微量测定阳离子抗菌肽最小抑菌和最小杀菌浓度的方法.pdf

摘要
申请专利号：	CN201310065813.4	申请日：	2013.03.01
公开号：	CN103173517A	公开日：	2013.06.26
当前法律状态：	授权	有效性：	有权
法律详情：	授权\|\|\|著录事项变更IPC(主分类):C12Q 1/18变更事项:发明人变更前:汪以真李治学韩菲菲黄霞刘丹变更后:李治学汪以真韩菲菲黄霞刘丹\|\|\|实质审查的生效IPC(主分类):C12Q 1/18申请日:20130301\|\|\|公开
IPC分类号：	C12Q1/18	主分类号：	C12Q1/18
申请人：	浙江大学
发明人：	汪以真; 李治学; 韩菲菲; 黄霞; 刘丹
地址：	310027 浙江省杭州市西湖区浙大路38号
优先权：
专利代理机构：	杭州求是专利事务所有限公司 33200	代理人：	张法高
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内容摘要

本发明公开了一种微量测定阳离子抗菌肽最小抑菌浓度和最小杀菌浓度的方法，包括以下步骤：1）试剂配制：配制MHB培养基；2）细菌悬液制备：复苏细菌至对数生长期，制备浓度一定的细菌悬液；3）细菌悬液计数：倍比稀释步骤2）中的细菌悬液后滴板计数；4）药剂稀释：倍比稀释药剂至不同测试浓度梯度；5）测定最小抑菌浓度：将步骤4）中稀释好的药剂与步骤2）中制备的细菌悬液混合后培养，观察是否有肉眼可见的细菌沉淀；6）测定最小杀菌浓度：将步骤5）中有抑菌效果的测试滴板后培养，观察是否有菌落生长。采用该方法测定阳离子抗菌肽最小抑菌浓度和最小杀菌浓度具有干扰小、微量、方便、快捷的特点。

权利要求书

权利要求书
1.   一种微量测定阳离子抗菌肽最小抑菌浓度和最小杀菌浓度的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1）试剂配制：配制Mueller Hinton Broth培养基；
2）细菌悬液制备：培养细菌至对数生长期，制备细菌悬液；
3）细菌悬液计数：倍比稀释所述的步骤2）中的细菌悬液后滴板计数；
4）阳离子抗菌肽稀释：倍比稀释阳离子抗菌肽至不同测试浓度梯度；
5）测定最小抑菌浓度：将所述的步骤4）中的不同测试浓度梯度的阳离子抗菌肽与步骤2）中制备的细菌悬液混合后培养，观察是否有肉眼可见的细菌沉淀，无肉眼可见细菌沉淀的孔对应的最小浓度即为最小抑菌浓度；
6）测定最小杀菌浓度：将所述的步骤5）中有抑菌效果的测试滴板后培养，观察是否有菌落生长无菌落生长扇区对应的最小浓度即为最小杀菌浓度。

2.   根据权利要求1所述的微量测定阳离子抗菌肽最小抑菌浓度和最小杀菌浓度方法，其特征在于，所述的步骤1）中的试剂配制过程如下：

1.  1) MHB培养基：21 g MHB培养基粉末溶于1 L蒸馏水中，121 ℃灭菌20 min，室温冷却，4 ℃保存备用;

1.  2) MHB琼脂培养基：21 g MHB培养基粉末、15 g琼脂粉溶于1 L蒸馏水中，121 ℃灭菌20 min，倒入无菌培养皿中，以刚好覆盖培养皿底部为宜，室温冷却凝固，4℃保存备用;

1.  3)药剂储存液：准确称取2 mg待测药剂，用无菌水溶解至4 mg/ml，4 ℃保存备用。

3.   根据权利要求1所述的微量测定阳离子抗菌肽最小抑菌浓度和最小杀菌浓度方法，其特征在于，所述的步骤2）中细菌悬液制备过程如下：

2.  1)选取‑80 ℃保存的测试菌种的甘油菌，室温解冻后混悬，用接种环划线MHB琼脂培养基，37 ℃培养12 hr，待长出单菌落后，4 ℃保存备用；

2.  2)用接种环挑取步骤2.1)中的单菌落，接种于5 ml MHB培养基试管，37 ℃、250 rpm培养12 hr，待菌液浑浊后，4 ℃保存备用；

2.  3)混悬步骤2.2)中的菌液，移取50 μl接种于5 ml MHB培养基试管，37 ℃、250 rpm培养约2 hr；

2.  4)测定步骤2.3)中菌液的OD600值，OD600值约为0.5时可使用，0.6<OD600<1.0时，可用MHB培养基稀释至适宜范围；

2.  5)将步骤2.4)中的菌液与MHB培养基以30 μl:30 ml混合制成细菌悬液，制备好的细菌悬液应在30 min内使用完毕。

4.   根据权利要求1所述的微量测定阳离子抗菌肽最小抑菌浓度和最小杀菌浓度方法，其特征在于，所述的步骤3）中细菌悬液计数过程如下：

3.  1）所述的2.5)中的细菌悬液与MHB培养基以10 μl:90 μl混合稀释，连续4次，分别得到10、10^2、10^3和10^4倍稀释细菌悬液；

3.  2）取1块MHB琼脂培养基，记号笔在底部外侧画十字分为4个相等扇区，从步骤3.1）中的10、10^2、10^3和10^4等4个浓度稀释梯度细菌悬液中移10 μl滴加在MHB琼脂培养基标记好的对应扇区，每个梯度3个重复；

