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1、(10)申请公布号 CN 103146719 A (43)申请公布日 2013.06.12 CN 103146719 A *CN103146719A* (21)申请号 201310061336.4 (22)申请日 2013.02.21 C12N 15/53(2006.01) C12N 9/02(2006.01) C12N 15/63(2006.01) C12N 1/21(2006.01) C12N 1/19(2006.01) C12N 5/10(2006.01) (71)申请人 吉首大学 地址 416000 湖南省吉首市人民南路 120 号 吉首大学 (72)发明人 彭清忠 杜次 朱越 李菁 。
2、(54) 发明名称 华南美丽葡萄花青素还原酶基因及其编码的 蛋白与应用 (57) 摘要 本发明公开了一种华南美丽葡萄花青素还原 酶基因及其编码的蛋白与用途， 该基因为首次从 华南美丽葡萄的 cDNA 中获得， 填补了我国葡萄资 源中分子克隆出花青素还原酶基因的空白。本发 明所提供的花青素还原酶基因具有 SEQ ID NO.1 所示的核苷酸序列 ； 所述基因编码的蛋白质具有 SEQ ID NO.2 所示的氨基酸序列。本发明提供的 花青素还原酶基因可以通过生物技术提高葡萄中 原花青素类活性成分的含量， 同时可以进行牧草 品种改良、 农产品脱涩、 茶多酚的分子育种、 作物 抗病虫害的提高等， 具有很。
3、好的应用前景。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 5 页 序列表 2 页 附图 2 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书5页 序列表2页 附图2页 (10)申请公布号 CN 103146719 A CN 103146719 A *CN103146719A* 1/1 页 2 1. 一种华南美丽葡萄花青素还原酶基因， 其特征在于， 核苷酸序列为 ： (1)SEQ ID NO.1 的 DNA 序列 ； 或 (2) 编码 SEQ ID NO.2 所示氨基酸序列的核苷酸序列。 2.一种具有权利要求1所述SEQ ID NO.2所示的氨基酸。
4、序列的华南美丽葡萄花青素还 原酶。 3. 一种含有权利要求 1 所述的华南美丽葡萄花青素还原酶基因全部或部分序列的重 组载体。 4. 一种含有权利要求 1 所述的华南美丽葡萄花青素还原酶基因全部或部分序列的宿 主细胞。 5. 如权利要求 1 所述的华南美丽葡萄花青素还原酶基因通过转基因技术和代谢工程 手段在葡萄或牧草品质改良、 农产品脱涩、 茶多酚分子育种、 作物抗病虫害中的应用。 权 利 要 求 书 CN 103146719 A 2 1/5 页 3 华南美丽葡萄花青素还原酶基因及其编码的蛋白与应用 技术领域 0001 本发明属于生物技术领域， 主要涉及通过合成华南美丽葡萄 cDNA、 PCR。
5、 和重组表 达技术获得花青素还原酶基因及其编码产物， 属于分子生物学和植物基因工程领域。 背景技术 0002 植物有效成分 ( 次生代谢产物 ) 的形成是植物次生代谢途径中特有基因群的产 物。随着植物功能基因组研究的广泛与深入， 经济作物次生代谢合成相关功能基因的研究 成为热点领域之一， 这些基因的克隆将为解析经济作物有效成分的生物合成途径及其调控 机制和解释作物品质的形成提供理论依据， 同时为利用生物技术进行作物品质改良、 分子 遗传育种和作物抗逆性等带来广阔的应用前景。 0003 原花青素 (Proanthocyanidins， PA) 又称缩合单宁， 是高等植物特有并广泛存在 的聚多酚类。
6、化合物。 具有抗紫外线、 抗病、 抗虫、 清除自由基、 调节种子休眠和萌发等生理功 能 ； 从食物中摄取寡聚原花青素可以抗衰老， 预防心血管疾病、 癌症、 阿兹海默氏病等疾病， 享有多方面的保健和药用价值。花青素还原酶 (anthocyanidin reductase， ANR) 是原花青 素类化合物合成下游途径中的关键酶， 也是原花青素单体合成的直接酶类， 在原花青素生 物合成途径中具有重要的调节作用。 0004 葡萄除作为重要的经济作为外， 其葡萄籽和皮中原花青素含量丰富， 是提取原花 青素的主要原材料。 目前， 我国葡萄种植主要为欧洲品种， 本土丰富的野生资源未有得到开 发利用。因此从野。
