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1、(10)申请公布号 CN 103159831 A (43)申请公布日 2013.06.19 CN 103159831 A *CN103159831A* (21)申请号 201310116658.4 (22)申请日 2013.04.03 C07K 7/06(2006.01) C07K 2/00(2006.01) A61K 38/08(2006.01) A61K 38/02(2006.01) A61P 37/06(2006.01) (71)申请人 山东大学 地址 250061 山东省济南市历下区文化西路 44 号 (72)发明人 王凤山 王爱军 廉倩倩 曹吉超 程艳娜 (74)专利代理机构 济南圣。
2、达知识产权代理有限 公司 37221 代理人 杨琪 (54) 发明名称 一种五肽、 多肽、 环肽衍生物、 化合物及其药 物和应用 (57) 摘要 本发明公开了一种五肽、 以其为活性中心 的多肽、 环肽衍生物和化合物以及以其为活性 中心的免疫抑制药物， 以及其用于免疫抑制 药 物 中 的 应 用。 本 发 明 的 五 肽 TIPP(thymic immunosuppressive pentapeptide)，来 源 于 LMW-TISE-c（低分子量牛胸腺免疫抑制提取 物） ， 它是如 SEQ ID NO.1 所示的氨基酸序列 ： Ala-Glu-Trp-Cys-Pro。 本发明是多年来首次从胸。
3、 腺免疫抑制组分中获取结构确定的成分。该五肽 来源于胸腺免疫抑制提取物 （TISE） ， 本发明可用 于制备免疫抑制药物。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 6 页 序列表 1 页 附图 5 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书6页 序列表1页 附图5页 (10)申请公布号 CN 103159831 A CN 103159831 A *CN103159831A* 1/1 页 2 1. 一种胸腺免疫抑制五肽， 其特征在于， 它是如 SEQ ID NO.1 所示的氨基酸序列 ： Ala-Glu-Trp-Cys-Pro。 2. 一种。
4、以权利要求 1 所述的五肽为活性中心， 从其 N 端或 C 端添加 L- 氨基酸、 D- 氨基 酸、 羟基氨基酸、 甲基化氨基酸或杂环氨基酸中的一个或多个得到的多肽。 3. 一种由权利要求 1 2 所述的五肽的 N 端和 C 端连接成环得到的环肽衍生物。 4. 一种由权利要求 1 2 所述的五肽的 N 端经乙酰化、 甲酰化、 烷基化或 C 端经氨酰 化、 酯化得到的化合物。 5. 一种免疫抑制药物， 其特征在于， 其活性成分包括权利要求 1 所述的五肽、 权利要求 2 所述的多肽、 权利要求 3 所述的环肽衍生物或权利要求 4 所述的化合物。 6.权利要求1所述的五肽、 权利要求2所述的多肽、。
5、 权利要求3所述的环肽衍生物或权 利要求 4 所述的化合物在制备免疫抑制药物中的应用。 权 利 要 求 书 CN 103159831 A 2 1/6 页 3 一种五肽、 多肽、 环肽衍生物、 化合物及其药物和应用 技术领域 0001 本发明涉及一种五肽、 以其为活性中心的多肽、 环肽衍生物和化合物以及以其为 活性中心的免疫抑制药物， 以及其用于免疫抑制药物中的应用。 背景技术 0002 胸腺是哺乳动物重要的中枢免疫器官。胸腺除了提供一个 T 细胞发育所需的细胞 微环境外， 还产生多种多肽激素， 这些激素影响 T 细胞的分化和成熟， 也有调节成熟 T 细胞 功能的作用， 对机体免疫学功能的发挥具。
