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1、(10)申请公布号 CN 103073544 A (43)申请公布日 2013.05.01 CN 103073544 A *CN103073544A* (21)申请号 201110327305.X (22)申请日 2011.10.25 C07D 471/04(2006.01) (71)申请人 中国科学院兰州化学物理研究所 地址 730000 甘肃省兰州市城关区天水中路 18 号 (72)发明人 邸多隆 黄新异 陈小芬 (74)专利代理机构 兰州中科华西专利代理有限 公司 62002 代理人 方晓佳 (54) 发明名称 一种逆流色谱法分离苦马豆素的方法 (57) 摘要 本发明公开了一种逆流色谱法。
2、分离苦马豆素 的方法。 本发明以甲基叔丁基醚、 正丁醇以及水混 合后静置分层， 构成逆流色谱固定相、 流动相的溶 剂体系 ； 将固定相以较大流速泵入逆流色谱仪分 离柱中 ； 待柱中充满固定相后， 开机， 使逆流色谱 仪主机以设定转速转动， 然后以一定流速将流动 相泵入分离柱中 ； 待两相在分离柱中达到动态平 衡后， 通过进样阀进样 ； 自动馏分收集器收集馏 分 ； 用薄板层析和高效液相色谱检测， 将含有苦 马豆素成分的馏分合并后回收溶剂， 重结晶得到 纯度大于 90的苦马豆素本方法简便快捷， 分离 效果好， 制备量大， 样品损失小， 分离成本低， 产品 纯度高， 整个分离方法适合于工业化生产。。
3、 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 3 页 附图 1 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书3页 附图1页 (10)申请公布号 CN 103073544 A CN 103073544 A *CN103073544A* 1/1 页 2 1. 一种逆流色谱法分离苦马豆素的方法， 其特征在于该方法步骤如下 ： A 分离溶剂系统的选择由甲基叔丁基醚、 正丁醇以及水组成的溶剂体系混合， 振摇后静 置分层， 将上、 下相分开 ； B 将两相溶剂系统的一相作为固定相， 另一相作为流动相 ； 首先将固定相充满逆流色 谱仪的分离柱， 然后开动逆流。
4、色谱仪主机， 达到设定转速后， 向其中泵入流动相， 待两相在 分离柱中达到动态平衡后， 通过进样阀将甘肃棘豆总生物碱注入， 自动馏分收集器接受馏 分 ； C 将收集的馏分通过薄板层析和高效液相色谱检测， 合并含有苦马豆素的馏分， 回收溶 剂后重结晶， 得到苦马豆素。 2.如权利要求1所述的方法， 其特征在于 ： A步骤中所用的溶剂体系是指以甲基叔丁基 醚、 正丁醇和水按照任意体积比混合。 3. 如权利要求 1 所述的方法， 其特征在于 ： A 步骤中所用溶剂体系的 pH 值为 7-14。 4. 如权利要求 1 所述的方法， 其特征在于 ： B 步骤中可以以溶剂体系中的上相为固定 相， 下相为流。
5、动相 ； 也可以以溶剂体系中下相为固定相， 上相为流动相。 5. 如权利要求 1 所述的方法， 其特征在于 ： B 步骤中逆流色谱仪可以采用正转模式， 也 可以采用反转模式。 6.如权利要求1所述的方法， 其特征在于 ： C步骤中样品检测可以采用逆流色谱仪自带 检测器， 也可以使用高效液相色谱， 薄板层析或其他检测手段检测。 权 利 要 求 书 CN 103073544 A 2 1/3 页 3 一种逆流色谱法分离苦马豆素的方法 技术领域 0001 本发明属于天然产物化学领域， 涉及一种应用逆流色谱法分离苦马豆素的方法。 背景技术 0002 苦马豆素 (Swainsonine， SW) 是一种大。
6、极性的吲哚里西啶类生物碱， 研究表明， 苦马豆素不但具有抑制肿瘤细胞生长和转移的作用， 还能够刺激机体骨髓细胞的增殖， 增 强机体免疫力 ( 路浩， 等 . 苦马豆素抗肿瘤作用研究进展， 动物医学进展， 2009， 30(9) ： 87-90)。所以近年来苦马豆素作为一种崭新的抗癌药物得到了国内外研究人员的关注， 在 国外， 对苦马豆素的研究已经进入治疗肿瘤的临床研究阶段， 而国内对其抗肿瘤活性的研 究尚处于起步阶段。 0003 由于苦马豆素所具有的特殊的抗肿瘤活性和免疫调节的双向作用， 使其具有潜在 的抗肿瘤药用价值和广阔的应用前景， 因此目前对苦马豆素提取分离方法的研究也日趋活 跃。据文献。