7、生葡萄资源中获得花青素还原酶基因， 将为通过代谢工程手段改良葡萄 或其他作物品质和分子遗传育种等提供重要基础。在本次发明公布之前， 仅有欧洲酿酒葡 萄 (Vitis vinifera) 有关花青素还原酶基因的报道， 尚未有公开或报道过野生葡萄 - 华 南美丽葡萄 (Vitis bellula) 花青素还原酶基因及其氨基酸序列。 发明内容 0005 针对上述问题， 本发明的目的在于提供一种华南美丽葡萄花青素还原酶基因 (ANR) 及其编码的蛋白与应用。 0006 本发明实施例是这样实现的， 一种华南美丽葡萄花青素还原酶基因， 核苷酸序列 为 ： 0007 (1)SEQ ID NO.1 的 DNA。
8、 序列 ； 或 0008 (2) 编码 SEQ ID NO.2 所示氨基酸序列的核苷酸序列 ； 0009 本发明的另一目的在于提供一种具有上述SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的华南 美丽葡萄花青素还原酶。 0010 本发明的另一目的在于提供一种含有上述的华南美丽葡萄花青素还原酶基因全 部或部分序列的重组载体。 0011 本发明的另一目的在于提供一种含有上述的华南美丽葡萄花青素还原酶基因全 部或部分序列的宿主细胞。 说 明 书 CN 103146719 A 3 2/5 页 4 0012 本发明的另一目的在于提供上述的华南美丽葡萄花青素还原酶基因通过转基因 技术和代谢工程手段在葡萄或牧草品质。
9、改良、 农产品脱涩、 茶多酚分子育种、 作物抗病虫害 中的应用。 0013 本发明所提供的花青素还原酶基因具有 SEQ ID NO.1 所示的核苷酸序列 ； 所述基 因编码的蛋白质具有 SEQ ID NO.2 所示的氨基酸序列。本发明提供的花青素还原酶基因可 以通过生物技术提高葡萄中原花青素类活性成分的含量， 同时可以进行牧草品种改良、 农 产品脱涩、 茶多酚的分子育种、 作物抗病虫害的提高等， 具有很好的应用前景。 附图说明 0014 图 1 ： 华南美丽葡萄总 RNA 和 ANR 基因的 PCR 扩增电泳图 ； 0015 图 2 ： 大肠杆菌表达载体 pET-32a(+)/ANR 构建图 。
10、； 0016 图 3 ： 重组花青素还原酶表达和纯化 SDS-PAGE 图 ； M， 蛋白质标准 ； 1， 重组菌破壁 后上清液 ； 2， 重组菌全菌 ； 3， 重组菌破壁后沉淀部分 ； 4， 空载体重组菌 ； Trx-VbANR， 纯化的 重组花青素还原酶 ； 0017 图4 ： 重组花青素还原酶活性HPLC检测图 ； a， 花青素标准品HPLC图 ； b， Trx-VbANR 酶促反应产物 HPLC 图 (EC， 表儿茶素 )。 具体实施方式 0018 为了使本发明的目的、 技术方案及优点更加清楚明白， 以下结合附图及实施例， 对 本发明进行进一步详细说明。 应当理解， 此处所描述的具体实。
11、施例仅仅用以解释本发明， 并 不用于限定本发明。 0019 本发明的目的在于提供一种华南美丽葡萄花青素还原酶基因 (ANR)。 0020 本发明的第二个目的是提供该基因编码的蛋白质。 0021 本发明还提供了含有该基因的重组载体和宿主细胞。 0022 本发明的另一个目的在于提供该基因的应用。 0023 本发明所提供的华南美丽葡萄花青素还原酶 (ANR)， 为以下核苷酸序列之一 ： 0024 (1)SEQ ID NO.1 的 DNA 序列 ； 0025 (2) 编码 SEQ ID NO.2 所示氨基酸序列的核苷酸序列 ； 0026 本发明所提供的华南美丽葡萄花青素还原酶 (ANR)， 其特征在于。