6、有重要意义。 目前， 国内外对胸腺中增强机体免疫 能力的提取物或因子已有较深刻的认识和研究， 如胸腺素和胸腺五肽， 但对胸腺中免疫抑 制作用的因子研究报道较少。 0003 1960 年， Bullough 及 Laurence 自上皮细胞分离得到了一种上皮细胞分裂的抑制 物质， 并提出了抑素 (Chalone) 的概念。抑素是一类内源性的细胞生长抑制因子。自 20 世 纪 70 年代， 人们陆续从牛、 猪和人胚胸腺中提得了抑制淋巴细胞分裂的抑素样物质， 研究 表明其有免疫抑制活性且无细胞毒性。 国外研究胸腺来源具有免疫抑制功能的物质主要是 指抑素样物质。因从胸腺中提取得到的抑素样物质均为未知混。
7、合物， 研究者对其的成分及 性质进行了研究。Houck 等曾分离出分子量为 30kD 50kD 的免疫抑制物， 含有核酸， 具有 热敏感性， 后来， 他们将其经核糖核酸酶水解后超滤， 回收具有免疫抑制活性的组分并推测 抑素为分子量在 5kD 左右的荷正电的糖肽。法国的 Kiger 等通过凝胶过滤和离子交换层析 制得淋巴细胞抑制因子， 经分析推测其可能为一种具有热稳定性、 结合于核苷酸的碱性多 肽。Allen 等认为淋巴细胞抑制因子的生物活性物质为精胺， 分子量只有 202D， 在提取物中 与一种组织特异性物质结合成紧密的精胺复合物而显示特异的免疫抑制活性。Rijke 等发 现淋巴细胞抑制因子是。
8、精胺与蛋白质结合的复合物， 在淋巴细胞转化抑制试验中， 真正起 抑制作用的是精胺， 但在以精胺为对照的研究中发现它并不能抑制淋巴细胞转化。Patt 等 证明淋巴细胞转化抑制因子为分子量 500D 600D、 疏水、 酸性、 含有巯基的肽。Blazsek 证 明淋巴细胞转化的抑制物为 pI5.9 的组分， 加热、 加入蛋白质变性剂 （4mol/L 去离子脲） 或 蛋白酶， 都能使其活性受到破坏， 但用核糖核酸酶消化对其活性没有影响。 虽然早期研究者 对胸腺来源的免疫抑制物的性质进行了研究， 但近来对其的研究未见报道， 也未见自其中 发现结构明确的单一化合物。 发明内容 0004 本发明的目的是为。
9、克服上述现有技术的不足， 提供一种五肽、 以其为活性中心的 多肽、 环肽衍生物和化合物以及以其为活性中心的免疫抑制药物， 以及其用于免疫抑制药 物中的应用。 0005 为实现上述目的， 本发明采用下述技术方案 ： 0006 一种胸腺免疫抑制五肽 TIPP(thymic immunosuppressive pentapeptide)， 来源 于 LMW-TISE-c（低分子量牛胸腺免疫抑制提取物） ， 它是如 SEQ ID NO.1 所示的氨基酸序 说 明 书 CN 103159831 A 3 2/6 页 4 列 ： 0007 Ala-Glu-Trp-Cys-Pro。 0008 以所述五肽为活性。
10、中心， 从其 N 端或 C 端添加 L- 氨基酸、 D- 氨基酸、 羟基氨基酸、 甲基化氨基酸或杂环氨基酸中的一个或多个得到的多肽。 0009 所述杂环氨基酸为色氨酸、 组氨酸或脯氨酸。 0010 所述五肽的 N 端和 C 端连接成环得到的环肽衍生物。 0011 所述五肽的 N 端经乙酰化、 甲酰化、 烷基化或 C 端经氨酰化或酯化得到的化合物， 较所述五肽的生物活性、 半衰期、 稳定性等有了很大提高。 0012 所述烷基化为甲基化、 乙基化、 丙基化或丁基化。 0013 所述酯化为与甲醇、 乙醇、 丁醇或己醇酯化反应。 0014 一种免疫抑制药物， 其活性成分包括上述五肽、 多肽、 环肽衍生。
