854,388)；由例如聚酯、聚酐或乳酸/羟基乙酸共聚物组成的其它可生物再吸收植入装置(US专利No.5,817,343)。对于这种持续递送装置中使用，可以按照本文所描述的形式配制纯化的晶体CCI-779。参见，US专利Nos.3,845,770；3,916,899；3,536,809；3,598,123；和4,008,719。
纯化的晶体CCI-779可以典型地形成为递送给患者的合适剂量单元。合适剂量单元包括口服剂量单元，例如可直接压缩的片剂，胶囊，粉末，悬浮液，微胶囊，可分散性粉剂，颗粒，悬浮液，糖浆剂，酏剂和气溶胶。使用本文所描述方法和本领域技术人员已知的那些方法，可以容易地制备这些剂量单元。
在一个实施方案中，当口服给予时，在本发明中使用的胶囊包括羟丙基甲基纤维素、羟丙甲纤维素胶囊或硬壳明胶胶囊。任选地将含有纯化的晶体CCI-779的本发明的片剂或锭剂进行涂膜。合适的涂膜对于本领域技术人员来说是已知的。例如，涂膜可以选自聚合物，例如羟丙基甲基纤维素、乙基纤维素、聚乙烯醇和其组合。
药学有效量的纯化的晶体CCI-779可以根据所递送组合物的其它组分、递送模式、所治疗病症的严重程度、患者的因素和体重、和在组合物中使用的任何其它活性组分来变化。还可以调节剂量方案，以提供最适宜的治疗响应。每天可以递送若干分割剂量，例如一天2至4次分割剂量，或可以递送单一剂量。然而，可以按照治疗环境急迫需要所示来按比例降低或增加剂量。在一个实施方案中，递送是以每天、每周或每月为基础。在另一个实施方案中，递送是每天递送。然而，基于周期性的递送，可以降低或增加日剂量。
当用于治疗肿瘤病、恶性肿瘤和腺癌时，可以与一或多种本领域技术人员可容易选择的化学治疗剂结合给予纯化的晶体CCI-779。
D.包含纯化CCI-779的试剂盒
本发明还提供了包含纯化的晶体CCI-779的试剂盒或包装。本发明的试剂盒可以包括纯化的晶体CCI-779或组合较低纯度形式和正如以上所讨论的适合于给予哺乳动物患者的载体。
优选，在递送的各个具体阶段，纯化的晶体CCI-779的日剂量保持固定。试剂盒可以进一步包括给予纯化的晶体CCI-779的说明书。
提供下列实施例来举例说明本发明，并且不限制其范围。本领域技术人员可以理解，虽然在下面实施例中列出了具体试剂和条件，但可以进行改进，这种改进被本发明的精神和范围所包括。
实施例
实施例1-制备纯化的晶体CCI-779的常规方法
该实施例提供了由粗品CCI-779来制备纯化的晶体CCI-779的方法。
在配备有外加热器/冷却器、真空蒸馏设备、放置反应温度探针的1个隔板、具有4个斜叶涡轮叶片的顶置搅拌器的3L夹套反应器(Chemglass)中，将粗品CCI-779(200克，19.4摩尔)溶于丙酮(1.61L)中。反应器还配备![]()
D600L聚焦束反射系数测量系统(![]()
系统)，其使用配备有蓝宝石(sapphire)窗口的18”hastealloy探针(0.7”OD)(Mettler Toledo Inc)。然后使用0.45微米聚丙烯滤芯进行过滤，将溶液澄清。从得到的溶液中真空除去丙酮，获得泡沫体。加入乙醚(1.27L)，继续蒸馏，直到丙酮在得到的溶液中的含量小于4vol％为止。搅拌溶液，直到获得浆液为止。
利用![]()
仪器检测成核过程，调节保持时间，以实现稳定成核，直到大约1至大约5微米的粒子的弦数大于约1500弦/秒为止。额外搅拌浆液一段时间，直到1至5微米粒子的弦数表明自发成核活动结束为止。在20-25℃，将浆液用2-甲基-2，4-戊二醇(0.13L)处理，以清除残余的苯基硼酸。使用可编程活塞泵(Stepdos)(其用来控制反溶剂以分段非线性加入速率加入)，将庚烷(3.14L)加入到浆液中。用3小时控制加入庚烷加以稀释后，过滤浆液，得到大量纯化的晶体CCI-779的白色晶体(起始mp＝169℃)，收率84％，总杂质1.25％，其中0.54％杂质是氧化杂质。
实施例2-使用较慢过滤制备纯化的晶体CCI-779
使用实施例1中提供的说明来制备纯化的晶体CCI-779，只不过使用中号磨砂烧结(fritted)玻璃漏斗(75mm ID)来过滤CCI-779的丙酮溶液。过滤缓慢，使利用2个并列的漏斗成为必需。过滤需要的总时间是2.1小时。
