复合药物组合物以及对神经退行性疾病相关的疾病或病症进行治疗的方法.pdf

本发明涉及复合药物组合物，所述复合药物组合物包含活性强化形式的抗γ干扰素抗体和活性强化形式的抗S-100蛋白抗体；以及对多发性硬化症和其它神经退行性疾病、以及与神经感染相关的疾病或病症进行治疗的方法。

权利要求书一种复合药物组合物，所述复合药物组合物包含：a）活性强化形式的抗γ干扰素抗体、以及b）活性强化形式的抗S‑100蛋白抗体。
如权利要求1所述的复合药物组合物，其中，所述活性强化形式的抗γ干扰素抗体针对的是具有SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2的整个γ干扰素。
如权利要求1所述的复合药物组合物，其中，所述活性强化形式的抗γ干扰素抗体针对的是具有下述序列的γ干扰素片段，所述序列选自于由SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12和SEQ ID NO.13所组成的组。
如权利要求1所述的复合药物组合物，其中，所述活性强化形式的抗S‑100蛋白抗体针对的是整个牛S‑100蛋白。
如权利要求1所述的复合药物组合物，其中，所述活性强化形式的抗S‑100蛋白抗体针对的是具有SEQ ID NO.14的整个S‑100蛋白。
如权利要求1所述的复合药物组合物，其中，所述活性强化形式的抗S‑100蛋白抗体针对的是具有SEQ ID NO.17的整个S‑100蛋白。
如权利要求1所述的复合药物组合物，其中，所述活性强化形式的抗γ干扰素抗体处于浸渍至固态载体上的C12、C30和C50顺势疗法稀释液的混合物形式，所述活性强化形式的抗S‑100蛋白抗体处于随后浸渍至所述固态载体上的C12、C30和C50顺势疗法稀释液的混合物形式。
如权利要求1所述的复合药物组合物，其中，所述活性强化形式的抗γ干扰素抗体处于浸渍至固态载体上的C12、C30和C200顺势疗法稀释液的混合物形式，所述活性强化形式的抗S‑100蛋白抗体处于随后浸渍至所述固态载体上的C12、C30和C200顺势疗法稀释液的混合物形式。
如权利要求1所述的复合药物组合物，其中，所述活性强化形式的抗S‑100蛋白抗体处于浸渍至固态载体上的C12、C30和C50顺势疗法稀释液的混合物形式，所述活性强化形式的抗γ干扰素抗体处于随后浸渍至所述固态载体上的C12、C30和C50顺势疗法稀释液的混合物形式。
如权利要求1所述的复合药物组合物，其中，所述活性强化形式的抗S‑100蛋白抗体处于浸渍至固态载体上的C12、C30和C200顺势疗法稀释液的混合物形式，所述活性强化形式的抗γ干扰素抗体处于随后浸渍至所述固态载体上的C12、C30和C200顺势疗法稀释液的混合物形式。
如权利要求1所述的复合药物组合物，其中，所述活性强化形式的抗γ干扰素抗体为单克隆抗体、多克隆抗体或天然抗体。
如权利要求11所述的复合药物组合物，其中，所述活性强化形式的抗γ干扰素抗体为多克隆抗体。
如权利要求1所述的复合药物组合物，其中，所述活性强化形式的抗γ干扰素抗体通过连续的百倍稀释、且每次稀释时均伴以振荡而制备。
如权利要求1所述的复合药物组合物，其中，所述活性强化形式的抗S‑100蛋白抗体为单克隆抗体、多克隆抗体或天然抗体。
如权利要求14所述的复合药物组合物，其中，所述活性强化形式的抗S‑100蛋白抗体为多克隆抗体。
如权利要求1所述的复合药物组合物，其中，所述活性强化形式的抗S‑100蛋白抗体通过连续的百倍稀释、且每次稀释时均伴以振荡而制备。
一种对神经退行性疾病进行治疗的方法，所述方法包括向有需要的患者基本上同时给予：a）活性强化形式的抗γ干扰素抗体、以及b）活性强化形式的抗S‑100蛋白抗体。
如权利要求17所述的方法，其中，所述神经退行性疾病为多发性硬化症。
如权利要求17或18所述的方法，其中，所述活性强化形式的抗γ干扰素抗体和所述活性强化形式的抗S‑100蛋白抗体以复合药物组合物的形式给药。
一种在患有多发性硬化症的患者中降低复发出现频率的方法，通过给予权利要求1所述的复合药物组合物来降低所述频率。
如权利要求19所述的方法，其中，所述复合药物组合物以1‑2单位剂型给药，各剂型每日给药1‑4次。
如权利要求19所述的方法，其中，所述复合药物组合物以1‑2单位剂型给药，各剂型每日给药2次。
一种用于对患有多发性硬化症的患者进行治疗的药物组合物，所述组合物通过如下步骤获得：提供a）活性强化形式的抗γ干扰素抗体、以及b）活性强化形式的抗S‑100蛋白抗体，各抗体根据顺势疗法技术通过对所获得的各溶液进行连续重复稀释和多次振荡而制备；然后通过混合将强化后的溶液进行复合，或者用所述复合后的溶液或用各强化后的溶液单独浸渍载体物质。
一种用于对患有多发性硬化症的患者进行治疗的药物组合物，所述组合物通过如下步骤获得：提供活性强化形式的抗S‑100蛋白抗体，所述抗体根据顺势疗法技术通过对所获得的各溶液进行连续重复稀释和多次振荡而制备；然后通过混合将强化后的溶液进行复合，或者用所述复合后的溶液或用各强化后的溶液单独浸渍载体物质。
一种对多发性硬化症进行治疗的方法，所述方法包括向有需要的患者给予活性强化形式的抗S‑100蛋白抗体。
如权利要求25所述的方法，其中，所述活性强化形式的抗S‑100蛋白抗体针对的是整个牛S‑100蛋白。
如权利要求25所述的方法，其中，所述活性强化形式的抗S‑100蛋白抗体针对的是具有SEQ ID NO.14的整个S‑100蛋白。
如权利要求25所述的方法，其中，所述活性强化形式的抗S‑100蛋白抗体针对的是具有SEQ ID NO.17的整个S‑100蛋白。
如权利要求25所述的方法，其中，所述活性强化形式的抗S‑100蛋白抗体处于浸渍至固态载体上的C12、C30和C50顺势疗法稀释液的混合物形式。
如权利要求25所述的方法，所述方法包括向所述患者给予活性强化形式的抗S‑100蛋白抗体，通过这种方式，所述给予使患有多发性硬化症的患者中的症状发作得以延缓。
一种使多发性硬化症发病得以缓和的方法，所述方法包括向有需要的患者给予活性强化形式的抗S‑100蛋白抗体。
一种对神经感染进行治疗的方法，所述方法包括向有需要的患者基本上同时给予：a）活性强化形式的抗γ干扰素抗体、以及b）活性强化形式的抗S‑100蛋白抗体。
如权利要求32所述的方法，其中，所述活性强化形式的抗γ干扰素抗体和所述活性强化形式的抗S‑100蛋白抗体以复合药物组合物的形式给药。
一种对神经感染进行治疗的方法，所述方法包括向有需要的患者给予活性强化形式的抗S‑100蛋白抗体。

说明书复合药物组合物以及对神经退行性疾病相关的疾病或病症进行治疗的方法
技术领域
本发明涉及复合药物组合物以及对多发性硬化症和其它神经退行性疾病及与神经感染相关的疾病或病症进行治疗的方法。
背景技术
多发性硬化症或MS是一种影响大脑和脊髓导致丧失肌肉控制、平衡和知觉(例如麻木)的慢性疾病。目前，MS的确切病因仍然未知，但是研究者认为可能涉及数种因素的组合。据认为，可能在导致MS发病的特定外部因素存在的情况下，MS发生于遗传易感性个体中。目前广泛接受的是，MS涉及一种自身免疫过程——人体免疫系统的异常应答，该异常应答针对中枢神经系统(CNS——大脑、脊髓和视神经)的髓鞘质(myelin)(包围并隔离神经纤维的脂肪鞘)。随着疾病的发展，MS导致髓鞘质变薄或彻底丧失、神经元延伸或轴突的切断(横切)。当髓鞘质丧失时，神经元将不能再有效地传导电信号。一种称为髓鞘再生的修复过程发生于疾病的早期阶段，但是细胞的髓鞘(myelin sheath)不能被完全重建。反复发作导致有效的髓鞘再生作用不断减少，直至在受损轴突周围形成疤痕状斑块。
除了脱髓鞘，该疾病的另一病理特征为炎症。根据严格的免疫学解释，炎症过程由T细胞(一种淋巴细胞)引起。淋巴细胞为在机体防御中起重要作用的细胞。在MS中，T细胞通过血脑屏障进入大脑。据认为，T细胞将髓鞘质识别为异体物质并对其进行攻击从而引发炎症过程，刺激其它免疫细胞和可溶性因子(如细胞因子和抗体)。
一些研究者认为，除自身免疫紊乱外，感染可能会在某种程度上引发免疫系统对神经细胞的攻击。在本质上认为，引起初次感染的病毒(或细菌)“看起来”像神经细胞。免疫系统生成T细胞来抵抗病毒。感染过后，这些T细胞仍留在体内，并且当它们“看见”神经细胞时会发生错乱，误把神经细胞当作侵入物。结果造成个人的免疫系统攻击神经系统。
主要有四种类型的MS。1.复发/缓解型(RRMS)：其特点是复发期间可出现新症状且旧症状重现或恶化。2.继发进展型(SPMS)：其特点是在复发之间疾病逐渐恶化。3.进展复发型多发性硬化症(PRMS)：这一形式的MS遵循从发作起不时复发的进展过程。4.原发进展型(PPMS)：这一类型的MS的特点是疾病从其发作起逐步发展而无任何缓解。
目前对于MS尚无已知的治愈方法。然而，存在能缓和病情的疗法。治疗的目标为控制症状。已经将改变免疫系统的药物(例如干扰素)用于对多发性硬化症进行处理。干扰素是由免疫系统细胞产生并用于与其它细胞进行联系的蛋白信使。干扰素有不同的类型，例如α、β和γ。所有干扰素均具有调节免疫系统的能力，并在抵御包括病毒在内的入侵物中发挥重要作用。各干扰素所起的功能不同，但是其功能相重叠。已发现，β干扰素可用于处理多发性硬化症。
对用于治疗MS及相关症状的、具有期望疗效的新型药物产品存在持续需求。
本专利申请的发明人Dr.Oleg I.Epshtein已发现了经顺势疗法技术强化的极度稀释形式(或极低形式)抗体(活性强化形式，activated potentiated form)的治疗效果。美国专利号7,582,294公开了通过给予抗前列腺特异性抗原(PSA)的、顺势疗法活性形式的抗体来治疗良性前列腺增生症(Benign Prostatic Hyperplasia)或前列腺炎(prostatitis)的药剂。