11、物或化合物在制备 免疫抑制药物中的应用。 0015 上述五肽、 多肽、 环肽衍生物或化合物在制备免疫抑制药物中的应用。 0016 本发明的五肽可采用现有技术中的公知方法获得。 既可以用多肽自动合成仪进行 化学合成， 又可以将短肽序列推导成核苷酸序列， 然后克隆到表达载体中进行生物合成。 0017 本发明提供了一种免疫抑制药物， 其活性成分包括所述的五肽、 以其为活性中心 的多肽、 环肽衍生物和化合物。上述免疫抑制药物中还可含有一种或多种药学上可接受的 载体。 所述载体包括药学领域常规的稀释剂、 赋形剂、 填充剂、 粘合剂、 湿润剂、 崩解剂、 吸收 促进剂、 表面活性剂、 吸附载体、 润滑剂等。
12、， 必要时还可以加入香味剂、 甜味剂等。本发明的 免疫抑制药物可以制成注射剂、 粉针剂、 吸入剂、 片剂、 粉剂、 胶囊、 口服液等多种形式。 上述 各种剂型的药物均可以按照药学领域的常规方法制备。 0018 本发明还提供了所述五肽、 以其为活性中心的多肽、 环肽衍生物和化合物在制备 免疫抑制药物中的应用。 0019 特别是， 所述五肽在制备用于自身免疫性疾病、 器官移植、 变态反应性疾病以及炎 症性疾病的药物中的应用。 0020 山东医科大学 （现山东大学）药学院于 20 世纪 80 年代中期进行胸腺素开发研 究时发现， 用酸性提取方法制备的胸腺免疫抑制药物以免疫促进活性为主， 而用碱性提取。
13、 方法制备的胸腺制剂以免疫抑制活性为主。因制备方法与已报道的胸腺来源的免疫抑制 药物的不同， 申请人将用碱性提取法制备的提取物命名为胸腺免疫抑制提取物 （thymic immunosuppressive extract,TISE） 。通过对 TISE 的生物活性和药理作用及不同动物胸腺 来源的 TISE 活性的异同的研究发现， TISE 对细胞免疫和体液免疫均有抑制作用， 对非特异 性免疫功能也有抑制作用， 可以有效地抑制皮肤移植的排斥反应， 还有抗 I 型变态反应和 III型变态反应的作用， 且TISE的活性没有种属特异性。 这提示申请人TISE作为一种新型 的免疫抑制药物的可能性。 002。
14、1 本发明的有益效果是 ： 0022 为减少异种来源的 TISE 用于人体引起过敏反应的可能， 运用超滤技术， 将小牛胸 腺来源的 TISE（TISE-c） 制备成了分子量较小、 且生物活性较强的低分子量 TISE-c（Low Molecular Weight TISE-c， LMW-TISE-c） 。在此基础上， 进一步采用微球菌核酸酶降解 LMW-TISE-c 及 RP-HPLC 分离， 结合酸水解， 最终纯化出一个分子量为 604.95D 的由 5 个氨 说 明 书 CN 103159831 A 4 3/6 页 5 基酸残基组成的多肽， 其结构为 N -AEWCP-C（Ala-Glu-T。
15、rp-Cys-Pro） 。本发明是多年 来首次从胸腺免疫抑制组分中获取结构确定的成分。该五肽来源于 TISE， 基于之前对 TISE 的活性研究， 本发明可用于制备免疫抑制药物。 附图说明 0023 图 1 为不同药物浓度对 ConA 刺激的小鼠脾淋巴细胞增殖的抑制作用。# 表示与 空白组相比， p0.01， 有显著性差异 ； * 表示与 Con A 组相比， p0.01， 有显著性差异。 0024 图2为不同药物浓度对LPS刺激的小鼠脾淋巴细胞增殖的抑制作用。 #表示与空 白组相比， p0.01， 有显著性差异 ； * 表示与 Con A 组相比， p0.01， 有显著性差异。 0025 图。