3.  3）待步骤3.2）中的细菌悬液被培养基吸收，37 ℃培养12 hr，选取3个重复菌落总数为30~200的扇区计数，计算CFU=3个重复菌落总数/30×稀释倍数×1000，CFU值在0.5~1×10^6/ml为宜。

5.   根据权利要求1所述的微量测定阳离子抗菌肽最小抑菌浓度和最小杀菌浓度方法，其特征在于，所述的步骤4）中药剂稀释过程如下：
  取1块未经细胞培养处理的聚丙烯材质的96孔板，第1列每孔加入32 μl步骤1.3)中的药剂储存液和168 μl无菌水，终浓度为640 μg/ml；第2~10列每孔加入100 μl 无菌水；从第1列起移取100 μl加入次列，如此逐级等比稀释至第10列，第10列移去100 μl；得到640、320、160、80、40、20、10、5、2.5、1.25共10个浓度梯度，每孔100 μl，现用现配。

6.   根据权利要求1所述的微量测定阳离子抗菌肽最小抑菌浓度和最小杀菌浓度方法，其特征在于，所述的步骤5）中最小抑菌浓度的测定过程如下：

5.  1）取1块未经细胞培养处理的聚丙烯材质的96孔板，每行作为1个测试，第1~10列每孔加入90 μl细菌悬液，第11列加入100 μl细菌悬液作为有菌对照，第12列加入100 μl MHB培养基作为无菌对照；

5.  2）从步骤4）中的药剂稀释板移取10 μl稀释药剂加入步骤5.1）中96孔板对应的孔中，终浓度为64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25和0.125 μg/ml以及有菌和无菌对照，终体积100 μl；每种药剂对每种细菌进行3次重复测试；

5.  3）步骤5.2）中的96孔板用保鲜膜包好，放入湿盒（置于容器中覆盖湿润纱布即可），37 ℃培养12 hr，肉眼无可见细菌沉淀的孔所对应的最小浓度数值即为最小抑菌浓度（MIC）。

7.   根据权利要求1所述的微量测定阳离子抗菌肽最小抑菌浓度和最小杀菌浓度方法，其特征在于，所述的步骤6）中最小杀菌浓度的测定过程如下：

6.  1）MHB琼脂培养基提前2 hr在37 ℃培养箱中缓解，记号笔在底部外侧画十字分为4个相等扇区;

6.  2）从步骤5.3）中最小抑菌浓度对应的孔起，向高浓度选取4个浓度梯度，每个浓度梯度取10 μl滴加在步骤6.1）中MHB琼脂平板对应扇区，做好标记，每个梯度3个重复；待细菌悬液被培养基吸收，37 ℃培养12 hr；肉眼无菌落生长的扇区所对应的最小浓度数值即为最小杀菌浓度。

8.   根据权利要求1所述的微量测定阳离子抗菌肽最小抑菌浓度和最小杀菌浓度方法，其特征在于，所述的步骤4）和步骤4）5）使用未经细胞培养处理的聚丙烯材质的96孔板。