S‑100蛋白是主要在脑灰质中(主要在神经胶质细胞和施旺细胞中)发现的细胞质酸性钙结合蛋白。所述蛋白质以由两种免疫学上不同的亚基(α和β)组成的多种均二聚体或异二聚体异构体存在。已经提出将S‑100蛋白用作诊断的辅助，并用于对脑病变和由于脑损伤(如中风)而造成的神经伤害进行评价。Yardan等，Usefulness of S100B Protein in Neurological Disorders，J Pak Med Assoc Vol.61，No.3，2011年3月，以引用的方式将其内容并入本文。
已证明极低剂量的抗S‑100蛋白抗体具有抗焦虑(anxiolytic)、抗衰弱(anti‑asthenic)、抗攻击(anti‑aggressive)、应激保护(stress‑protective)、抗缺氧(anti‑hypoxic)、抗局部缺血(anti‑ischemic)、神经保护(neuroprotective)和促智(nootropic)活性。参见Castagne V.等，Antibodies to S100proteins have anxiolytic‑like activity at ultra‑low doses in the adult rat，J Pharm Pharmacol.，2008，60(3)：309‑16；Epstein O.I.，Antibodies to calcium‑binding S100B protein block the conditioning of long‑term sensitization in the terrestrial snail，Pharmacol Biochem Behav.，2009，94(1)：37‑42；Voronina T.A.等，第8章，Antibodies to S‑100protein in anxiety‑depressive disorders in experimental and clinical conditions，In “Animal models in biological psychiatry”，Kalueff A.V.N‑Y著，“Nova Science Publishers，Inc.”，2006，第137‑152页；以引用的方式将上述文献内容全部并入本文。
极低剂量的抗γ干扰素抗体已显示出可用于对病毒起源疾病进行治疗和治疗性预防。参见美国专利号7,572,441，以引用的方式将其内容整体并入本文。
发明内容
在一个方面，本发明提供了复合药物组合物，所述复合药物组合物包含：a)活性强化形式的抗γ干扰素抗体、以及b)活性强化形式的抗S‑100蛋白抗体。
在一个变型中，本发明提供了复合药物组合物，所述复合药物组合物包含：a)活性强化形式的抗γ干扰素抗体、以及b)活性强化形式的抗S‑100蛋白抗体，其中，抗体针对的是整个γ干扰素或其片段。
在一个变型中，本发明提供了复合药物组合物，所述复合药物组合物包含：a)活性强化形式的抗γ干扰素抗体、以及b)活性强化形式的抗S‑100蛋白抗体，其中，所述抗S‑100蛋白抗体是针对整个S‑100蛋白或其片段的抗体。
在一个变型中，本发明这一方面的复合药物组合物包含活性强化形式的抗γ干扰素抗体，所述抗γ干扰素抗体处于浸渍至固态载体上的(C12、C30和C50)或(C12、C30和C200)顺势疗法稀释液(homeopathic dilutions)的混合物形式。活性强化形式的抗S‑100蛋白抗体处于可随后浸渍至固态载体上的(C12、C30和C50)或(C12、C30和C200)顺势疗法稀释液的混合物形式。
在另一变型中，本发明这一方面的复合药物组合物包含活性强化形式的抗S‑100蛋白抗体，所述抗S‑100蛋白抗体处于浸渍至固态载体上的(C12、C30和C50)或(C12、C30和C200)顺势疗法稀释液的混合物形式。活性强化形式的抗γ干扰素抗体处于可随后浸渍至固态载体上的(C12、C30和C50)或(C12、C30和C200)顺势疗法稀释液的混合物形式。
优选地，活性强化形式的抗γ干扰素抗体为单克隆抗体、多克隆抗体或天然抗体，更优选为多克隆抗体。在本发明这一方面的一个变型中，活性强化形式的抗γ干扰素抗体通过连续的百倍稀释、且每次稀释时均伴以振荡而制备。
优选地，活性强化形式的抗S‑100蛋白抗体为单克隆抗体、多克隆抗体或天然抗体，更优选为多克隆抗体。本发明这一方面的一个变型中，活性强化形式的抗S‑100蛋白抗体通过连续的百倍稀释、且每次稀释时均伴以振荡而制备。特别在考虑之列的是竖直振荡(vertical shaking)。
在另一方面，本发明提供了通过给予如下物质对患有多发性硬化症的患者进行治疗的方法：a)活性强化形式的抗γ干扰素抗体、以及b)活性强化形式的抗S‑100蛋白抗体。优选地，活性强化形式的抗γ干扰素抗体和活性强化形式的抗S‑100蛋白抗体以复合药物组合物的形式给药。
在另一方面，本发明提供了通过给予复合药物组合物来显著延缓患有多发性硬化症的患者中症状发作的方法，其中，所述组合物包含：a)活性强化形式的抗γ干扰素抗体、以及b)活性强化形式的抗S‑100蛋白抗体。
在另一方面，本发明进一步提供了通过给予复合药物组合物从而在患有多发性硬化症的患者中降低复发出现频率的方法，其中，所述组合物包含：a)活性强化形式的抗γ干扰素抗体、以及b)活性强化形式的抗S‑100蛋白抗体。
在本发明的一个变型中，提供了将活性强化形式的抗γ干扰素抗体以1‑2单位剂型给药、以及将活性强化形式的抗S‑100蛋白抗体以1‑2单位剂型给药，各剂型每日给药1‑4次。优选地，将1‑2单位剂型的各活性强化形式抗体每日给药2次。
在本发明这一方面的优选变型中，提供了将复合药物组合物以1‑2单位剂型给药，各剂型每日给药1‑4次，所述组合物包含：a)活性强化形式的抗γ干扰素抗体、以及b)活性强化形式的抗S‑100蛋白抗体。优选地，以1‑2单位剂型每日给药2次。
在本发明这一方面的另一优选变型中，组合物以1单位剂型给药，优选每日给药2次，所述组合物包含：a)活性强化形式的抗γ干扰素抗体、以及b)活性强化形式的抗S‑100蛋白抗体。
附图说明
图1说明了多发性硬化症发病机制中的免疫应答。
图2显示出了临床症状发作的平均天数。
图3显示出了疾病的严重程度(分数)。
图4显示出了不同阶段的疾病严重程度(分数)。
图5显示出了复发出现频率。
具体实施方式
参考所附的权利要求书对本发明进行限定。考虑到权利要求书，下述术语汇编提供了有关定义。
本文所使用的术语“抗体”意味着特异性地结合至另一分子的特定空间和极性结构、并因此被定义为与另一分子的特定空间和极性结构互补的免疫球蛋白。权利要求书中所列举的抗体可包括完全免疫球蛋白或其片段，可为天然抗体、多克隆抗体或单克隆抗体，并可包括多个类及同种型，例如IgA、IgD、IgE、IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG3、IgM等。免疫球蛋白的片段可包括Fab、Fv和F(ab′)2以及Fab′等。单数“抗体(antibody)”包括复数“抗体(antibodies)”。
相对于本文所列举的抗体，术语“活性强化形式”或“强化形式”分别用于表示任意的抗体初始溶液的顺势疗法强化产物。“顺势疗法强化”表示利用顺势疗法的方法对有关物质的初始溶液赋予顺势疗法效力(potency)。尽管不限于此，但是“顺势疗法强化”可包括例如结合外部处理、尤其是竖直(机械)振荡的重复的连续稀释。换句话说，根据顺势疗法技术，对抗体的初始溶液进行连续的重复稀释并对每次获得的溶液进行多次竖直振荡。抗体处于溶剂(优选水或水‑乙醇混合物)中的初始溶液的优选浓度范围为约0.5mg/ml至约5.0mg/ml。制备各组分(即抗体溶液)的优选过程为：使用抗体初级基质溶液(primary matrix solution)(原始酊剂，mother tincture)分别被稀释10012、10030和100200倍的3种水稀释液或水‑醇稀释液的混合物，相当于百倍的顺势疗法稀释液(C12、C30和C200)；或者使用抗体初级基质溶液分别被稀释10012、10030和10050倍的3种水稀释液或水‑醇稀释液的混合物，相当于百倍的顺势疗法稀释液(C12、C30和C50)。在美国专利号7,572,441和7,582,294中描述了顺势疗法强化的实例，以引用的方式将其内容整体并入本文并用于所述目的。同时，术语“活性强化形式”用在权利要求书中，术语“极低剂量”用在实施例中。术语“极低剂量”在通过研究和使用顺势疗法稀释和强化形式的物质而产生的领域中成为行业术语。术语“极低剂量”意味着完全支持并与权利要求书中所使用的术语“活性强化”形式基本上同义。
换句话说，当存在三个因素时，抗体处于“活性强化”或“强化”形式。首先，“活性强化”形式的抗体为顺势疗法领域广泛接受的制备方法的产品。其次，“活性强化”形式的抗体必须具备通过现代药物学广泛接受的方法确定的生物活性。第三，“活性强化”形式的抗体所表现出的生物活性不能由顺势疗法方法终产物中的抗体分子形式的存在加以解释。
例如，抗体的活性强化形式可通过使处于分子形式的初始独立抗体经受伴以外部作用(如机械振荡)的连续多重稀释而制备。浓度降低过程中的外部处理还可通过例如暴露至超声、电磁或其它物理因素来完成。V.Schwabe，“Homeopathic medicines”，M.，1967，美国专利号7,229,648和4,311,897(以引用的方式将其内容整体并入本文并用于所述目的)描述了顺势疗法领域中广泛接受的顺势疗法强化方法。这一过程使得初始分子形式抗体的分子浓度均匀降低。重复这一过程直至获得期望的顺势疗法效力。对于单独的抗体，可通过将中间稀释液在期望的药理学模型中进行生物测试来确定所需的顺势疗法效力。尽管不限于此，但是“顺势疗法强化”可包括例如与外部处理、尤其是竖直(机械)振荡相结合的重复的连续稀释。换句话说，根据顺势疗法技术，对抗体的初始溶液进行连续的重复稀释并对每次获得的溶液进行多次竖直振荡。抗体处于溶剂(优选水或水‑乙醇混合物)中的初始溶液的优选浓度范围为约0.5mg/ml至约5.0mg/ml。制备各组分(即抗体溶液)的优选过程为：使用抗体初级基质溶液(原始酊剂)分别被稀释10012、10030和100200倍的3种水稀释液或水‑醇稀释液的混合物，相当于百倍的顺势疗法稀释液C12、C30和C200；或者使用抗体初级基质溶液分别被稀释10012、10030和10050倍的3种水稀释液或水‑醇稀释液的混合物，相当于百倍的顺势疗法稀释液C12、C30和C50。例如在美国专利号7,229,648和4,311,897中，也提供了如何获得期望效力的实例，以引用方式将其并入本文用于所述目的。在下文将更加详细地描述适用于本文所述的“活性强化”形式抗体的过程。