16、 3 为不同浓度药物对小鼠脾淋巴细胞的毒性。 0026 图 4 为不同药物浓度对 RAW264.7 细胞的活力的影响。* 表示与空白组相比， p0.01， 有显著性差异。 0027 图 5 为不同浓度药物对 LPS 刺激的 RAW264.7 细胞吞噬作用的影响。# 表示与空白 组相比， p0.05， 有差异， # 表示与空白组相比， p 0.01， 有显著性差异 ； * 表示与模型组 相比， p 0.05， 有差异， * 表示与模型组相比， p 0.01， 有显著性差异。 0028 图 6 为不同浓度药物在卵清蛋白 （OVA） 诱导的小鼠哮喘模型中肺组织学影响 （HE 染色） ； a. 空白组。
17、 （100） ， b. 模型组 （100） ， c. 地塞米松 （Dex） （100） ， d.TIPP10mg/kg （100） ， e.TIPP50mg/kg（100） 。 0029 图 7 为不同浓度药物对 OVA 诱导的小鼠哮喘模型肺泡灌洗液中 IL-5 含量的影响。 # 表示与空白组相比， p0.05， 有差异， # 表示与空白组相比， p 0.01， 有显著性差异 ； * 表 示与模型组相比， p 0.05， 有差异， * 表示与模型组相比， p 0.01， 有显著性差异。 具体实施方式 0030 下面结合附图和实施例对本发明进行进一步的阐述， 应该说明的是， 下述说明仅 是为了解。
18、释本发明， 并不对其内容进行限定。 0031 一种胸腺免疫抑制五肽 TIPP(thymic immunosuppressive pentapeptide)， 来源 于 LMW-TISE-c（低分子量牛胸腺免疫抑制提取物） ， 它是如 SEQ ID NO.1 所示的氨基酸序 列 ： 0032 Ala-Glu-Trp-Cys-Pro。 0033 以所述五肽为活性中心， 从其 N 端或 C 端添加 L- 氨基酸、 D- 氨基酸、 羟基氨基酸、 甲基化氨基酸或杂环氨基酸中的一个或多个得到的多肽。 0034 所述杂环氨基酸为色氨酸、 组氨酸或脯氨酸。 0035 所述五肽的 N 端和 C 端连接成环得到的。
19、环肽衍生物。 0036 所述五肽的N端经乙酰化、 甲酰化或C端经氨酰化或酯化得到的化合物， 较所述五 肽的生物活性、 半衰期、 稳定性等有了很大提高。 0037 所述烷基化为甲基化、 乙基化、 丙基化或丁基化。 0038 所述酯化为与甲醇、 乙醇、 丁醇、 或己醇酯化反应。 0039 一种免疫抑制药物， 其活性成分包括上述五肽、 多肽、 环肽衍生物或化合物在制备 免疫抑制药物中的应用。 说 明 书 CN 103159831 A 5 4/6 页 6 0040 上述五肽、 多肽、 环肽衍生物或化合物在制备免疫抑制药物中的应用。 0041 实施例 1 不同浓度 TIPP 对小鼠脾淋巴细胞增殖的抑制作。
20、用 0042 6 8 周雄性 Balb/c 小鼠颈椎脱臼处死， 75% 酒精浸泡 5min， 取出小鼠置于无菌 皿， 左腹侧朝上。在小鼠左腹侧中部剪开小口， 撕开皮肤， 暴露腹壁， 可见红色长条状脾脏。 在脾脏下侧提起腹膜， 剪开后上翻， 暴露脾脏， 用镊子提起脾脏， 眼科剪分离脾脏下面的结 缔组织， 取出脾脏。放入培养皿中， 用 Hank s 液 5mL 冲洗两次。将脾脏放置不锈钢网 （200 目） 上， 用注射器针芯轻轻研压脾脏， 并用 Hank s 液 7-8mL 冲洗， 收集细胞悬液于 10mL 无菌 离心管中， 1000r/min离心10min， 弃上清， 加红细胞裂解液8mL充分打。
21、匀， 静置5min， 1000r/ min 离心 10min， 弃上清， 再用 Hank s 液 8mL 洗一次。最终用 RPMI-1640 培养基 （含 10% 胎 牛血清） 5mL 重悬细胞， 计数， 调整细胞浓度为 2106个 /mL。接种于 96 孔板， 100L/ 孔， 并设调零孔。分别用刀豆蛋白 Con A（终浓度 5g/mL） 及脂多糖 （LPS， 终浓度 10g/mL） 刺激细胞使其增殖。分组情况为 ： 空白组、 单纯 Con A 或 LPS 刺激组、 环孢菌素 A（CsA） 对 照组 （Con A 或 LPS 刺激， CsA 浓度为 0.1mol/L） 、 不同浓度 TIPP。