说明书

说明书微量测定阳离子抗菌肽最小抑菌和最小杀菌浓度的方法
技术领域
本发明属于一种测定微量抗菌物质最小抑菌浓度和最小杀菌浓度，特别是适用于阳离子抗菌肽测定的方法。
背景技术
抗菌肽是动物体内一大类具有抗菌活性和免疫功能的生物活性物质。抗菌肽具有广谱抗菌活性和丰富的作用机制。不仅和传统抗菌活性物质一样，具有胞内作用机制，包括：与核酸物质结合，阻断DNA复制、RNA合成；影响蛋白质合成；抑制隔膜、细胞壁合成，阻碍细胞分裂；抑制胞内酶的活性。抗菌肽尤其是阳离子抗菌肽有膜作用机制，目前认为存在：“桶板”模型、“毯式”模型，“环形孔”模型和“凝聚”模型等理论。由于抗菌肽的来源天然和作用机制特殊，不易产生耐药性，对人和动物的副作用小，所以备受关注，是抗生素的理想替代品。研究其菌株耐药性、杀菌效果及其杀菌机制则尤为重要，而最小抑菌浓度和最小杀菌浓度是评价抗菌物质抗菌效果和进一步实验的基础指标。
由于阳离子抗菌肽携带有正电荷，一般检测方法使用的抗生素敏感测定培养基中的阳离子浓度以及所用器皿的吸附作用对检测会造成较大影响。加之一般抗菌肽的待测样品量微少，不能满足一般检测方法的需求量。所以找到一种能够适用于阳离子抗菌肽的，检测干扰小、微量样品即可操作，并且在实验过程中根据需要可以相应调节的方法，显得尤为迫切。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种干扰小、微量、方便、快捷的测定阳离子抗菌肽最小抑菌浓度和最小杀菌浓度的方法。
为了解决上述技术问题，本发明提供一种测定阳离子抗菌肽最小抑菌浓度和最小杀菌浓度的方法，包括以下步骤：
1）试剂配制
①MHB（Mueller Hinton Broth）培养基：21 g MHB培养基粉末溶于1 L蒸馏水中，121 ℃灭菌20 min，室温冷却，4 ℃保存备用。
②MHB琼脂培养基：21 g MHB培养基粉末、15 g琼脂粉溶于1 L蒸馏水中，121 ℃灭菌20 min，倒入无菌培养皿中，以刚好覆盖培养皿底部为宜，室温冷却凝固，4℃保存备用。
③药剂储存液：准确称取2 mg待测药剂，用无菌水溶解至4 mg/ml，4 ℃保存备用。
2）细菌悬液制备
①选取‑80 ℃保存的测试菌种的甘油菌，室温解冻后混悬，用接种环划线MHB琼脂培养基，37 ℃培养12 hr，待长出单菌落后，4 ℃保存备用。
②用接种环挑取步骤2）①中的单菌落，接种于5 ml MHB培养基试管，37 ℃、250 rpm培养12 hr，待菌液浑浊后，4 ℃保存备用。
③混悬步骤2）②中的菌液，移取50 μl接种于5 ml MHB培养基试管，37 ℃、250 rpm培养约2 hr。
④测定步骤2）③中菌液的OD600值，OD600值约为0.5时可使用。0.6<OD600<1.0时，可用MHB培养基稀释至适宜范围。
⑤将步骤2）④中的菌液与MHB培养基以30 μl:30 ml混合制成细菌悬液，制备好的细菌悬液应在30 min内使用完毕。
3）细菌悬液计数
①步骤2）⑤中的细菌悬液与MHB培养基以10 μl:90 μl混合稀释，连续4次，分别得到10、10^2、10^3和10^4倍稀释细菌悬液。
②取1块MHB琼脂培养基（提前2 hr在37 ℃培养箱中缓解），记号笔在底部外侧画十字分为4个相等扇区。从步骤3）①中的10、10^2、10^3和10^4等4个浓度稀释梯度细菌悬液中移10 μl滴加在MHB琼脂培养基标记好的对应扇区，每个梯度3个重复。
③待步骤3）②中的细菌悬液被培养基吸收，37 ℃培养12 hr，选取3个重复菌落总数为30~200的扇区计数，计算CFU=3个重复菌落总数/30×稀释倍数×1000，CFU值在0.5~1×10^6/ml为宜。
4）药剂稀释
取1块未经细胞培养处理的聚丙烯材质的96孔板，第1列每孔加入32 μl步骤1）③中的药剂储存液和168 μl无菌水，终浓度为640 μg/ml。第2~10列每孔加入100 μl 无菌水。从第1列起移取100 μl加入次列，如此逐级等比稀释至第10列，第10列移去100 μl。得到640、320、160、80、40、20、10、5、2.5、1.25共10个浓度梯度，每孔100 μl，现用现配。
5）最小抑菌浓度（MIC）的测定
①取1块未经细胞培养处理的聚丙烯材质的96孔板，每行作为1个测试，第1~10列每孔加入90 μl细菌悬液，第11列加入100 μl细菌悬液作为有菌对照，第12列加入100 μl MHB培养基作为无菌对照。
②从步骤4）中的药剂稀释板移取10 μl稀释药剂加入步骤5）①中96孔板对应的孔中，终浓度为64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25和0.125 μg/ml以及有菌和无菌对照，终体积100 μl。每种药剂对每种细菌进行3次重复测试。
③步骤5）②中的96孔板用保鲜膜包好，放入湿盒（置于容器中覆盖湿润纱布即可），37 ℃培养12 hr。肉眼无可见细菌沉淀的孔所对应的最小浓度数值即为最小抑菌浓度（MIC）。
6）最小杀菌浓度（MBC）的测定
①MHB琼脂培养基提前2 hr在37 ℃培养箱中缓解，记号笔在底部外侧画十字分为4个相等扇区。
②从步骤5）③中最小抑菌浓度对应的孔起，向高浓度选取4个浓度梯度，每个浓度梯度取10 μl滴加在步骤6）①中MHB琼脂平板对应扇区，做好标记，每个梯度3个重复。待细菌悬液被培养基吸收，37 ℃培养12 hr。肉眼无菌落生长的扇区所对应的最小浓度数值即为最小杀菌浓度（MBC）。
作为本发明的微量测定阳离子抗菌肽最小抑菌浓度和最小杀菌浓度的方法的改进：1）使用非阳离子调节的培养基，或者说是低阳离子培养基。
作为本发明的微量测定阳离子抗菌肽最小抑菌浓度和最小杀菌浓度的方法的改进：4）和5）使用未经细胞培养处理的聚丙烯材质的96孔板。