关于用顺势疗法对人类受试者进行治疗已有许多争议。虽然本发明依靠已接受的顺势疗法方法来获得“活性强化”形式的抗体，但是其并不仅仅依赖于在人类受试者中进行顺势疗法来证明其活性。本申请的发明人出乎预料地发现、并在已接受的药理学模型中充分证明，由起始分子形式的抗体进行连续多次稀释而最终得到的溶剂具有明确的活性，且与痕量分子形式抗体在目标稀释液中的存在无关。将本文所提供的“活性强化”形式的抗体在广泛接受的药理学活性模型中(在适当的体外实验中或在体内于合适的动物模型中)测试其生物活性。下文进一步提供的实验提供了在此类模型中的生物活性的证据。人类临床研究也提供了如下证据：在动物模型中观察到的活性被很好地转换至人类治疗。人类研究还提供了如下证据：本文所述的“活性强化”形式可用于对在医学科学中作为病理症状而广泛接受的具体人类疾病或紊乱进行治疗。
同样，所要求保护的“活性强化”形式的抗体仅涵盖溶液或固体制剂，所述溶液或固体制剂的生物活性不能由初始、起始溶液中余留的分子形式抗体的存在进行解释。换句话说，虽然“活性强化”形式的抗体可包含痕量的初始分子形式抗体也在考虑之列，但是由于连续稀释后余留的分子形式抗体的浓度极低，因此本领域技术人员不能以任何程度的合理性将在已接受的药理学模型中观察到的生物活性归因于余留的分子形式抗体。虽然本发明并不受任何具体理论的限制，但是本发明的“活性强化”形式抗体的生物活性并不归因于初始分子形式的抗体。优选“活性强化”形式的抗体处于液体形式或固体形式，其中，初始分子形式抗体的浓度低于所接受的分析技术(如毛细管电泳和高效液相色谱)的检测限。特别优选“活性强化”形式的抗体处于液体形式或固体形式，其中，初始分子形式抗体的浓度低于阿伏伽德罗常数。在分子形式治疗物质的药物学中，通常制作剂量‑响应曲线，在该曲线中，以药理学响应水平对所给予受试者或在体外进行测试的活性药物的浓度作图。产生任何可检测响应的药物最低水平被称为阈剂量(threshold dose)。特别在考虑之列并优选的是，“活性强化”形式的抗体以低于所给定生物学模型中的分子形式抗体的阈剂量的浓度包含分子抗体(如果有的话)。
多发性硬化症的实验动物模型是已知的。例如，实验性自身免疫性脑脊髓炎、有时为实验性变态反应性脑脊髓炎(Experimental Allergic Encephalomyelitis(EAE))是中枢神经系统炎性脱髓鞘疾病的动物模型。该动物模型主要以啮齿动物和基因敲除小鼠进行使用。这一实验模型作为人中枢神经系统脱髓鞘疾病、例如多发性硬化症的动物模型而被广泛研究。在感官动物(sensory animals)中，能够通过同源或异源脑组织的匀浆、纯化的髓鞘质或引入动物构成(animal’s composition)中的蛋白来诱发EAE(Raine等，Ann.NYAcad.Sci.，1984，436：33‑51；McCombe等，J.Neuroimmunol.1994，51(2)：153‑167)。
目前，已描述了多于20种的具有免疫原性、且最常用于诱发EAE的髓鞘质蛋白(Baumann等，Physiol.Rev.2001，81(2)：871‑927)。实例包括：基本髓鞘质蛋白(“MBP”)(Hashim，Immunol.Rev.，1978，39：60‑107)；蛋白脂质蛋白(“PLP”)(Bradl等，Brain Pathol.，1996，6(3)：303‑311；Tuohy，Neurochem.Res.，1994，19(8)：935‑944)；糖蛋白：糖蛋白相关髓鞘质(“MAG”)(Weerth等，1999)；髓鞘质少突胶质细胞糖蛋白(“MOG”)；和少突胶质细胞特异性蛋白(“OSP”)(Stevens等，J Immunol.，1999；162(12)：7501‑7509)。已经认识到，当将其引入动物体内时，不但是整个蛋白、而且这些蛋白的特定片段也均能造成EAE。啮齿动物中最常用的抗原为脑脊髓匀浆(SCH)、纯化的髓鞘质、髓鞘质蛋白(例如MBP、PLP和MOG)或这些蛋白的肽段，所有抗原均产生了在免疫学和病理学方面具有不同疾病特征的不同模型。
在EAE模型中通过引入髓鞘匀浆得到最合适的模型MS(Gilerovich等，2010；Zhabotinskiy，Joffe，1975；Zhitnukhin等，2008；Sinha等，2009)。在这一模型中，如同初始疾病，免疫应答针对髓鞘质的所有成分产生：随后的脱髓鞘、轴突退化以及神经细胞自身退化诱发炎症(Gilerovich等，2010；Sinha等，2009)。事件的病理学链由局部麻痹(pareses)、瘫痪以及其它疾病症状的发展来加以显示。
在EAE的发展中，可区分为四个阶段：1.外周T淋巴细胞在脑抗原和CFA作用下的致敏作用以及GEB通透性的增高。2.活化T细胞迁移至CNS以及抗原递呈细胞(星形胶质细胞和小胶质细胞)在脑中的直接活化。当未观察到临床表现时，这两个阶段相当于潜伏(诱发)期。3.脑中自身免疫和炎症反应的发展，导致了神经纤维的脱髓鞘作用(临床期)。4.病理过程的抑制和受损组织的修复(恢复期)。在此期间，在多数动物中消除了神经病学紊乱和运动紊乱，继而部分或全部恢复，此后，动物对EAE的反复诱发具有抵抗力。EAE的平均持续时间是30天：潜伏期、临床期和恢复期。通常每阶段持续7‑10天。
由多发性硬化症也观察到了CNS中的病理过程的类似发展阶段。参见图1‑多发性硬化症病程中的免疫应答(Wiendl & Kieseier，2003)。
本发明提供了复合药物组合物，所述组合物包含：a)活性强化形式的抗γ干扰素抗体、以及b)活性强化形式的抗S‑100蛋白抗体。如前文所述，复合物的各单独组分通常由于其本身独立的医药用途而已知。然而本专利申请的发明人惊奇地发现，复合物的给药显著地延缓了症状的发作，并降低了患有多发性硬化症的患者中的复发机率。
根据本发明这一方面的复合药物组合物可处于液态或固态形式。药物组合物中所含的各活性强化形式抗体由初始分子形式的抗体通过顺势疗法领域所接受的方法制备。起始抗体可为根据已知方法制备的单克隆抗体或多克隆抗体，所述已知方法例如Immunotechniques，G.Frimel，M.，“Meditsyna”，1987，第9‑33页；“Hum.Antibodies.Monoclonal and recombinant antibodies，30years after”，Laffly E.，Sodoyer R.著，2005，Vol.14.，N1‑2.，第33‑55页中所述，以引用的方式将其内容并入本文。
单克隆抗体可通过如杂交瘤技术获得。所述方法的初始步骤包括基于已在多克隆抗血清制备过程中开发出的原则进行免疫。工作的进一步步骤包括制备出产生具有相同特异性的抗体克隆的杂交细胞。其各自的分离使用与多克隆抗血清制备的情况中相同的方法进行。
多克隆抗体可通过动物的主动免疫获得。为了这一目的，例如使合适的动物(如兔)接受适当抗原(S‑100蛋白或γ干扰素)的一系列注射。动物的免疫系统产生相应的抗体，以已知方法从动物中进行收集。这一过程使得能够制备富含单特异性抗体的血清。
如果需要的话，包含抗体的血清例如可通过使用亲和色谱、盐沉淀分级分离或离子交换色谱进行纯化。可将所得到的经纯化的、富含抗体的血清用作制备活性强化形式抗体的起始材料。所得到的处于溶剂(优选水或水‑乙醇混合物)中的初始抗体溶液的优选浓度范围为约0.5mg/ml至约5.0mg/ml。
制备本发明所述复合药物的各组分的优选过程为：使用抗体初级基质溶液分别被稀释10012、10030和10050倍的3种水‑醇稀释液的混合物，相当于百倍顺势疗法稀释液C12、C30和C50；或者使用抗体初级基质溶液分别被稀释10012、10030和100200倍的3种水‑醇稀释液的混合物，相当于百倍顺势疗法稀释液C12、C30和C200。为制备固体剂型，将固态载体通过顺势疗法方法用所获得的期望稀释液进行处理。为获得本发明复合物的固体单位剂型，用各稀释液对载体物质进行浸渍。为制备期望的复合剂型，两种浸渍顺序都是适合的。
在优选的实施方式中，用于制备包含本发明所述复合物的活性强化形式的起始材料是针对相应抗原(即，γ干扰素或S‑100蛋白)的动物产多克隆抗体。为获得活性强化形式的抗γ干扰素多克隆抗体，可将期望的抗原作为免疫原注射入实验动物、优选兔中。抗γ干扰素多克隆抗体可使用以下序列的γ干扰素的整个分子获得：
SEQ.ID.NO.1.
Met Lys Tyr Thr Ser Tyr Ile Leu Ala Phe Gln Leu Cys Ile Val
 1               5                   10                  15
Leu Gly Ser Leu Gly Cys Tyr Cys Gln Asp Pro Tyr Val Lys Glu
 16              20                  25                  30
Ala Glu Asn Leu Lys Lys Tyr Phe Asn Ala Gly His Ser Asp Val
 31              35                  40                  45
Ala Asp Asn Gly Thr Leu Phe Leu Gly Ile Leu Lys Asn Trp Lys
 46              50                  55                  60