22、 作用组 （Con A 或 LPS 刺激， TIPP 终浓度分别为 50mol/L、 100mol/L、 200mol/L、 300mol/L、 400mol/L、 500mol/L） ， 每组设 5 个复孔。37， 5%CO2培养 68h 后， 每孔加 5mg/mLMTT20L， 于 37、 5%CO2条件下继续培养 4h 后， 3000r/min 离心 10min， 上清用 1mL 注射器小心吸除， 每孔加 DMSO150L， 震荡 10min， 酶标仪 570nm 检测 OD 值， 以 630nm 为参考波长。 0043 结果如图 1、 图 2 所示， Con A 和 LPS 可以引起脾。
23、淋巴细胞的显著增殖 ； 而 CsA 作为 T 细胞的一种强效抑制剂可以显著抑制由 Con A 引起的脾淋巴细胞的增殖而对 LPS 引起的 脾淋巴细胞的增殖无明显作用 ； TIPP 对 Con A 及 LPS 诱导的脾淋巴细胞的增殖均表现出抑 制作用， 并呈剂量依赖性， 且对 Con A 引起的脾淋巴细胞增殖的抑制作用更明显。 0044 实施例 2 不同浓度药物对小鼠脾淋巴细胞的毒性 0045 6 8 周雄性 Balb/c 小鼠颈椎脱臼处死， 75% 酒精浸泡 5min， 取出小鼠置于无菌 皿， 左腹侧朝上。在小鼠左腹侧中部剪开小口， 撕开皮肤， 暴露腹壁， 可见红色长条状脾脏。 在脾脏下侧提起。
24、腹膜， 剪开后上翻， 暴露脾脏， 用镊子提起脾脏， 眼科剪分离脾脏下面的结 缔组织， 取出脾脏。放入培养皿中， 用 Hank s 液 5mL 冲洗两次。将脾脏放置不锈钢网 （200 目） 上， 用注射器针芯轻轻研压脾脏， 并用 Hank s 液 7-8mL 冲洗， 收集细胞悬液于 10mL 无菌 离心管中， 1000r/min离心10min， 弃上清， 加红细胞裂解液8mL充分打匀， 静置5min， 1000r/ min 离心 10min， 弃上清， 再用 Hank s 液 8mL 洗一次。最终用 RPMI-1640 培养基 （含 10% 胎 牛血清） 5mL 重悬细胞， 计数， 调整细胞浓度。
25、为 1108个 /mL， 接种于 96 孔板， 100L/ 孔， 并设调零孔。加入不同浓度 TIPP， 每个浓度设 5 个复孔。各浓度依次为 ： 0、 0.0064mol/ L、 0.032mol/L、 0.16mol/L、 0.8mol/L、 4mol/L、 20mol/L、 100mol/L、 500mol/ L。37、 5%CO2细胞培养箱中培养 68h。加 5mg/mL MTT20L， 于 37、 5%CO2继续培养 4h 后 3000r/min 离心 10min， 上清用 1mL 注射器小心吸除， 每孔加 DMSO150L， 震荡 10min， 酶标仪 570nm 检测 OD 值， 。
26、以 630nm 为参考波长。存活率 =（试验组 OD570nm/ 正常组 OD570nm） 100%。 0046 结果如图 3 所示， 脾淋巴细胞与 TIPP 共培养 68h 后， 存活率与未加 TIPP 组相比无 明显差别， 即 TIPP 对脾淋巴细胞无明显的细胞毒性。 0047 实施例 3 不同浓度 TIPP 对 RAW264.7 细胞增殖的抑制作用 说 明 书 CN 103159831 A 6 5/6 页 7 0048 取 DMEM 培养基 （10%FBS） 培养的对数生长期的 RAW264.7 细胞， 调整细胞密度为 2104个 /mL， 接种于 96 孔板上， 每孔体积 100L, 。