本发明中，待测药剂是各类具有抗菌活性的物质，特别是阳离子抗菌肽。
本发明方法的检测结果表明：测试方法能够满足微量抗菌活性物质的最小抑菌浓度和最小杀菌浓度测定的需求，结果重复性好。
本发明具有如下有益效果：
1 可以微量测定，满足抗菌活性物质样品少时的测定需求，2 mg即可测定，且节约试剂。
2 可以测定阳离子抗菌肽，排除了反应体系中阳离子的干扰，以及96孔板对阳离子抗菌肽的吸附作用。
3 本方法操作简便，所用设备简单常见，所用试剂经济实惠，方法简单易行。
附图说明
图1是细菌悬液计数滴板培养后培养皿照片。
图2是药剂稀释及与细菌悬液混合铺96孔板的结果示意图。
具体实施方式
以下结合附图和具体实施方式对本发明做进一步的说明。
实施例1
2012年9月18日，测定抗菌肽PR‑39和抗生素金霉素、新霉素及硫酸粘菌素对大肠杆菌CMCC 44103和ATCC 25922的最小抑菌浓度和最小杀菌浓度。
）试剂配制
①MHB培养基：21 g MHB培养基粉末（BD Difco，货号275730 ）溶于1 L蒸馏水中，121 ℃灭菌20 min，室温冷却，4 ℃保存备用。
②MHB琼脂培养基：21 g MHB培养基粉末、15 g琼脂粉溶于1 L蒸馏水中，121 ℃灭菌20 min，倒入无菌培养皿中，以刚好覆盖培养皿底部为宜，室温冷却凝固，4℃保存备用。
③药剂储存液：准确称取2 mg待测药剂，用无菌水溶解至4 mg/ml，4 ℃保存备用。
）细菌悬液制备
①选取‑80 ℃保存的甘油菌，室温解冻后混悬，用接种环划线MHB琼脂培养基，37 ℃培养12 hr，待长出单菌落后，4 ℃保存备用。
②用接种环挑取步骤2）①中的单菌落，接种于5 ml MHB培养基试管，37 ℃、250 rpm培养12 hr，待菌液浑浊后，4 ℃保存备用。
③混悬步骤2）②中的菌液，移取50 μl接种于5 ml MHB培养基试管，37 ℃、250 rpm培养约2 hr。
④测定步骤2）③中菌液的OD600值，大肠杆菌CMCC 44103的OD600值为0.456，大肠杆菌A细胞培养C 25922的OD600值为0.476。
⑤将步骤2）④中的菌液与MHB培养基以30 μl:30 ml混合制成细菌悬液，制备好的细菌悬液应在30 min内使用完毕。
）细菌悬液计数
①步骤2）⑤中的细菌悬液与MHB培养基以10 μl:90 μl混合稀释，连续4次，分别得到10、10^2、10^3和10^4倍稀释细菌悬液。
②取1块MHB琼脂培养基（提前2 hr在37 ℃培养箱中缓解），记号笔在底部外侧画十字分为4个相等扇区。从步骤3）①中的10、10^2、10^3和10^4等4个浓度稀释梯度细菌悬液中移10 μl滴加在MHB琼脂培养基标记好的对应扇区，每个梯度3个重复。方法如图1所示。
③待步骤3）②中的细菌悬液被培养基吸收，37 ℃培养12 hr，选取3个重复菌落总数为30~200的扇区计数，计算CFU=3个重复菌落总数/30×稀释倍数×1000，CFU值在0.5~1×10^6/ml为宜。结果如下表1所示：
表1
菌种稀释100倍折CFU稀释1000倍折CFU大肠杆菌CMCC 441032317.7×10^5993.3×10^6大肠杆菌ATCC 259221394.6×10^5361.2×10^6
4）药剂稀释
取1块未经细胞培养处理的聚丙烯材质的96孔板，第1列每孔加入32 μl步骤1）③中的药剂储存液和168 μl无菌水，终浓度为640 μg/ml。第2~10列每孔加入100 μl 无菌水。从第1列起移取100 μl加入次列，如此逐级等比稀释至第10列，第10列移去100 μl。得到640、320、160、80、40、20、10、5、2.5、1.25共10个浓度梯度，每孔100 μl，现用现配。
）最小抑菌浓度（MIC）的测定
①取1块未经细胞培养处理的聚丙烯材质的96孔板，每行作为1个测试，第1~10列每孔加入90 μl细菌悬液，第11列加入100 μl细菌悬液作为有菌对照，第12列加入100 μl MHB培养基作为无菌对照。方法如图2所示。
②从步骤4）中的药剂稀释板移取10 μl稀释药剂加入步骤5）①中96孔板对应的孔中，终浓度为64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25和0.125 μg/ml以及有菌和无菌对照，终体积100 μl。每种药剂对每种细菌进行3次重复测试。
③步骤5）②中的96孔板用保鲜膜包好，放入湿盒（置于容器中覆盖湿润纱布即可），37 ℃培养12 hr。肉眼无可见细菌沉淀的孔所对应的最小浓度数值即为最小抑菌浓度（MIC，μg/ml）。结果如下表2所示：
表2
菌种金霉素新霉素硫酸粘菌素PR‑39大肠杆菌CMCC 44103110.54大肠杆菌ATCC 25922120.54
6）最小杀菌浓度（MBC）的测定
①MHB琼脂培养基提前2 hr在37 ℃培养箱中缓解，记号笔在底部外侧画十字分为4个相等扇区。
②从步骤5）③中最小抑菌浓度对应的孔起，向高浓度选取4个浓度梯度，每个浓度梯度取10 μl滴加在步骤6）①中MHB琼脂平板对应扇区，做好标记，每个梯度3个重复。待细菌悬液被培养基吸收，37 ℃培养12 hr。肉眼无菌落生长的扇区所对应的最小浓度数值即为最小杀菌浓度（MBC， μg/ml），结果如下表3所示：
表3
菌种金霉素新霉素硫酸粘菌素PR‑39大肠杆菌CMCC 441034214大肠杆菌ATCC 259228818
最后，还需要注意的是，本发明同样适用于其他阳离子抗菌物质测定和非阳离子抗菌物质微量测定的需求。以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出和联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