Glu Glu Ser Asp Arg Lys Ile Met Gln Ser Gln Ile Val Ser Phe
 61              65                  70                  75
Tyr Phe Lys Leu Phe Lys Asn Phe Lys Asp Asp Gln Ser Ile Gln
 76              80                  85                  90
Lys Ser Val Glu Thr Ile Lys Glu Asp Met Asn Val Lys Phe Phe
 91              95                 100                 105
Asn Ser Asn Lys Lys Lys Arg Asp Asp Phe Glu Lys Leu Thr Asn
106             110                 115                 120
Tyr Ser Val Thr Asp Leu Asn Val Gln Arg Lys Ala Ile His Glu
121             125                 130                 135
Leu Ile Gln Val Met Ala Glu Leu Ser Pro Ala Ala Lys Thr Gly
136             140                 145                 150
Lys Arg Lys Arg Ser Gln Met Leu Phe Arg Gly Arg Arg Ala Ser
151             155                 160                 165
Gln
166
抗γ干扰素多克隆抗体可使用以下序列的γ干扰素的整个分子获得：SEQ.ID.NO.2
Met Lys Tyr Thr Ser Tyr Ile Leu Ala Phe Gln Leu Cys Ile Val
 1               5                   10                  15
Leu Gly Ser Leu Gly Cys Tyr Cys Gln Asp Pro Tyr Val Lys Glu
 16              20                  25                  30
Ala Glu Asn Leu Lys Lys Tyr Phe Asn Ala Gly His Ser Asp Val
 31              35                  40                  45
Ala Asp Asn Gly Thr Leu Phe Leu Gly Ile Leu Lys Asn Trp Lys
 46              50                  55                  60
Glu Glu Ser Asp Arg Lys Ile Met Gln Ser Gln Ile Val Ser Phe
 61              65                  70                  75
Tyr Phe Lys Leu Phe Lys Asn Phe Lys Asp Asp Gln Ser Ile Gln
 76              80                  85                  90
Lys Ser Val Glu Thr Ile Lys Glu Asp Met Asn Val Lys Phe Phe
 91              95                 100                 105
Asn Ser Asn Lys Lys Lys Arg Asp Asp Phe Glu Lys Leu Thr ASh
106             110                 115                 120
Tyr Ser Val Thr Asp Leu Asn Val Gln Arg Lys Ala Ile His Glu
121             125                 130                 135
Leu Ile Gln Val Met Ala Glu Leu Ser Pro Ala Ala Lys Thr Gly
136             140                 145                 150
Lys Arg Lys Arg Ser Gln Met Leu Phe Gln Gly Arg Arg Ala Ser
151             155                 160                 165
Gln
166
使用γ干扰素片段作为抗原也在考虑之列。该抗原的合适序列如下：
SEQ.ID.NO.3
                        Ile Leu Ala Phe Gln Leu Cys Ile Val
                         7           10                  15
Leu Gly Ser Leu Gly Cys Tyr Cys Gln Asp Pro Tyr Val Lys Glu
 16              20                  25                  30
Ala Glu Asn Leu Lys Lys Tyr Phe Asn Ala Gly His Ser Asp Val
 31              35                  40                  45
Ala Asp Asn Gly Thr Leu Phe Leu Gly Ile
 46              50                  55
SEQ.ID.NO.4
                                Gln Asp Pro Tyr Val Lys Glu
                                24                       30
Ala Glu Asn Leu Lys Lys Tyr Phe Asn Ala Gly His Ser Asp Val
 31              35                  40                  45
Ala Asp Asn Gly Thr Leu Phe Leu Gly Ile Leu Lys Asn Trp Lys
 46              50                  55                  60
Glu Glu Ser Asp Arg Lys Ile Met Gln Ser Gln Ile Val Ser Phe
 61              65                  70                  75
Tyr Phe Lys Leu Phe Lys Asn Phe Lys Asp Asp Gln Ser Ile Gln
 76              80                  85                  90
Lys Ser Val Glu Thr Ile Lys Glu Asp Met Asn Val Lys Phe Phe
 91              95                 100                 105
Asn Ser Asn Lys Lys Lys Arg Asp Asp Phe Glu Lys Leu Thr Asn
106             110                 115                 120
Tyr Ser Val Thr Asp Leu Asn Val Gln Arg Lys Ala Ile His Glu
121             125                 130                 135
Leu Ile Gln Val Met Ala Glu Leu Ser Pro Ala Ala Lys Thr Gly
136             140                 145                 150
Lys Arg Lys Arg Ser Gln Met Leu Phe Arg Gly Arg Arg Ala Ser
151             155                 160                 165
Gln
166
SEQ.ID.NO.5
                                Gln Asp Pro Tyr Val Lys Glu
                                24                       30
Ala Glu Asn Leu Lys Lys Tyr phe Asn Ala Gly His Ser Asp Val
 31             35                   40                  45
Ala Asp Asn Gly Thr Leu Phe Leu Gly Ile Leu Lys Asn Trp Lys
 46              50                  55                  60