7、报道， 目前用于苦马豆素分离的方法主要为硅胶柱层析法。但柱层析方法分离 时间长， 样品有不可逆吸附， 回收率低， 分离效果差等不足。高速逆流色谱技术是上个世纪 80 年代出现的一种基于液 - 液分配色谱的分离新技术。由于它没有固体载体， 所以避免了 样品中目标化合物在固体载体上的不可逆吸附， 样品回收率高， 同时还具有操作简便， 分离 量大， 分离效率高以及重现性好等优点， 便于工业化放大生产， 已被广泛用于生物、 医药、 天 然产物、 环境等各个领域中的分离与制备中。 0004 近年来， 国内外学者对苦马豆素的不同提取纯化方法进行了有益的探索， 中国专 利200710017844.7(一种从。
8、疯草中提取苦马豆素的新方法)公开了一种从疯草中提取分离 苦马豆素的方法， 即用溶剂反复萃取后得到苦马豆素粗品， 然后用甲醇溶解挥干后升华得 到苦马豆素单体化合物。专利 200710017542.X( 连续柱层析法提纯苦马豆素的工艺 ) 公开 了一种应用连续柱层析法提取苦马豆素的工艺。中国专利 02114590.3( 疯草中苦马豆素的 提纯工艺 ) 公开了一种疯草中苦马豆素的提纯工艺， 首先采用阳离子交换法提取出大极性 生物碱粗品， 再用碱性氯仿抽提， 抽提部分经硅胶柱层析分离得到苦马豆素粗品， 最后分步 升华获得苦马豆素纯品。中国专利 200610043120.5( 绿僵菌发酵提纯苦马豆素的工。
9、艺 ) 公 开了一种绿僵菌发酵提纯苦马豆素的工艺， 即通过生物发酵工程培养， 获得含苦马豆素较 高的菌丝体和发酵液， 采用超声提取、 溶剂萃取、 薄层色谱、 D101 树脂、 硅胶柱层析及梯度升 华等技术， 从菌丝体和发酵液中分离提纯得到苦马豆素单体化合物。现有文献中未见有应 用逆流色谱法分离苦马豆素单体化合物的报道， 因此本发明公开一种应用逆流色谱技术分 离甘肃棘豆总生物碱提取物中苦马豆素单体化合物的方法。 发明内容 0005 针对上述现有技术中存在的缺陷和不足， 本发明的目的在于提供一种利用逆流色 谱技术分离高纯度苦马豆素的方法。 0006 本发明实现上述目的的技术方案如下 ： 说 明 书。
10、 CN 103073544 A 3 2/3 页 4 0007 原料 ： 甘肃棘豆总生物碱。 0008 所述的甘肃棘豆总生物碱， 系参考专利从甘肃棘豆中提取总生物碱提取物的制备 工艺 ( 申请号 ： 200910117752.5) 获得。 0009 分离设备 ： 逆流色谱仪。 0010 所述的分离设备逆流色谱仪， 根据所需目标分离量的不同， 可以选择分析型、 半制 备型和制备型逆流色谱仪。 0011 逆流色谱法苦马豆素单体的方法， 以甲基叔丁基醚、 正丁醇以及水混合后静置分 层， 构成逆流色谱固定相、 流动相的溶剂体系 ； 将固定相以较大流速泵入逆流色谱仪分离柱 中 ； 待柱中充满固定相后， 开。
11、机， 使逆流色谱仪主机以设定转速转动， 然后以一定流速将流 动相泵入分离柱中 ； 待两相在分离柱中达到动态平衡后， 通过进样阀进样 ； 自动馏分收集 器收集馏分 ； 用薄板层析和高效液相色谱检测， 将含有苦马豆素成分的馏分合并后回收溶 剂， 重结晶得到苦马豆素。 0012 一种逆流色谱法分离苦马豆素的方法， 其特征在于该方法步骤如下 ： 0013 A 分离溶剂系统的选择由甲基叔丁基醚、 正丁醇以及水组成的溶剂体系混合， 振摇 后静置分层， 将上、 下相分开 ； 0014 B 将两相溶剂系统的一相作为固定相， 另一相作为流动相 ； 首先将固定相充满逆 流色谱仪的分离柱， 然后开动逆流色谱仪主机，。
12、 达到设定转速后， 向其中泵入流动相， 待两 相在分离柱中达到动态平衡后， 通过进样阀将甘肃棘豆总生物碱注入， 自动馏分收集器接 受馏分 ； 0015 C 将收集的馏分通过薄板层析和高效液相色谱检测， 合并含有苦马豆素的馏分， 回 收溶剂后重结晶， 得到苦马豆素。 0016 本发明分离得到的苦马豆素为白色晶体， 纯度 90。 0017 在 A 步骤中， 所用的溶剂体系是指以甲基叔丁基醚、 正丁醇和水按照任意体积比 混合。 0018 在 A 步骤中， 所用溶剂体系的 pH 值为 7-14。 0019 在 B 步骤中， 可以以溶剂体系中的上相为固定相， 下相为流动相 ； 也可以以溶剂体 系中下相为。