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1、(10)申请公布号 CN 103173517 A (43)申请公布日 2013.06.26 CN 103173517 A *CN103173517A* (21)申请号 201310065813.4 (22)申请日 2013.03.01 C12Q 1/18(2006.01) (71)申请人浙江大学地址 310027 浙江省杭州市西湖区浙大路 38 号 (72)发明人汪以真李治学韩菲菲黄霞刘丹 (74)专利代理机构杭州求是专利事务所有限公司 33200 代理人张法高 (54) 发明名称微量测定阳离子抗菌肽最小抑菌和最小杀菌浓度的方法 (57) 摘要本发明公开了一种微量测定。

2、阳离子抗菌肽最小抑菌浓度和最小杀菌浓度的方法，包括以下步骤： 1）试剂配制：配制 MHB 培养基； 2）细菌悬液制备：复苏细菌至对数生长期，制备浓度一定的细菌悬液； 3）细菌悬液计数：倍比稀释步骤 2）中的细菌悬液后滴板计数； 4）药剂稀释：倍比稀释药剂至不同测试浓度梯度； 5）测定最小抑菌浓度：将步骤 4）中稀释好的药剂与步骤 2）中制备的细菌悬液混合后培养，观察是否有肉眼可见的细菌沉淀； 6）测定最小杀菌浓度：将步骤 5）中有抑菌效果的测试滴板后培养，观察是否有菌落生长。采用该方法测定阳离子抗菌肽最小抑菌。

3、浓度和最小杀菌浓度具有干扰小、微量、方便、快捷的特点。 (51)Int.Cl. 权利要求书 2 页说明书 5 页附图 1 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请权利要求书2页说明书5页附图1页 (10)申请公布号 CN 103173517 A CN 103173517 A *CN103173517A* 1/2 页 2 1. 一种微量测定阳离子抗菌肽最小抑菌浓度和最小杀菌浓度的方法，其特征在于，包括以下步骤： 1）试剂配制：配制 Mueller Hinton Broth 培养基； 2）细菌悬液制备：培养细菌至对数生长期，制备细菌悬。

4、液； 3）细菌悬液计数：倍比稀释所述的步骤 2）中的细菌悬液后滴板计数； 4）阳离子抗菌肽稀释：倍比稀释阳离子抗菌肽至不同测试浓度梯度； 5）测定最小抑菌浓度：将所述的步骤 4）中的不同测试浓度梯度的阳离子抗菌肽与步骤 2）中制备的细菌悬液混合后培养，观察是否有肉眼可见的细菌沉淀，无肉眼可见细菌沉淀的孔对应的最小浓度即为最小抑菌浓度； 6）测定最小杀菌浓度：将所述的步骤 5）中有抑菌效果的测试滴板后培养，观察是否有菌落生长无菌落生长扇区对应的最小浓度即为最小杀菌浓度。 2. 根据权利要求 1 所述的微量测定阳离子抗菌肽最小抑菌浓度和最小杀菌浓。

5、度方法，其特征在于，所述的步骤 1）中的试剂配制过程如下： 1.1) MHB 培养基： 21 g MHB 培养基粉末溶于 1 L 蒸馏水中， 121 灭菌 20 min，室温冷却， 4 保存备用 ; 1.2) MHB琼脂培养基： 21 g MHB培养基粉末、 15 g琼脂粉溶于1 L蒸馏水中， 121 灭菌 20 min，倒入无菌培养皿中，以刚好覆盖培养皿底部为宜，室温冷却凝固， 4保存备用 ; 1.3) 药剂储存液：准确称取 2 mg 待测药剂，用无菌水溶解至 4 mg/ml， 4 保存备用。 3. 根据权利要求 1 所述的微量测定阳离子抗菌肽最小抑菌浓度和最小。

6、杀菌浓度方法，其特征在于，所述的步骤 2）中细菌悬液制备过程如下： 2.1) 选取 -80 保存的测试菌种的甘油菌，室温解冻后混悬，用接种环划线 MHB 琼脂培养基， 37 培养 12 hr，待长出单菌落后， 4 保存备用； 2.2) 用接种环挑取步骤 2.1) 中的单菌落，接种于 5 ml MHB 培养基试管， 37 、 250 rpm 培养 12 hr，待菌液浑浊后， 4 保存备用； 2.3) 混悬步骤 2.2) 中的菌液，移取 50 l 接种于 5 ml MHB 培养基试管， 37 、 250 rpm 培养约 2 hr ； 2.4) 测定步骤 2.3) 中菌液的。

7、 OD600 值， OD600 值约为 0.5 时可使用， 0.6OD6001.0 时，可用 MHB 培养基稀释至适宜范围； 2.5) 将步骤 2.4) 中的菌液与 MHB 培养基以 30 l:30 ml 混合制成细菌悬液，制备好的细菌悬液应在 30 min 内使用完毕。 4. 根据权利要求 1 所述的微量测定阳离子抗菌肽最小抑菌浓度和最小杀菌浓度方法，其特征在于，所述的步骤 3）中细菌悬液计数过程如下： 3.1）所述的 2.5) 中的细菌悬液与 MHB 培养基以 10 l:90 l 混合稀释，连续 4 次，分别得到 10、 102、 103 和 104 倍稀释细菌悬液。

8、； 3.2）取1块MHB琼脂培养基，记号笔在底部外侧画十字分为4个相等扇区，从步骤3.1）中的 10、 102、 103 和 104 等 4 个浓度稀释梯度细菌悬液中移 10 l 滴加在 MHB 琼脂培养基标记好的对应扇区，每个梯度 3 个重复； 3.3）待步骤 3.2）中的细菌悬液被培养基吸收， 37 培养 12 hr，选取 3 个重复菌落总数为 30200 的扇区计数，计算 CFU=3 个重复菌落总数 /30 稀释倍数 1000， CFU 值在权利要求书 CN 103173517 A 2 2/2 页 3 0.51106/ml 为宜。 5. 根据权利要求 1。

9、所述的微量测定阳离子抗菌肽最小抑菌浓度和最小杀菌浓度方法，其特征在于，所述的步骤 4）中药剂稀释过程如下：取1块未经细胞培养处理的聚丙烯材质的96孔板，第1列每孔加入32 l步骤1.3) 中的药剂储存液和168 l无菌水，终浓度为640 g/ml ；第210列每孔加入100 l 无菌水；从第 1 列起移取 100 l 加入次列，如此逐级等比稀释至第 10 列，第 10 列移去 100 l ；得到 640、 320、 160、 80、 40、 20、 10、 5、 2.5、 1.25 共 10 个浓度梯度，每孔 100 l，现用现配。 6. 根据权利要求 1 。