27、置于 37、 5%CO2条件下培养 2h 使细胞 贴壁， 加入不同浓度的TIPP （终浓度为25g/mL、 50g/mL、 100g/mL、 200g/mL、 400g/ mL， 每个浓度设5个复孔） ， 以地塞米松 （Dex， 终浓度为5g/mL） 为阳性对照， 继续培养48h。 每孔加 5mg/mL MTT20L， 于 37、 5%CO2条件下继续培养 4h 后， 3000r/m 离心 10min， 上清 用1mL注射器小心吸除， 每孔加DMSO150L， 震荡10min， 酶标仪570nm检测OD值， 以630nm 为参考波长。 0049 结果如图 4 所示。TIPP 在浓度低于 50g。
28、/mL 时， 对 RAW264.7 细胞增殖抑制较小 ； 而在 100g/mL 及以上时对 RAW264.7 细胞增殖抑制作用明显。根据细胞毒性分级表所示， 当细胞相对增值率在大于 100% 或在 75% 99% 时， 其细胞毒性分级为 0 级或 1 级， 被认为 没有细胞毒性， 当细胞相对增值率在 50% 74% 时， 其细胞毒性分级为 2 级， 有轻度毒性。 由图 4 可得， 在 TIPP 浓度为 200g/mL 时， 细胞活力仍达到约 85%， 可以认为 TIPP 在浓度 200g/mL 时对 RAW264.7 没有细胞毒性 ； 但 TIPP400g/mL 时， 细胞毒性达到 2 级 ,。
29、 有 轻度毒性。 0050 实施例 4 不同浓度药物对 LPS 刺激的 RAW264.7 细胞吞噬作用的影响 0051 取对数生长期的 RAW264.7 细胞， 接种于 96 孔板上， 每孔加细胞悬液 （2105个 /mL） 100L， 置 37、 5 CO2培养箱过夜培养， 弃上清液， 换用 2.5%FBS 的 DMEM 培养液， 100L/ 孔。分组， 空白对照组 ： 加入 2.5%FBS 的 DMEM 培养液 100L ； 模型组 ： 加入 LPS， 使 其终浓度为 1g/mL ； Dex 组 ： 加入 Dex（终浓度是 5g/mL） 和 LPS（终浓度为 1g/mL） ； 给 药组 ：。
30、 TIPP（终浓度分别为 25g/mL、 50g/mL、 100g/mL、 200g/mL、 400g/mL） 和 LPS （终浓度为 1g/mL） 各 50L， 每组均设 5 个复孔。37、 5 CO2培养箱中培养 24h 后， 弃 上清液， 加入 0.1中性红溶液 100L， 37、 5 CO2孵育 1h， 弃中性红， 用预温的 PBS 洗 3 遍， 每次 200L， 并扣干。加入醋酸 - 乙醇 （体积比 1 ： 1） 细胞溶解液 200L/ 孔， 4静置 过夜， 酶标仪 490nm 处测 OD 值。 0052 结果如图 5 所示。与空白组相比， LPS 组 OD 值与空白组相比有显著性差。
31、异， 表明 LPS 可以增强 RAW264.7 细胞的吞噬作用。与 LPS 组相比， Dex 组及 50、 100、 200、 400g/mL 的 TIPP 均能抑制 LPS 刺激的 RAW264.7 吞噬中性红的活性， 且在 TIPP 浓度为 100g/mL 时 OD值与空白组水平相当， 表明TIPP浓度为100g/mL时就可完全抑制因LPS诱导的巨噬细 胞的吞噬作用。 0053 实施例 5TIPP 对 OVA 诱导的小鼠哮喘模型的作用 0054 SPF 级雌性 Balb/c 小鼠， 5-6 周， 随机分成 6 组， 每组 12 只， 分别为空白组、 模型 组、 地塞米松对照组 （3mg/k。