Glu Glu Ser Asp Arg Lys Ile Met Gln Ser Gln Ile Val Ser Phe
 61              65                  70                  75
Tyr Phe Lys Leu Phe Lys Asn Phe Lys Asp Asp Gln Ser Ile Gln
 76              80                  85                  90
Lys Ser Val Glu Thr Ile Lys Glu Asp Met Asn Val Lys Phe Phe
 91              95                 100                 105
Asn Ser Asn Lys Lys Lys Arg Asp Asp Phe Glu Lys Leu Thr Asn
106             110                 115                 120
Tyr Ser Val Thr Asp Leu Asn Val Gln Arg Lys Ala Ile His Glu
121             125                 130                 135
Leu Ile Gln Val Met Ala Glu Leu Ser Pro Ala Ala Lys Thr Gly
136             140                 145                 150
Lys Arg Lys Arg Ser Gln Met Leu Phe Gln Gly Arg Arg Ala Ser
151             155                 160                 165
Gln
166
SEQ.ID.NO.6
                              Gln Ser Gln  Ile Val  Ser Phe
                              69                         75
Tyr Phe Lys Leu Phe Lys Asn Phe Lys Asp Asp Gln Ser Ile Gln
 76              80                  85                  90
Lys Ser Val Glu Thr Ile Lys Glu Asp Met Asn Val Lys Phe Phe
 91              95                 100                 105
Asn Ser Asn Lys Lys Lys Arg Asp Asp Phe Glu Lys Leu Thr Asn
106             110                 115                 120
Tyr Ser Val
121     123
SEQ.ID.NO.7
                                    Met Asn Val Lys Phe Phe
                                    100                 105
Asn Ser Asn Lys Lys Lys Arg Asp Asp Phe Glu Lys Leu Thr Asn
106             110                 115                 120
Tyr Ser Val Thr Asp Leu Asn Val Gln Arg Lys Ala Ile His Glu
121             125                 130                 135
Leu Ile Gln Val Met Ala Glu Leu Ser Pro
136             140                 145
SEQ.ID.NO.8
    Ser Val Glu Thr Ile Lys Glu Asp Met Asn Val Lys Phe Phe
     92          95                 100                 105
Asn Ser Asn Lys Lys Lys Arg Asp Asp Phe Glu Lys Leu Thr Asn
106             110                 115                 120
Tyr Ser Val Thr Asp Leu Asn Val Gln Arg
121             125                 130
SEQ.ID.NO.9
        Val Thr Asp Leu Asn Val Gln Arg Lys Ala Ile His Glu
        123     125                 130                 135
Leu Ile Gln Val Met Ala Glu Leu Ser Pro Ala Ala
136             140                 145     147
SEQ.ID.NO.10
                Ser Tyr Ile Leu Ala Phe Gln Leu Cys Ile Val
                  5                  10
15
Leu Gly Ser Leu Gly Cys Tyr Cys Gln Asp Pro Tyr Val Lys Glu
 16              20                  25                  30
Ala Glu Asn Leu Lys Lys Tyr Phe Asn Ala Gly His Ser Asp Val
 31              35                  40                  45
SEQ.ID.NO.11
            Glu Thr Ile Lys Glu Asp Met Asn Val Lys Phe Phe
             94                      100
105
Asn Ser Asn Lys Lys Lys Arg Asp Asp
106             110             114
抗γ干扰素多克隆抗体可使用以下序列之一的重组γ干扰素的分子获得：
SEQ.ID.NO.12
                            Met Gln Asp Pro Tyr Val Lys Glu
                                24                       30
Ala Glu Asn Leu Lys Lys Tyr Phe Asn Ala Gly His Ser Asp Val
 31              35                  40                  45
Ala Asp Asn Gly Thr Leu Phe Leu Gly Ile Leu Lys Asn Trp Lys
 46              50                  55                  60
Glu Glu Ser Asp Arg Lys Ile Met Gln Ser Gln Ile Val Ser Phe
 61              65                  70                  75
Tyr Phe Lys Leu Phe Lys Asn Phe Lys Asp Asp Gln Ser Ile Gln
 76              80                  85                  90
Lys Ser Val Glu Thr Ile Lys Glu Asp Met Asn Val Lys Phe Phe
 91              95                 100                 105
Asn Ser Asn Lys Lys Lys Arg Asp Asp Phe Glu Lys Leu Thr Asn
106             110                 115                 120
Tyr Ser Val Thr Asp Leu Asn Val Gln Arg Lys Ala Ile His Glu
121             125                 130                 135
Leu Ile Gln Val Met Ala Glu Leu Ser Pro Ala Ala Lys Thr Gly
136             140                 145                 150
Lys Arg Lys Arg Ser Gln Met Leu Phe Gln Gly Arg Arg Ala Ser
151             155                 160                 165
Gln
166
SEQ.ID.NO.13
                            Met Gln Asp Pro Tyr Val Lys Glu