10、所述的微量测定阳离子抗菌肽最小抑菌浓度和最小杀菌浓度方法，其特征在于，所述的步骤 5）中最小抑菌浓度的测定过程如下： 5.1）取 1 块未经细胞培养处理的聚丙烯材质的 96 孔板，每行作为 1 个测试，第 110 列每孔加入90 l细菌悬液，第11列加入100 l细菌悬液作为有菌对照，第12列加入100 l MHB 培养基作为无菌对照； 5.2）从步骤 4）中的药剂稀释板移取 10 l 稀释药剂加入步骤 5.1）中 96 孔板对应的孔中，终浓度为 64、 32、 16、 8、 4、 2、 1、 0.5、 0.25 和 0.125 g/ml 以及有菌和无菌对照，。

11、终体积 100 l ；每种药剂对每种细菌进行 3 次重复测试； 5.3）步骤 5.2）中的 96 孔板用保鲜膜包好，放入湿盒（置于容器中覆盖湿润纱布即可）， 37 培养 12 hr，肉眼无可见细菌沉淀的孔所对应的最小浓度数值即为最小抑菌浓度（MIC）。 7. 根据权利要求 1 所述的微量测定阳离子抗菌肽最小抑菌浓度和最小杀菌浓度方法，其特征在于，所述的步骤 6）中最小杀菌浓度的测定过程如下： 6.1） MHB 琼脂培养基提前 2 hr 在 37 培养箱中缓解，记号笔在底部外侧画十字分为 4 个相等扇区 ; 6.2）从步骤 5.3）中最小抑菌浓度对应的孔起，向。

12、高浓度选取 4 个浓度梯度，每个浓度梯度取 10 l 滴加在步骤 6.1）中 MHB 琼脂平板对应扇区，做好标记，每个梯度 3 个重复；待细菌悬液被培养基吸收， 37 培养 12 hr ；肉眼无菌落生长的扇区所对应的最小浓度数值即为最小杀菌浓度。 8. 根据权利要求 1 所述的微量测定阳离子抗菌肽最小抑菌浓度和最小杀菌浓度方法，其特征在于，所述的步骤 4）和步骤 4） 5）使用未经细胞培养处理的聚丙烯材质的 96 孔板。权利要求书 CN 103173517 A 3 1/5 页 4 微量测定阳离子抗菌肽最小抑菌和最小杀菌浓度的方法技术领域 0001 本发明属。

13、于一种测定微量抗菌物质最小抑菌浓度和最小杀菌浓度，特别是适用于阳离子抗菌肽测定的方法。背景技术 0002 抗菌肽是动物体内一大类具有抗菌活性和免疫功能的生物活性物质。抗菌肽具有广谱抗菌活性和丰富的作用机制。不仅和传统抗菌活性物质一样，具有胞内作用机制，包括：与核酸物质结合，阻断 DNA 复制、 RNA 合成；影响蛋白质合成；抑制隔膜、细胞壁合成，阻碍细胞分裂；抑制胞内酶的活性。抗菌肽尤其是阳离子抗菌肽有膜作用机制，目前认为存在：“桶板” 模型、“毯式” 模型，“环形孔” 模型和 “凝聚” 模型等理论。由于抗菌肽的来源天然和作用机制特殊，不易产生。

14、耐药性，对人和动物的副作用小，所以备受关注，是抗生素的理想替代品。研究其菌株耐药性、杀菌效果及其杀菌机制则尤为重要，而最小抑菌浓度和最小杀菌浓度是评价抗菌物质抗菌效果和进一步实验的基础指标。 0003 由于阳离子抗菌肽携带有正电荷，一般检测方法使用的抗生素敏感测定培养基中的阳离子浓度以及所用器皿的吸附作用对检测会造成较大影响。加之一般抗菌肽的待测样品量微少，不能满足一般检测方法的需求量。所以找到一种能够适用于阳离子抗菌肽的，检测干扰小、微量样品即可操作，并且在实验过程中根据需要可以相应调节的方法，显得尤为迫切。发明内容 0004 本发明要解决的技术问题。

15、是提供一种干扰小、微量、方便、快捷的测定阳离子抗菌肽最小抑菌浓度和最小杀菌浓度的方法。 0005 为了解决上述技术问题，本发明提供一种测定阳离子抗菌肽最小抑菌浓度和最小杀菌浓度的方法，包括以下步骤： 1）试剂配制 MHB （Mueller Hinton Broth）培养基： 21 g MHB 培养基粉末溶于 1 L 蒸馏水中， 121 灭菌 20 min，室温冷却， 4 保存备用。 0006 MHB琼脂培养基： 21 g MHB培养基粉末、 15 g琼脂粉溶于1 L蒸馏水中， 121 灭菌 20 min，倒入无菌培养皿中，以刚好覆盖培养皿底部为宜，室温冷却凝固，。

16、 4保存备用。 0007 药剂储存液：准确称取 2 mg 待测药剂，用无菌水溶解至 4 mg/ml， 4 保存备用。 0008 2）细菌悬液制备选取 -80 保存的测试菌种的甘油菌，室温解冻后混悬，用接种环划线 MHB 琼脂培养基， 37 培养 12 hr，待长出单菌落后， 4 保存备用。 0009 用接种环挑取步骤 2）中的单菌落，接种于 5 ml MHB 培养基试管， 37 、 250 说明书 CN 103173517 A 4 2/5 页 5 rpm 培养 12 hr，待菌液浑浊后， 4 保存备用。 0010 混悬步骤 2）中的菌液，移取 50 l 接种。