12、， 是一下氨基酸序 列之一 ： 0027 具有 SEQ ID NO.2 所示的氨基酸序列 ； 0028 含有本发明的华南美丽葡萄花青素还原酶基因全序列或部分序列的重组载体， 如 原核类载体， 真核类表达载体及 RNAi 载体均属于本发明的保护范围 ； 0029 含有本发明的华南美丽葡萄花青素还原酶基因全序列或部分序列的宿主细胞， 如 含有上述的重组载体的宿主细胞也属于本发明的保护范围 ； 0030 所述宿主细胞为有价值的活性材料。 0031 本发明的华南美丽葡萄花青素还原酶基因的应用， 包括用所述的重组载体， 如植 物表达载体转化植物细胞 ； 或者用所述含有该基因的农杆菌与植物细胞共培养， 得。
13、到转基 因的植物发根系 ； 或者用所述的发根细胞再生植株 ； 或者用所述的华南美丽葡萄花青素还 说 明 书 CN 103146719 A 4 3/5 页 5 原酶基因全序列或部分序列转化获得转基因生物体。 0032 本发明技术方案中涉及的概念具体内容如下 ： 0033 “华南美丽葡萄花青素还原酶” 基因 (ANR) 指 ： 编码具有华南美丽葡萄花青素还原 酶活性的多肽的核苷酸序列， 如 SEQ ID NO.1 中第 1-1017 位核苷酸序列。 0034 “华南美丽葡萄花青素还原酶蛋白或多肽 (ANR)” 指 ： 具有华南美丽葡萄花青素还 原酶活性的 SEQ ID NO.2 序列的多肽。该术语。
14、还包括华南美丽葡萄花青素还原酶的活性片 段和活性衍生物， 还包括能够可操作地连于信号肽、 启动子或者核糖体结合位点序列所组 成的衍生物。 0035 本发明还包括花青素还原酶或多肽的类似物。 这些类似物与天然华南美丽葡萄花 青素还原酶多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异， 也可以是不影响序列的修饰形式上的 差异， 或者兼而有之。所述修饰 ( 通常不改变一级结构 ) 形式包括 ： 体内或体外的多肽的化 学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化， 如那些在多肽的合成和加工中或进一 步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。 这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化 修饰的酶 ( 如哺乳动物的糖基化酶或。
15、去糖基化酶 ) 而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨 基酸残基 ( 如磷酸酪氨酸， 磷酸丝氨酸， 磷酸苏氨酸 ) 的序列。还包括被修饰从而提高了其 蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。 0036 本发明中， 可选用本领域已知的各种载体， 如市售的载体， 包括质粒， 粘粒等。 0037 在生产本发明中的华南美丽葡萄花青素还原酶多肽时， 可以将华南美丽葡萄花青 素还原酶基因的核苷酸序列可操作地连于表达调控序列， 从而形成华南美丽葡萄花青素还 原酶表达载体。所述 “可操作地连于” 指这样一种状况， 即线性 DNA 序列的某些部分能够影 响同一线性 DNA 序列其他部分的活性。例如， 如果信号肽 DNA。
16、 作为前体表达并参与多肽的 分泌， 那么信号肽 ( 分泌前导序列 )DNA 就是可操作地连于多肽 DNA ； 如果启动子控制序列 的转录， 那么它是可操作地连于编码序列。一般，“可操作地连于” 意味着相邻， 而对于分泌 前导序列则意味着在阅读框中相邻。本发明中宿主细胞为原核细胞或真核细胞。常用的原 核宿主细胞包括大肠杆菌 ； 常用的真核宿主细胞包括酵母细胞、 烟草细胞和其他植物细胞。 0038 发明还可用 Northern 印迹法技术分析华南美丽葡萄花青素还原酶基因产物的表 达， 即分析华南美丽葡萄花青素还原酶的 RNA 转录物在细胞中的存在和数量。 0039 此外， 本发明可用作探针的核酸分。