                                24                       30
Ala Glu Asn Leu Lys Lys Tyr Phe Asn Ala Gly His Ser Asp Val
 31              35                  40                  45
Ala Asp Asn Gly Thr Leu Phe Leu Gly Ile Leu Lys Asn Trp Lys
 46              50                  55                  60
Glu Glu Ser Asp Arg Lys Ile Met Gln Ser Gln Ile Val Ser Phe
 61              65                  70                  75
Tyr Phe Lys Leu Phe Lys Asn Phe Lys Asp Asp Gln Ser Ile Gln
 76              80                  85                  90
Lys Ser Val Glu Thr Ile Lys Glu Asp Met Asn Val Lys Phe Phe
 91              95                 100                 105
Asn Ser Asn Lys Lys Lys Arg Asp Asp Phe Glu Lys Leu Thr Asn
106             110                 115                 120
Tyr Ser Val Thr Asp Leu Asn Val Gln Arg Lys Ala Ile His Glu
121             125                 130                 135
Leu Ile Gln Val Met Ala Glu Leu Ser Pro Ala Ala Lys Thr Gly
136             140                 145                 150
Lys Arg Lys Arg Ser Gln Met Leu Phe Arg Gly Arg Arg Ala Ser
151             155                 160                 165
Gln
166
制备起始抗人γ干扰素多克隆抗体的示例性过程可描述如下。在采血前7‑9天，将期望抗原经1‑3次静脉注射至兔，以增高兔血流中的多克隆抗体水平。一旦免疫后，采集血样以测试抗体水平。通常，可溶性抗原免疫反应在抗原第一次注射后40‑60天内达到最高水平。第一个免疫周期结束后，兔具有30天的康复期，之后经另外的1‑3次静脉注射进行再次免疫。
为获得包含期望抗体的抗血清，从兔中收集免疫后的兔血液并置于50ml离心管中。用木质药匙将试管壁上所形成的产物凝块移除，将搅拌棒置于试管中心的凝块中。然后将血液放置于冷却器中于40℃的温度下过夜。第二天，将药匙上的血块移除，将剩余液体在13000转/分下离心10min。上清液体为目标抗血清。所获得的抗血清通常为黄色。向抗血清加入20wt％的NaN3至最终浓度为0.02％并在‑20℃的温度下于冷冻状态贮存至使用，或者不加入NaN3而在‑70℃的温度下贮存至使用。为了从抗血清中分离目标抗体，下述固相吸附顺序很适合：
将10ml兔抗血清用0.15M的NaCl稀释2倍，之后加入6.26g Na2SO4，混合并在4℃下孵育12‑16小时。将沉淀物经离心移除，在10ml磷酸盐缓冲液中稀释并使用相同的缓冲液在环境温度下透析过夜。移除沉淀物后，将溶液加样至用磷酸盐缓冲液平衡后的DEAE‑纤维素柱。通过在280nm处对洗脱液的光密度进行测量来确定抗体馏分。
使用亲和色谱法，通过将所获得的抗γ干扰素抗体附至色谱介质的不溶性基质上、并随后用浓的盐溶液洗脱，对所分离出的粗抗体进行纯化。
将所得的缓冲溶液用作顺势疗法稀释方法的起始溶液，所述顺势疗法稀释方法用来制备活性强化形式的抗体。抗原纯化的抗γ干扰素多克隆兔抗体的初始基质溶液的优选浓度为0.5‑5.0mg/ml，优选2.0‑3.0mg/ml。
由神经元细胞与神经胶质细胞(星形细胞和少突胶质细胞)表达的脑特异性S‑100蛋白，直接或通过与其它蛋白相互作用在CNS中执行许多针对维持正常脑部机能的功能，包括影响学习和记忆过程、神经元的生长和生存力、神经元组织中代谢过程的调节及其它。为了制备活性强化形式的抗体，可按如下步骤从牛的脑组织中移出抗脑特异蛋白S‑100抗血清并进行处理：
‑使用专门的研磨装置将液氮冷冻的牛脑组织磨成粉末；
‑以1∶3(重量/体积)的比例使用提取缓冲液经匀化作用提取蛋白；
‑将匀浆在60℃下加热10min，然后在冰浴中冷却至4℃；
‑通过离心移除热不稳定蛋白；
‑分阶段进行硫酸铵分级分离，然后移除沉淀的蛋白；
‑使用通过将pH降至4.0实现的100％饱和硫酸铵对含S‑100蛋白的馏分进行沉淀；通过离心收集期望的馏分；
‑将沉淀物溶于含EDTA和巯基乙醇的最小体积缓冲液中，将沉淀物用去离子水进行透析，然后冻干；
‑随后通过离子交换介质色谱、DEAE‑纤维DE‑52色谱以及DEAE‑sephadex A‑50色谱对酸性蛋白分级分离；
‑将经收集并透析的馏分(含S‑100蛋白)根据分子量在sephadexG‑100上通过凝胶过滤进行分离；
‑将纯化的S‑100蛋白进行透析和冻干。
纯化的脑特异性S‑100蛋白的分子量为21000D。
还可通过类似于所述的用于γ干扰素抗体的方法使用佐剂来获得抗S‑100蛋白多克隆抗体。可将S‑100蛋白的整个分子用作兔免疫的免疫原(抗原)。
牛S100B(SEQ.ID.NO.14)
Met Ser Glu Leu Glu Lys Ala Val Val Ala Leu Ile Asp Val Phe
 1               5                   10                  15
His Gln Tyr Ser Gly Arg Glu Gly Asp Lys His Lys Leu Lys Lys
 16              20                  25                  30
Ser Glu Leu Lys Glu Leu Ile Asn Asn Glu Leu Ser His Phe Leu
 31              35                  40                  45
Glu Glu Ile Lys Glu Gln Glu Val Val Asp Lys Val Met Glu Thr
 46              50                  55                  60
Leu Asp Ser Asp Gly Asp Gly Glu Cys Asp Phe Gln Glu Phe Met
 61              65                  70                  75
Ala Phe Val Ala Met Ile Thr Thr Ala Cys His Glu Phe Phe Glu
 76              80                  85                  90
His Glu
 91   92
人S100B(SEQ.ID.NO.15)
Met Ser Glu Leu Glu Lys Ala Met Val Ala Leu Ile Asp Val Phe
 1               5                   10                   15
His Gln Tyr Ser Gly Arg Glu Gly Asp Lys His Lys Leu Lys Lys
 16              20                  25                  30
Ser Glu Leu Lys Glu Leu  Ile Asn Asn Glu Leu  Ser His Phe Leu
 31              35                  40                  45
Glu Glu Ile Lys Glu Gln Glu Val Val Asp Lys Val Met Glu Thr
 46              50                  55                  60
Leu Asp Asn Asp Gly Asp Gly Glu Cys Asp Phe Gln Glu Phe Met
 61              65                  70                  75
Ala Phe Val Ala Met Val Thr Thr Ala Cys His Glu Phe Phe Glu
 76              80                  85                  90
His Glu
 91    92
人S100A1(SEQ.ID.NO.16)
Met Gly Ser Glu Leu Glu Thr Ala Met Glu Thr Leu Ile Asn Val
 1               5                   10                  15
Phe His Ala His Ser Gly Lys Glu Gly Asp Lys Tyr Lys Leu Ser