17、于 5 ml MHB 培养基试管， 37 、 250 rpm 培养约 2 hr。 0011 测定步骤 2）中菌液的 OD600 值， OD600 值约为 0.5 时可使用。0.6OD6001.0 时，可用 MHB 培养基稀释至适宜范围。 0012 将步骤 2）中的菌液与 MHB 培养基以 30 l:30 ml 混合制成细菌悬液，制备好的细菌悬液应在 30 min 内使用完毕。 0013 3）细菌悬液计数步骤 2）中的细菌悬液与 MHB 培养基以 10 l:90 l 混合稀释，连续 4 次，分别得到 10、 102、 103 和 104 倍稀释细菌悬液。 0014 取 1 。

18、块 MHB 琼脂培养基（提前 2 hr 在 37 培养箱中缓解），记号笔在底部外侧画十字分为 4 个相等扇区。从步骤 3）中的 10、 102、 103 和 104 等 4 个浓度稀释梯度细菌悬液中移 10 l 滴加在 MHB 琼脂培养基标记好的对应扇区，每个梯度 3 个重复。 0015 待步骤 3）中的细菌悬液被培养基吸收， 37 培养 12 hr，选取 3 个重复菌落总数为 30200 的扇区计数，计算 CFU=3 个重复菌落总数 /30 稀释倍数 1000， CFU 值在 0.51106/ml 为宜。 0016 4）药剂稀释取 1 块未经细胞培养处理的聚丙烯材质。

19、的 96 孔板，第 1 列每孔加入 32 l 步骤 1）中的药剂储存液和168 l无菌水，终浓度为640 g/ml。第210列每孔加入100 l 无菌水。从第 1 列起移取 100 l 加入次列，如此逐级等比稀释至第 10 列，第 10 列移去 100 l。得到640、 320、 160、 80、 40、 20、 10、 5、 2.5、 1.25共10个浓度梯度，每孔100 l，现用现配。 0017 5）最小抑菌浓度（MIC）的测定取 1 块未经细胞培养处理的聚丙烯材质的 96 孔板，每行作为 1 个测试，第 110 列每孔加入 90 l 细菌悬液，第 1。

20、1 列加入 100 l 细菌悬液作为有菌对照，第 12 列加入 100 l MHB 培养基作为无菌对照。 0018 从步骤 4）中的药剂稀释板移取 10 l 稀释药剂加入步骤 5）中 96 孔板对应的孔中，终浓度为 64、 32、 16、 8、 4、 2、 1、 0.5、 0.25 和 0.125 g/ml 以及有菌和无菌对照，终体积 100 l。每种药剂对每种细菌进行 3 次重复测试。 0019 步骤 5）中的 96 孔板用保鲜膜包好，放入湿盒（置于容器中覆盖湿润纱布即可）， 37 培养12 hr。肉眼无可见细菌沉淀的孔所对应的最小浓度数值即为最小抑菌浓度（MIC。

21、）。 0020 6）最小杀菌浓度（MBC）的测定 MHB 琼脂培养基提前 2 hr 在 37 培养箱中缓解，记号笔在底部外侧画十字分为 4 个相等扇区。 0021 从步骤 5）中最小抑菌浓度对应的孔起，向高浓度选取 4 个浓度梯度，每个浓度梯度取10 l滴加在步骤6）中MHB琼脂平板对应扇区，做好标记，每个梯度3个重复。待细菌悬液被培养基吸收， 37 培养 12 hr。肉眼无菌落生长的扇区所对应的最小浓度数值即为最小杀菌浓度（MBC）。说明书 CN 103173517 A 5 3/5 页 6 0022 作为本发明的微量测定阳离子抗菌肽最小抑菌浓度和最小杀菌。

22、浓度的方法的改进： 1）使用非阳离子调节的培养基，或者说是低阳离子培养基。 0023 作为本发明的微量测定阳离子抗菌肽最小抑菌浓度和最小杀菌浓度的方法的改进： 4）和 5）使用未经细胞培养处理的聚丙烯材质的 96 孔板。 0024 本发明中，待测药剂是各类具有抗菌活性的物质，特别是阳离子抗菌肽。 0025 本发明方法的检测结果表明：测试方法能够满足微量抗菌活性物质的最小抑菌浓度和最小杀菌浓度测定的需求，结果重复性好。 0026 本发明具有如下有益效果： 1 可以微量测定，满足抗菌活性物质样品少时的测定需求， 2 mg 即可测定，且节约试剂。 0027 2 可。

23、以测定阳离子抗菌肽，排除了反应体系中阳离子的干扰，以及 96 孔板对阳离子抗菌肽的吸附作用。 0028 3 本方法操作简便，所用设备简单常见，所用试剂经济实惠，方法简单易行。附图说明 0029 图 1 是细菌悬液计数滴板培养后培养皿照片。 0030 图 2 是药剂稀释及与细菌悬液混合铺 96 孔板的结果示意图。具体实施方式 0031 以下结合附图和具体实施方式对本发明做进一步的说明。 0032 实施例 1 2012年9月18日，测定抗菌肽PR-39和抗生素金霉素、新霉素及硫酸粘菌素对大肠杆菌 CMCC 44103 和 ATCC 25922 的最小抑菌浓度和最小杀菌浓度。。