17、子通常具有华南美丽葡萄花青素还原酶基因核 苷酸编码序列的 8-100 个连续核苷酸， 较佳地具有 15-50 个连续核苷酸。该探针可用于检 测样品中是否存在编码华南美丽葡萄花青素还原酶的核酸分子。 本发明涉及检测样品中是 否存在华南美丽葡萄花青素还原酶核苷酸序列的方法， 它包括用上述的探针与样品进行杂 交， 然后检测探针是否发生了结合。 较佳地， 该样品是PCR扩增后的产物， 其中PCR扩增引物 对应于华南美丽葡萄花青素还原酶核苷酸编码序列， 并可位于该编码序列两侧或中间。引 物长度一般为 15-50 个核苷酸。 0040 实施例 1、 华南美丽葡萄 cDNA 的合成 0041 1、 华南美丽。
18、葡萄总 RNA 的提取与检测 0042 取华南美丽葡萄 (Vitis bellula) 嫩叶 2g， 在研钵中用液氮快速研磨成粉末， 快速转移至 65预热的 10mL 提取缓冲液中 CTAB(W/V)2， Tris-HCl(pH8.0)100mmol/ L， EDTA25mmol/L， NaCl2.0mol/L， PVP402， 亚精胺 0.5g/L， 巯基乙醇 2 ， 充分振荡混 说 明 书 CN 103146719 A 5 4/5 页 6 匀 ； 用等体积氯仿抽提 2 次， 7500g 离心 15min。上清液加入 1/4 体积的 10M LiCl， 混合 后放置 4沉淀过夜 ； 7500。
19、g 离心 20min， 沉淀用 500L SSTESDS0.5， NaCl1mol/L， Tris-HCl(pH8.0)10mmol/L， EDTA1mmol/L， 在 65溶解 5min。用等体积氯仿抽提， 13000g 离心 5min， 上清液加入 2 倍体积无水乙醇， -70放置 2h， 4 13000g 离心 20min， 沉淀室温 干燥10min后溶于100LDEPC处理的水中， 用1.0琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性， 用 Eppendorf 核酸定量仪测定 A260、 A280 比值和浓度。置于 -80冰箱备用。 0043 2、 反转录合成 cDNA 0044 采用mRNA纯化。
20、试剂盒(PolyATract mRNA isolation system III， Promega公司) 分离 mRNA 后， 采用 TaKaRa 公司提供的 PrimeScript 反转录试剂盒， 合成蛇足石杉 mRNA 第 一互补链 DNA。 0045 实施例 2、 花青素还原酶基因的克隆 0046 从 NCBI 中搜索花青素还原酶基因相关的核苷酸序列和 EST 序列， 通过比对 分 析， 利 用 vector NTI 软 件 设 计 一 对 扩 增 引 物 ANR-F(ATGGCCACCCAGCAC CCCAT) 和 ANR-R(TCAATTCTGCAATAGCCCCTTGGC)。以华南。
21、美丽葡萄的 cDNA 为模板， 按照以下体系 10Ex PCR buffer 5.0L， dNTP(2.5mM)4.0L，引 物 LDC-F 和 LDC-R(10pmol) 各 1.0L， Ex Taq聚合酶0.25L， cDNA4.0L， 补加ddH2O至终体积50.0L扩增LDC基因 ； 反应程序 ： 94预变性 5min ； 94变性 30s， 52退火 30s， 72延伸 1min， 30 个循环 ； 72 终延伸 10min， 4保存。扩增结果于 1琼脂糖凝胶电泳检测 ( 图 1)。利用 TaKaRa 公司的 Agarose Gel DNA Fragment Recovery Kit。
22、 Ver.2.0纯化PCR产物， 然后克隆到19-T 载体中， 提取阳性克隆子送 TaKaRa 公司测序， 获得华南美丽葡萄花青素还原酶相关基因序 列。利用 Vector NTI 软件分析， 发现该序列具有完整开放阅读框， 长度为 1017 bp， 可编码 338 个氨基酸， 将该基因分别命名为 ANR。 0047 实施例 3、 花青素还原酶基因的原核表达 0048 1、 原核表达载体的构建 0049 以 T 载体中的 ANR 为模板， 利用引物 P1(CATGCCATGGCCACCCAG CACCCCAT) 和 P2(C CGCTCGAGTCAATTCTGCAATAGCCCCTTG) 进行 。