 16              20                  25                  30
Lys Lys Glu Leu Lys Glu Leu Leu Gln Thr Glu Leu Ser Gly Phe
 31              35                  40                  45
Leu Asp Ala Gln Lys Asp Val Asp Ala Val Asp Lys Val Met Lys
 46              50                  55                  60
Glu Leu Asp Glu Asn Gly Asp Gly Glu Val Asp Phe Gln Glu Tyr
 61              65                  70                  75
Val Val Leu Val Ala Ala Leu Thr Val Ala Cys Asn Asn Phe Phe
 76              80                  85                  90
Trp Glu Asn Ser
 91          94
牛S100A1(SEQ.ID.NO.17)
Met Gly Ser Glu Leu Glu Thr Ala Met Glu Thr Leu Ile Asn Val
 1               5                   10                  15
Phe His Ala His Ser Gly Lys Glu Gly Asp Lys Tyr Lys Leu Ser
 16              20                  25                  30
Lys Lys Glu Leu Lys Glu Leu Leu Gln Thr Glu Leu Ser Gly Phe
 31              35                  40                  45
Leu Asp Ala Gln Lys Asp Ala Asp Ala Val Asp Lys Val Met Lys
 46              50                  55                  60
Glu Leu Asp Glu Asn Gly Asp Gly Glu Val Asp Phe Gln Glu Tyr
 61              65                  70                  75
Val Val Leu Val Ala Ala Leu Thr Val Ala Cys Asn Asn Phe Phe
 76              80                  85                  90
Trp Glu Asn Ser
 91          94
为获得脑特异性抗血清以分离出脑特异性S‑100蛋白，经纯化S‑100蛋白(抗原)的混合物可被制备成通过甲基化牛血清白蛋白作为介质与完全弗氏佐剂(complete Freund’s adjuvant)络合，将其以1‑2ml的量经皮下注射入实验动物(兔)的脊柱区域。抗血清可具有1∶500‑1∶1000的效价。
活性强化形式的复合物各组分可由初始溶液经顺势疗法强化来制备，优选使用通过连续稀释来成比例降低浓度的如下方法：将1份的各在先溶液(preceding solution)(由初始溶液开始)连续稀释于9份(十倍稀释)、或连续稀释于99份(百倍稀释)、或连续稀释于999份(千倍稀释)的中性溶剂中，用浓度范围为约0.5mg/ml至约5.0mg/ml的处于溶剂(优选水或水‑乙醇混合物)中的初始抗体溶液伴以外部作用来起始。所述外部作用优选包括每次稀释时的多次竖直振荡(稀释增效法，dynamization)。优选将单独的容器用于后续各次稀释，直至所需效力水平或稀释系数。这一方法在顺势疗法领域中被广泛接受。参见例如V.Schwabe，“Homeopathic medicines”，M.，1967，第14‑29页，以引用的方式将其并入本文用于所述目的。
例如，为了制备第12百倍稀释液(表示为C12)，将1份浓度为3.0mg/ml的抗γ干扰素抗体的初始基质溶液稀释于99份中性水溶剂或水‑醇溶剂(优选15％乙醇)中，并随后进行多次(10次以上)竖直振荡以制成第1百倍稀释液(表示为C1)。第2百倍稀释液(C2)由第1百倍稀释液C1制备。将这一过程重复11次，从而制得第12百倍稀释液C12。因此，第12百倍稀释液C12表示通过将1份浓度为3.0mg/ml的抗γ干扰素抗体的初始基质溶液在处于不同容器内的99份中性溶剂中连续稀释12次所获得的溶液，相当于百倍顺势疗法稀释液C12。以相应的稀释系数进行类似过程，获得C30、C50和C200稀释液。可将中间稀释液在期望的生物模型中进行测试以检测活性。用于本发明复合物中的两种抗体的优选活性强化形式为C12、C30和C50稀释液混合物或C12、C30和C200稀释液混合物。当将活性物质的多种顺势疗法稀释液(主要为百倍稀释液)的混合物用作生物活性液体组分时，组合物的各组分(如，C12、C30、C50、C200)分别根据上述过程制备，直至获得倒数第二份稀释液(例如，分别直至C11、C29和C199)，然后根据混合物组成将1份的各组分加入一个容器中，并与所需量的溶剂(如，用97份以进行百倍稀释)进行混合。
可将活性物质作为多种顺势疗法稀释液、例如十倍和/或百倍稀释液(D20、C30、C100或C12、C30、C50或C12、C30、C200等)的混合物来使用，其效力通过在合适的生物模型、例如本文实施例所述的模型中对稀释液进行测试，从而以实验的方式确定。
在强化和浓度降低的过程中，可将竖直振荡替代为外部暴露至超声、电磁场、或顺势疗法领域中接受的任何类似的外部作用过程。
本发明的药物组合物优选可处于液体或固体单位剂型的形式。药物组合物优选的液体形式为混合物，优选活性强化形式的抗γ干扰素抗体和活性强化形式的抗S‑100蛋白抗体处于1∶1比例的混合物。优选的液态载体为水或水‑乙醇混合物。
可通过用活性强化形式的活性组分水溶液或水‑醇溶液的混合物对药学上可接受的固态载体进行浸渍，来制备本发明药物组合物的固体单位剂型，所述活性组分水溶液或水‑醇溶液优选以1∶1的比例进行混合。或者，可用各所需稀释液对载体进行连续浸渍。两种浸渍顺序均可接受。
优选处于固体单位剂型的药物组合物由药学上可接受的载体的颗粒制备，所述颗粒预先用活性强化形式抗γ干扰素抗体和活性强化形式抗S‑100蛋白抗体的水稀释液或水‑醇稀释液饱和。固体剂型可为药学领域中已知的任何剂型，包括片剂、胶囊、锭剂及其它。作为非活性药物成分，可使用葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、淀粉、异麦芽糖、异麦芽酮糖醇及制药中使用的其它单糖、寡糖和多糖，还可使用上述非活性药物成分与其它药学上可接受的赋形剂的工艺混合物，所述赋形剂如异麦芽酮糖醇、交联聚维酮、甜蜜素(sodium cyclamate)、糖精钠、无水柠檬酸等，包括润滑剂、崩解剂、粘结剂和着色剂。优选的载体为乳糖和异麦芽酮糖醇。药物剂型可进一步包含标准的药物赋形剂，例如微晶纤维素和硬脂酸镁。
为制备固体口服剂型，将乳糖的100‑300μm颗粒用活性强化形式的抗组胺抗体、活性强化形式的抗γ干扰素抗体和活性强化形式的抗S‑100蛋白抗体的水溶液或水‑醇溶液、以1kg抗体溶液对5kg或10kg乳糖(1∶5至1∶10)的比例进行浸渍。为有效浸渍，使乳糖颗粒在沸腾床设备(如，Hüttlin GmbH的“Hüttlin Pilotlab”)中的流化床中接受饱和灌洗(saturation irrigation)，随后经由加热的空气流在低于40℃的温度下进行干燥。将用活性强化形式抗体饱和的估计量的干燥颗粒(10‑34重量份)置于混合器内，并与25‑45重量份的“非饱和”纯乳糖(用于在不降低治疗功效的情况下，降低成本、简化和加速工艺方法的目的)、以及0.1‑1重量份的硬脂酸镁和3‑10重量份的微晶纤维素一起进行混合。将所获得的片状物质进行均匀混合，并通过直接干压成型(如，在Korsch‑XL400压片机中)进行压片，从而形成150‑500mg、优选300mg的圆丸。压片后，获得300mg的丸剂，所述丸剂用活性强化形式抗γ干扰素抗体和活性强化形式抗S‑100蛋白抗体的复合物的水‑醇溶液饱和(3.0‑6.0mg/丸)。用于浸渍载体的各复合物组分均处于百倍顺势疗法稀释液C12、C30和C50或百倍顺势疗法稀释液C12、C30和C200的混合物的形式。
尽管本发明并不受任何具体理论限制，但是认为，本文所述的活性强化形式抗体并不包含足够具有归因于此类分子形式的生物活性的量的分子形式抗体。本发明复合药物(复合药物组合物)的生物活性在所附的实施例中得以充分说明。
本发明进一步提供了显著延缓多发性硬化症症状发作的方法，所述方法包括给予如下复合药物组合物，所述组合物包含：a)活性强化形式的抗γ干扰素抗体、以及b)活性强化形式的抗S‑100蛋白抗体。
本发明进一步提供了通过给予复合药物组合物从而在患有多发性硬化症的患者中降低复发发作机率的方法，其中，所述组合物包含：a)活性强化形式的抗γ干扰素抗体、以及b)活性强化形式的抗S‑100蛋白抗体。
为了治疗目的，本发明复合物优选每日给药1‑4次，优选每日给药2次，每次给药包括1‑2单位复合剂型。
参考所附的非限制性实施例对本发明进行进一步的说明。
实施例
实施例1