24、0033 ）试剂配制 MHB培养基： 21 g MHB培养基粉末（BD Difco，货号275730 ）溶于1 L蒸馏水中， 121 灭菌 20 min，室温冷却， 4 保存备用。 0034 MHB琼脂培养基： 21 g MHB培养基粉末、 15 g琼脂粉溶于1 L蒸馏水中， 121 灭菌 20 min，倒入无菌培养皿中，以刚好覆盖培养皿底部为宜，室温冷却凝固， 4保存备用。 0035 药剂储存液：准确称取 2 mg 待测药剂，用无菌水溶解至 4 mg/ml， 4 保存备用。 0036 ）细菌悬液制备选取 -80 保存的甘油菌，室温解冻后混悬，用接种环划线。

25、 MHB 琼脂培养基， 37 培养 12 hr，待长出单菌落后， 4 保存备用。 0037 用接种环挑取步骤 2）中的单菌落，接种于 5 ml MHB 培养基试管， 37 、 250 rpm 培养 12 hr，待菌液浑浊后， 4 保存备用。 0038 混悬步骤 2）中的菌液，移取 50 l 接种于 5 ml MHB 培养基试管， 37 、 250 rpm 培养约 2 hr。 0039 测定步骤 2）中菌液的 OD600 值，大肠杆菌 CMCC 44103 的 OD600 值为 0.456，说明书 CN 103173517 A 6 4/5 页 7 大肠杆菌 A 细胞培养 C。

26、 25922 的 OD600 值为 0.476。 0040 将步骤 2）中的菌液与 MHB 培养基以 30 l:30 ml 混合制成细菌悬液，制备好的细菌悬液应在 30 min 内使用完毕。 0041 ）细菌悬液计数步骤 2）中的细菌悬液与 MHB 培养基以 10 l:90 l 混合稀释，连续 4 次，分别得到 10、 102、 103 和 104 倍稀释细菌悬液。 0042 取 1 块 MHB 琼脂培养基（提前 2 hr 在 37 培养箱中缓解），记号笔在底部外侧画十字分为 4 个相等扇区。从步骤 3）中的 10、 102、 103 和 104 等 4 个浓度稀释。

27、梯度细菌悬液中移 10 l 滴加在 MHB 琼脂培养基标记好的对应扇区，每个梯度 3 个重复。方法如图 1 所示。 0043 待步骤 3）中的细菌悬液被培养基吸收， 37 培养 12 hr，选取 3 个重复菌落总数为 30200 的扇区计数，计算 CFU=3 个重复菌落总数 /30 稀释倍数 1000， CFU 值在 0.51106/ml 为宜。结果如下表 1 所示：表 1 菌种稀释 100 倍折 CFU稀释 1000 倍折 CFU 大肠杆菌 CMCC441032317.7105993.3106 大肠杆菌 ATCC259221394.6105361.2106 4）药剂。

28、稀释取 1 块未经细胞培养处理的聚丙烯材质的 96 孔板，第 1 列每孔加入 32 l 步骤 1）中的药剂储存液和168 l无菌水，终浓度为640 g/ml。第210列每孔加入100 l 无菌水。从第 1 列起移取 100 l 加入次列，如此逐级等比稀释至第 10 列，第 10 列移去 100 l。得到640、 320、 160、 80、 40、 20、 10、 5、 2.5、 1.25共10个浓度梯度，每孔100 l，现用现配。 0044 ）最小抑菌浓度（MIC）的测定取 1 块未经细胞培养处理的聚丙烯材质的 96 孔板，每行作为 1 个测试，第 110 。

29、列每孔加入 90 l 细菌悬液，第 11 列加入 100 l 细菌悬液作为有菌对照，第 12 列加入 100 l MHB 培养基作为无菌对照。方法如图 2 所示。 0045 从步骤 4）中的药剂稀释板移取 10 l 稀释药剂加入步骤 5）中 96 孔板对应的孔中，终浓度为 64、 32、 16、 8、 4、 2、 1、 0.5、 0.25 和 0.125 g/ml 以及有菌和无菌对照，终体积 100 l。每种药剂对每种细菌进行 3 次重复测试。 0046 步骤 5）中的 96 孔板用保鲜膜包好，放入湿盒（置于容器中覆盖湿润纱布即可）， 37 培养12 hr。肉眼无。

30、可见细菌沉淀的孔所对应的最小浓度数值即为最小抑菌浓度（MIC， g/ml）。结果如下表 2 所示：表 2 菌种金霉素新霉素硫酸粘菌素PR-39 大肠杆菌 CMCC44103110.54 大肠杆菌 ATCC25922120.54 6）最小杀菌浓度（MBC）的测定 MHB 琼脂培养基提前 2 hr 在 37 培养箱中缓解，记号笔在底部外侧画十字分为 4 个相等扇区。 0047 从步骤 5）中最小抑菌浓度对应的孔起，向高浓度选取 4 个浓度梯度，每个浓说明书 CN 103173517 A 7 5/5 页 8 度梯度取10 l滴加在步骤6）中MHB琼脂平板对应扇区，做。

31、好标记，每个梯度3个重复。待细菌悬液被培养基吸收， 37 培养 12 hr。肉眼无菌落生长的扇区所对应的最小浓度数值即为最小杀菌浓度（MBC， g/ml），结果如下表 3 所示：表 3 菌种金霉素新霉素硫酸粘菌素PR-39 大肠杆菌 CMCC441034214 大肠杆菌 ATCC259228818 最后，还需要注意的是，本发明同样适用于其他阳离子抗菌物质测定和非阳离子抗菌物质微量测定的需求。以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出和联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。说明书 CN 103173517 A 8 1/1 页 9 图 1 图 2 说明书附图 CN 103173517 A 9 。

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