23、PCR 反应， 扩增产物经电泳检测和纯化后， 用限制 性内切酶 Nco I 和 Xho I 在 37酶切 2h， 采用回收试剂盒 (Takara 公司， 中国 ) 纯化酶切 产物 ； 同时利用 Nco I 和 Xho I 在 37酶切 pET-32a(+) 载体 2h， 利用试剂盒回收大片段。 0050 将回收的两个片段混合， 在 DNA 连接酶作用下于 16反应 12h， 连接产物利用 CaCl2法转化大肠杆菌 BL21(DE3)， 在氨苄和氯霉素抗性平板上进行抗性筛选， 并对克隆子 进行全菌 PCR 检测， 将阳性克隆子接入 LB 液体培养基中培养， 提取重组质粒， 进行 Nco I 和 。
24、Xho I 双酶切分析， 琼脂糖凝胶电泳鉴定完全酶切后存在两个片段， 表明表达载体构建成 功。命名为 ： pET-32a(+)/ANR( 图 2)。 0051 2、 花青素还原酶基因的可溶性表达 0052 将筛选获得的阳性克隆子接种到含有氨苄青霉素 ( 终浓度 100g/mL) 和氯霉素 ( 终浓度 170g/mL) 的 LB 液体培养基中， 37 150r/min 培养 3-4h 后使用分光光度计检 测菌体密度， OD600约为 1.0 时添加 IPTG( 终浓度 260g/mL) 诱导表达， 继续培养 4h， 取 1mL 菌液于 1.5mL 离心管中， 离心收集菌体， 用 1mL 的 PB。
25、S(50mM pH7.0) 洗涤和重悬菌体， 重悬 菌液分 2 份， 其中一份加入 2L 溶菌酶 (100mg/mL)， 室温静置 10min 后在液氮中反复冻融 说 明 书 CN 103146719 A 6 5/5 页 7 3 次， 12000rpm 离心 10min， 分别收集上清液和沉淀。分别在上清、 沉淀、 全菌中加入等体积 的 2loading buffer， 沸水浴 3min， 短暂离心后使用 10的 SDS-PAGE 电泳检测分析 ( 图 3)。 0053 实施例 4、 重组花青素还原酶的纯化和活性鉴定 0054 1、 重组花青素还原酶的纯化 0055 大量培养重组菌株， 经 I。
26、PTG 诱导表达， 收集菌体， PBS 反复洗涤 3 次， 使用 Ni-NTA SefinoseTM Resin 蛋白纯化试剂盒 ( 上海生工 ) 中的 binding buffer 重悬菌体， 溶菌酶 酶解， 冰浴超声破碎细胞， 12000rpm 离心 30min 收集上清 ； 根据融合蛋白上的 His-Tag 采用 Ni-NTA 纯化柱纯化重组花青素还原酶， 分管收集纯化液， 10的 SDS-PAGE 电泳检测纯化效 果 ( 图 3)。 0056 2、 重组花青素还原酶活性鉴定 0057 在柠檬酸缓冲液 (100mM， pH4.0) 中配制酶反应体系 (1mL)， 使各试剂终浓度分别 为 。
27、： 花青素 (cyanidin)100M、 NADPH1.0mM、 500g 重组酶 (Trx-VbANR)。将反应体系于 40水浴 45min， 然后加入 2mL 乙酸乙酯萃取酶反应产物， 离心收集萃取液， 浓缩至干， 用 50L 甲醇溶解。 0058 高效液相色谱 (HPLC) 检测 ： 采用 LC-20A 高效液相色谱仪 ( 岛津， 日本 )， 色谱条 件 ： 色谱柱 Diamonsil C18(250mm4.6mm， 5m)、 流动相甲醇 -0.08M 醋酸铵 (25 75)、 流 速 1mL/min、 检测波长 280nm、 柱温 25、 进样量 20L。分别吸取花青素标准品 ( 底物 ) 和 酶促反应产物进行分析 ( 图 4) 0059 以上所述仅为本发明的较佳实施例而已， 并不用以限制本发明， 凡在本发明的精 神和原则之内所作的任何修改、 等同替换和改进等， 均应包含在本发明的保护范围之内。 说 明 书 CN 103146719 A 7 1/2 页 8 0001 序 列 表 CN 103146719 A 8 2/2 页 9 0002 序 列 表 CN 103146719 A 9 1/2 页 10 图 1 图 2 图 3 说 明 书 附 图 CN 103146719 A 10 2/2 页 11 图 4 说 明 书 附 图 CN 103146719 A 11 。