32、g） 、 TIPP 低剂量组 （2mg/kg） 、 TIPP 中剂量组 （10mg/kg） 、 TIPP 高 剂量组 （50mg/kg） 。同一条件饲养， 模型组及给药组于 1、 7、 14 天腹腔注射 （i.p） 含 50g OVA（sigma， Grade V） 的 Alu-Gel-S（SERVA Electrophoresis GmbH） 0.2mL， 空白组 i.p 生理盐水。从第 28 天开始， 模型组及给药组用 2mg/mL 的 OVA 溶液 50L 滴鼻激发， 空白组 用生理盐水滴鼻。滴鼻前 1h， 空白组皮下注射 （i.h） 生理盐水， 模型组 i.h 生理盐水 , 地塞 米松。
33、组 i.h 地塞米松 (Dex， 3mg/kg)， TIPP 低、 中、 高剂量组分别 i.h TIPP2mg/kg、 10mg/kg、 50mg/kg。滴鼻时， 用乙醚麻醉小鼠至抓起小鼠其身体无力下垂， 用生理盐水 50L 或 2mg/ mL 的 OVA 溶液 50L 滴鼻， 使溶液随小鼠自然呼吸吸入。在第 29、 30、 31、 32、 33 天重复滴鼻 说 明 书 CN 103159831 A 7 6/6 页 8 激发， 建立小鼠哮喘模型。末次激发后 24-48h 内取材。拉颈处死小鼠， 仰卧位固定， 75% 乙 醇消毒颈部皮肤， 打开胸腔行气管插管。结扎左肺， 右肺用冷的 PBS0.4。
34、mL 进行肺泡灌洗， 确 保肺均匀的膨胀， 每次缓慢注入后再缓慢回抽以回收灌洗液于 1.5mLEP 管中， 重复 2 次， 确 保回收率达到 80% 90%。4、 650g 离心 5min。取上清分装， -80保存， 用于细胞因子 检测。取左肺， 用 4% 甲醛溶液固定， 切片， HE 染色。 0055 结果如图 6、 图 7 所示。对各组小鼠肺组织切片进行 HE 染色， 与正常组相比， 模型 组黏膜充血水肿， 黏膜层增厚， 并有炎性细胞浸润， 管腔内充满大量黏液、 支气管壁周围有 炎症细胞浸润。 而Dex及TIPP给药组炎症明显减轻， 支气管壁周围仅有少量炎性细胞浸润。 表明 Dex 及 T。
35、IPP 可抑制哮喘小鼠气道炎症， 抑制炎性细胞在气道的浸润。 0056 图 7 为 TIPP 对哮喘小鼠肺泡灌洗液中 IL-5 水平的影响。IL-5 是 Th2 类细胞因 子， 与哮喘的发生发展密切相关， 它可促进嗜酸性粒细胞分化、 成活和募集至气道并辅助 B 淋巴细胞产生抗体。由图 7 可以看出， 与空白组相比， 模型组 IL-5 水平明显升高， 而 Dex 和 TIPP 均可明显降低肺泡灌洗液中 IL-5 的水平。 0057 上述虽然结合附图对本发明的具体实施方式进行了描述， 但并非对本发明保护范 围的限制， 在本发明的技术方案的基础上， 本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做 出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。 说 明 书 CN 103159831 A 8 1/1 页 9 0001 序 列 表 CN 103159831 A 9 1/5 页 10 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 103159831 A 10 2/5 页 11 图 3 图 4 说 明 书 附 图 CN 103159831 A 11 3/5 页 12 图 5 说 明 书 附 图 CN 103159831 A 12 4/5 页 13 图 6 说 明 书 附 图 CN 103159831 A 13 5/5 页 14 图 7 说 明 书 附 图 CN 103159831 A 14 。