13、固定相， 上相为流动相。 0020 在 B 步骤中， 逆流色谱仪可以采用正转模式， 也可以采用反转模式。 0021 在 C 步骤中， 样品检测可以采用逆流色谱仪自带检测器， 也可以使用高效液相色 谱， 薄板层析或其他检测手段检测。 0022 本发明优点为分离成本低， 制备过程安全， 并且分离过程能够连续进行， 操作简 单， 苦马豆素产品纯度可以达到 90以上。与柱层析等方法比较， 它不使用固态的载体， 因 此不存在固体载体造成的样品不可逆吸附和损耗， 分离效率高， 整个分离工艺适合于工业 化生产， 能够最大限度的利用原料， 降低生产成本， 是一种高效快捷的从甘肃棘豆总生物碱 提取物中分离苦马豆。
14、素的方法。 附图说明 0023 图 1 为甘肃棘豆总生物碱提取物品高效液相色谱图， 从图中可以看出， 总生物碱 提取物中除了含有苦马豆素外还含有大量其他杂质化合物。 说 明 书 CN 103073544 A 4 3/3 页 5 0024 图 2 为逆流色谱分离苦马豆素单体高效液相色谱图， 从图中可以看出， 分离得到 的苦马豆素产品纯度能到 90以上。 具体实施方式 0025 下面是本发明的实施例， 本发明包括但不仅限于实施例。实施例 1 ： 0026 高速逆流色谱法分离甘肃棘豆总生物碱提取物中的苦马豆素单体。 0027 1. 样品 ： 甘肃棘豆总生物碱， 参考专利从甘肃棘豆中提取总生物碱提取物。
15、的制备 工艺 ( 申请号 ： 200910117752.5) 从甘肃棘豆中提取得到。 0028 2. 仪器 ： TBE-300B 逆流色谱仪， 中国上海同田生物技术有限公司。 0029 3. 制备方法 ： 将甲基叔丁基醚正丁醇水按照 1 3 4(v v) 的比例充分 混合均匀， 滴加氨水调整 pH 在 9 10 后放置在分液漏斗中静置分层。将上、 下相分别放出 后超声 20min 脱气， 以上相为固定相， 下相为流动相。首先将固定相泵入逆流色谱仪螺旋管 中， 流速 20mL/min， 待螺旋管完全充满固定相后， 开启逆流色谱仪主机， 缓慢调整螺旋管转 速至900r/min， 同时以1mL/mi。
16、n的流速泵入流动相。 当螺旋管尾端流出流动相， 系统达到平 衡， 将400mg前述甘肃棘豆总生物碱样品溶解在20mL上、 下相的混合溶液中， 通过进样阀注 入螺旋管中， 设置恒温水浴为 25， 紫外检测器检测波长为 254nm， 自动馏分收集器接样， 4mL 为一份， HPLC 检测， 合并含有苦马豆素的馏分， 减压浓缩合并得到苦马豆素提取物。将 苦马豆素提取物用氯仿 - 甲醇重结晶得到白色晶体， 经过核磁共振、 质谱鉴定即为苦马豆 素， 测定纯度 90。 0030 实施例 2 ： 0031 1. 样品 ： 甘肃棘豆总生物碱， 参考专利从甘肃棘豆中提取总生物碱提取物的制备 工艺 ( 申请号 ：。
17、 200910117752.5) 从甘肃棘豆中提取得到。 0032 2. 仪器 ： DE HPCCC Spectrum 逆流色谱仪， 英国 DE 公司。 0033 3.制备方法 ： 甲基叔丁基醚正丁醇水按照134(vv)的比例充分混合 均匀， 向其中滴加氨水调整 pH 在 9 10 后放置在分液漏斗中静置过夜。将上、 下相分别放 出后超声 20min 脱气， 以上相为固定相， 下相为流动相。首先将固定相泵入逆流色谱仪螺旋 管中， 流速 6mL/min， 待螺旋管完全充满固定相后， 开启逆流色谱仪主机， 缓慢调整螺旋管转 速至 1500r/min， 同时以 6mL/min 的流速泵入流动相。当系统达到平衡， 将 150mg 前述甘肃 棘豆总生物碱样品溶解在 6mL 上、 下相的混合溶液中， 通过进样阀注入螺旋管中， 设置仪器 温度为30。 自动馏分收集器接样， 1mL为一份， 经HPLC检测， 合并含有苦马豆素的馏分， 减 压浓缩后得到苦马豆素提取物， 将苦马豆素提取物用氯仿 - 甲醇重结晶得到白色晶体。经 过核磁共振、 质谱鉴定即为苦马豆素， 测定纯度 90。 说 明 书 CN 103073544 A 5 1/1 页 6 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 103073544 A 6 。