然后如实施例1所述除去丙酮。非晶形CCI-779的粘度增加，导致搅拌器减速。将非晶形CCI-779在真空中保持过夜，同时关掉搅拌器。
如实施例1所述，加入乙醚之后，其中溶解花费大约11分钟，检测CCI-779的成核。然后取出溶液样品，进行丙酮含量分析，测定含量大约为3.2vol％丙酮。出现晶核的诱导期是54分钟(参见图1)。
成核之后，按照![]()
仪器所注明的方式将批料老化34分钟，获得稳定的弦数。如实施例1所述，加入戊二醇和庚烷。洗涤所分离的纯化的晶体CCI-779，并在40℃真空干燥48小时。获得176.3克纯化的晶体CCI-779的收率(87.6％)。参见表1的结晶后直接获得的纯化CCI-779和2周和1个月之后在变化条件下测试的样品的HPLC数据。
表1
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实施例3-用较快过滤制备纯化的晶体CCI-779
该实施例是使用与实施例2所述的相同方案进行的。然而，过滤粗品CCI-779的丙酮溶液是使用中号磨砂烧结漏斗、在30分钟内完成的。蒸馏丙酮之后，在减压条件下将批料以非晶形泡沫体/油的形式保持2小时。然后将乙醚加入到泡沫体/油中，抽出乙醚溶液用于丙酮含量(8.5vol％)。然后蒸馏除去乙醚(包括丙酮)，获得非晶形泡沫体。将泡沫体减压保持30分钟，再次加入乙醚。再次检测乙醚的丙酮接触，测定小于3.6vol％丙酮。按照实施例2的方式继续结晶。成核诱导期，即获得大于大约1500弦/秒的大约1至大约5微米粒子的粒子弦数所需要的时间，是26分钟。成核之后，额外搅拌浆液一段时间，以确保成核的稳定性。按照上面列出的进行分离和干燥之后，获得175.1克纯化的晶体CCI-779的最终收率(87.3％)。参见表2，结晶之后马上获得的纯化的晶体CCI-779和2周和1个月之后在变化条件下测试的样品的HPLC数据。
表2
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实施例4-用控制庚烷加入法制备纯化的晶体CCI-779
该实施例提供了提高结晶度的半间歇结晶法。该方法是在带有精确温度控制、顶置搅拌和能够实施控制溶剂注入的反应器中进行的。为了最佳控制，反应器配备有使用“细粉”电子技术测定1-500微米范围弦长的![]()
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探针。
将丙酮(5.7L)加入到粗品CCI-779(1千克)中。在22℃(夹套)，以每分钟高转数搅拌丙酮溶液，直到获得澄清溶液为止(利用![]()
系统粒子计数进行检测)。将澄清溶液通过0.45微米在线滤器进行过滤。将过滤器用丙酮(2L)洗涤，并将丙酮洗液加入到滤液中。在大约5-20℃温度下，减压蒸馏除去滤液中的丙酮，直到获得泡沫体为止。减压保持泡沫体大约2小时。
将乙醚(3.4L)加入到干泡沫中，在22℃搅拌溶液。10分钟之后，过滤收集固体，并利用气相色谱法(GC)检测乙醚溶液，以检测残留在乙醚中的丙酮的量。如果丙酮含量大于乙醚的大约3vol％，重复乙醚洗涤。
将乙醚洗涤的样品再次与乙醚合并，混合30分钟，使用![]()
仪器测定粒子数。证实粒子数在1-5微米范围大于1500弦/秒之后，将浆液额外混合30分钟。也进行肉眼观察，确定浆液存在。
然后在至少15分钟期间内将戊二醇溶液(0.7L戊二醇，在0.4L乙醚中)加入到乙醚浆液中。在大约22℃温度下，将溶液混合60分钟，或直到![]()
系统粒子数稳定为止。在大约150分钟期间内，使用下列方式将庚烷(10.7L)加入到溶液中，同时保持大约22℃的温度：
1.在第一个60分钟内加入第一个2L；
2.在第二个60分钟内加入3L；和
3.在下一个30分钟内加入5.7L。
然后在大约22℃温度下，将浆液混合4小时，过滤浆液，用醚/庚烷(0.9/4.8L)的溶剂混合物洗涤固体3次。在大约40℃温度下减压干燥固体。
在说明书中引用的全部出版物在本文中作为参考结合于本文中。尽管已经参考具体优选实施方案描述了本发明，应理解可以在不背离本发明精神的条件下进行改进。这样的改进意图落入所附权利要求的范围。