本研究中使用了Wistar系雌性大鼠(200‑220g)。在这些大鼠中通过单个接种基于下述的致脑炎混合物来诱发EAE：对于每只动物来说，100mH同源脊髓的匀浆、0.2ml CFA(含有灭活的分枝杆菌(mycobacteria)5mg/ml)以及0.2ml生理溶液。在以0.4ml的量(左右侧各0.2ml)进行轻度醚麻醉的情况下，经皮下(沿尾静脉在尾的底部)给予EGS(Abdurasulova，I.N等，2004；Zhitnukhin，Y.L等，2008；Serebryanaya，N.B等，2010)。从EAE诱发之日起，在30天内每天2次、间隔7小时经胃给予如下物质：(a)极低剂量的抗S‑100蛋白抗体(下文称为“抗S‑100蛋白的ULD Abs”)(n＝10，2.5ml/kg/天)；(b)极低剂量的抗γ干扰素抗体(下文称为“抗γ‑IFN的ULD Abs”)(n＝10，2.5ml/kg/天)；(c)抗S‑100蛋白的ULD Abs和抗γ‑IFN的ULD Abs的复合物(下文称“复方复合物”)(n＝10，5ml/kg/天)；以及(d)蒸馏水(对照，n＝10，5ml/kg/天)。作为参比制剂，使用免疫调节剂(Teva，以色列)，在EAE诱发后的第2天到第25天内，以4mg/Kg剂量经肌肉给予该免疫调节剂。结果在图2‑5中示出。
在实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)诱发之日起30天内，每天对实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)的临床症状进行评价。在即将给予研究药物前对各大鼠进行检查。在疾病快速进展的情况下，每天两次对临床症状进行评价。
以打分的方式对神经病学异常的严重程度进行评价：存在肌无力、震颤(0.5分)；抵抗型局部麻痹(resistant paresis)(1分)；瘫痪(1.5分)。将临床指数(CI)计算为四肢症状的总和。另外，如果无可见的神经病学异常的临床征象，则将CI表示为零；在动物死亡的情况下，则将CI表示为6。在所有的天数内，都要考虑到CI最大值。记录作为整个病程(30天)内各独立CI之和而计算的各大鼠累积指数。30天的病程分为以下阶段：潜伏期(1‑10天)；临床显现期(11‑18天)；以及恢复期(19‑30天)。
为了对实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)模型研究中的药物效力进行评价，在各研究组中对以下参数进行了评价：1)疾病发作时间(天)；2)整个期间疾病平均严重程度的变化(CI，分数)；3)在不同阶段时疾病的平均严重程度(CI，分数)；4)复发的总次数，疾病症状的反复(％)。
与阴性对照(P＜0.05)和Copaxone(P＞0.05)相比，抗S‑100蛋白的ULD Abs使得各病程的临床症状表现的发作推迟。在接受了抗γ干扰素的ULD Abs和Copaxone的这两个组中，其疾病的发作与对照并没有不同。参见图2。与此同时，比起对照，在给予了复方复合物的动物中，观察到了多发性硬化症临床征象出现时间段缩短的趋势。应当注意的是，在疾病发作期间，在接受了抗S‑100蛋白的ULD Abs的组和接受了复方复合物的组之间显示出了统计学上的显著差异。
在接受了抗S‑100蛋白的ULD Abs的组中，具有严重病程的动物(＞3分)的比例也较低。在接受了复方复合物的组中，具有严重病程的动物的百分比高于在在整个疾病期间进行研究的其它组。参见图3。
与该事实相联系的是，在多发性硬化症发展的不同时期，激活了不同的EAE发病机理，分析了制剂对潜伏期、临床征象发展期以及恢复期中的疾病严重程度的影响。在临床显现阶段和恢复阶段，给予抗S‑100蛋白的ULD Abs显著地有助于降低疾病临床征象表现的平均分；而Copaxone和抗γ‑IFN的ULD Abs仅在最终阶段显著减轻了临床症状的严重程度。相比于对照和仅接受抗γ‑IFN的ULD Abs的组或仅接受抗S‑100蛋白的ULD Abs的组，复方复合物组在统计学上显著地增高了疾病阶段临床征象表现和恢复阶段中的动物疾患的平均分。参见图4。
需要注意的是，在部分动物中，在疾病的临床征象完全消失后，注意到了某种与复发类似之处，即EAE临床表现的重现。在抗S‑100蛋白的ULD Abs组，尽管其对EAE的临床进程具有有利影响(疾病发作的时间较迟，临床征象表现的严重程度较轻)，但是注意到最大量动物(25％)的复发。与此同时，在复方复合物组中，其特征在于疾病的早发和病理过程的更好表现，但是没有动物显示出复发的进展。参见图5。
结论
在实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)模型中，抗S‑100蛋白的ULD Abs对病程具有有利影响。抗S‑100蛋白的ULD Abs减轻了症状的严重程度并在一段时间内减少了疾病临床征象。在所选的多发性硬化症实验模型中，抗γ‑IFN的ULD Abs和Copaxone对比制剂对病程无影响；即，对这些物质而言，疾病期的临床征象的程度和症状的严重程度与对照(蒸馏水)无差别。
制剂效力的表现取决于EAE的发展阶段(潜伏期、临床征象期、恢复期)。
复方复合物的效力不同于其组分的效力，即，不同于单独的抗S‑100蛋白的ULD Abs或单独的抗γ‑IFN的ULD Abs。复方复合物的使用引起免疫应答的增强。复方复合物引起了疾病的更早发作，增高了患病动物的比例和疾病的严重程度。
抗S‑100蛋白的ULD Abs组中25％的动物和抗γ‑IFN的ULD Abs组中15％的动物在研究期间(30天)显示出复发。与此同时，在复方复合物组中无任何动物有复发记录。
多发性硬化症的最常见进程是复发‑缓解亚型，其特征在于不可预知的发病(复发)，随后为相对缓解且无新的疾病活动征象的时期。
多发性硬化症治疗的首要目标是减轻急性发病期间的神经元损伤并在发病后恢复机能，以及预防新的导致伤残的发病。
单独的抗S‑100蛋白的ULD Abs能够在实验性疾病的各阶段改善EAE的临床症状，这使抗S‑100蛋白的ULD Abs可潜在用于对多发性硬化症发病进行治疗。抗S‑100蛋白的ULD Abs+抗γ‑IFN的ULD Abs的复合物完全防止了EAE临床症状的反复，因此，可将该复合物作为防止复发的手段用于对人多发性硬化症进行的治疗。因此，对于治疗多发性硬化症而言，抗S‑100蛋白的ULD Abs+抗γ‑IFN的ULD Abs的复合物是有前途的制剂，相信在疾病发展的峰值时增强免疫应答可有助于更有效地康复和防止复发。
实施例2
∑‑1受体是定位于中枢神经系统细胞、多数外周组织细胞和免疫细胞中的胞内受体。相信这一受体通过控制胞内钙的稳态(homeostasis)来对胞内信号事件进行调节，从而活化相应的转录因子和全基因家族的转录。∑‑1受体涉及多种疾病的发病机理，所述疾病包括：疫病(lemic)病症和神经退行性病症。就这点而言，可将对这一受体以及对配体与这一受体相互作用的效力产生影响的药物视为对神经感染性疾病和神经退行性疾病进行治疗的有效药物。
在体外，通过对标准配体[3H]喷他佐辛与重组人∑‑1受体的结合，对以下物质的效力进行了研究，并通过放射性配体法对所述效力进行了评价：复方复合物，其组成包含比例为1∶1的极低剂量S‑100蛋白抗体(C12+C30+C50顺势疗法稀释液的混合物)和极低剂量γ干扰素抗体(C12+C30+C50顺势疗法稀释液的混合物)；以及上述组成的组分，极低剂量S‑100蛋白抗体(C12+C30+C50顺势疗法稀释液的混合物)(抗S‑100蛋白的ULD Abs)和极低剂量γ干扰素抗体(C12+C30+C50顺势疗法稀释液的混合物)(抗γ‑IFN的ULD Abs)。作为对照，对强化的蒸馏水(C12+C30+C50顺势疗法稀释液的混合物)(强化水)进行了测试。
将20μl复方复合物或10μl抗S‑100蛋白的ULD Abs或抗γ‑IFN的ULD Abs引入孵育介质。因此，在复方复合物测试期间引入实验孔中的抗S‑100蛋白的ULD Abs和抗γ‑IFN的ULD Abs的量与作为单一制剂的抗S‑100蛋白的ULD Abs和抗γ‑IFN的ULD Abs的量相同；因此，使得能够对复方复合物和构成该复方复合物的单独组分的效力进行比较。以20μl和10μl的量将强化水引入孵化介质。
然后，引入160μl(～220μg蛋白)Jurkat系细胞膜的匀浆(人白血病性T‑淋巴细胞系)，随后引入20μl氚标记的放射性配体[3H]喷他佐辛(15nM)。
为了对非特异性结合进行测定，将20μl未标记的配体氟哌啶醇(10μM)而非制剂或强化水引入孵化介质中。
在22℃下于50mM Tris‑HCL缓冲液(pH＝7.4)中孵育120分钟并通过玻璃纤维滤器(GF/B，Packard)过滤后，使用闪烁混合物(Microscint0，Packard)在闪烁计数器(Topcount，Packard)上测定放射性。将特异性结合(在实验组或对照中)计算为共价结合(在实验组或对照中)和非特异性结合之差。
将结果(在共价结合的测量中)表示为占对照(将强化水用作对照)中特异性结合的抑制作用的百分比(参见表4)。
表4：测试制剂和强化水对标准放射性配体[3H]喷他佐辛与重组人∑‑1受体结合的影响

占对照中特异性结合的百分比=(实验组中的特异性结合/对照中的特异性结合)*100％；
占对照中特异性结合的抑制作用的百分比=100％‑(实验组中的特异性结合/对照中的特异性结合)*100％)。
超过50％的抑制显示出对结合存在显著影响。25％‑50％的抑制显示出存在弱到中等的影响。低于25％的抑制则被认为对结合无显著影响，并且处于本底限中。
结论：
比起其单独组分(抗S‑l00蛋白的ULD Abs或抗γ‑IFN的ULD Abs)，复方复合物更有效地抑制标准放射性配体[3H]喷他佐辛与重组人∑‑l受体的结合。
以10μl的量引入实验孔中的抗S‑100蛋白的ULD Abs抑制了标准放射性配体[3H]喷他佐辛与重组人∑‑1受体的结合，但是其效力的表现不如复方复合物效力的表现。
以10μl的量引入实验孔中的抗γ‑IFN的ULD Abs对标准放射性配体[3H]喷他佐辛与重组人∑‑l受体的结合无影响。
以10μl或20μl的量引入实验孔中的强化水对标准放射性配体[3H]喷他佐辛与重组人∑‑1受体的结合无影响。