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1、(10)申请公布号 CN 103146611 A (43)申请公布日 2013.06.12 CN 103146611 A *CN103146611A* (21)申请号 201310080673.8 (22)申请日 2013.03.12 C12N 1/20(2006.01) (71)申请人 通威股份有限公司 地址 610041 四川省成都市高新区二环路南 四段 11 号 (72)发明人 薛爱琴 罗国强 苏艳秋 顾继锐 (74)专利代理机构 云南派特律师事务所 53110 代理人 龚笋根 (54) 发明名称 一种复合型乳酸菌微生态制剂的制备方法 (57) 摘要 本发明提出了一种复合型乳酸菌微生态制。
2、剂 的制备方法， 属于乳酸菌发酵领域。它以养殖动 物、 养殖水体和底泥为菌源分离出乳酸菌菌株 ； 然后将分离出的乳酸菌菌株进行纯化选育出 2-5 株溶钙圈大， 生长快， 活力强的乳酸菌菌株 ； 接着 将进行纯化选育后选育出的乳酸菌菌株扩大培 养， 制备复合种子液 ； 最后将复合种子液接种发 酵即得复合型乳酸菌微生态制剂， 与现有技术相 比， 本发明的有益效果是它是一种培养设备及操 作都很简单， 而且储存时间和单一菌株发酵水剂 相比很稳定的乳酸菌微生态制剂的制备方法。 (51)Int.Cl. 权利要求书 2 页 说明书 7 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求。
3、书2页 说明书7页 (10)申请公布号 CN 103146611 A CN 103146611 A *CN103146611A* 1/2 页 2 1. 一种复合型乳酸菌微生态制剂的制备方法， 其特征在于 ： 它以养殖动物、 养殖水体 和底泥为菌源分离出乳酸菌菌株 ； 然后将分离出的乳酸菌菌株进行纯化选育出 2-5 株溶钙 圈大， 生长快， 活力强的乳酸菌菌株 ； 接着将进行纯化选育后选育出的乳酸菌菌株扩大培 养， 制备复合种子液 ； 最后将复合种子液接种发酵即得复合型乳酸菌微生态制剂。 2. 根据权利要求 1 所述的一种复合型乳酸菌微生态制剂的制备方法， 其特征在于 ： 所 述纯化选育出的乳酸。
4、菌菌株为四株。 3. 根据权利要求 2 所述的一种复合型乳酸菌微生态制剂的制备方法， 其特征在于 ： 所 述的乳酸菌菌株进行纯化采用灭菌的 MRS 液体培养基， 进行富集培养， 将富集的菌液涂于 MRS 斜面上， 分离出在含碳酸钙的 MRS 固体培养基上溶钙圈大的菌株若干株， 经过两次分离 纯化后待用 ； 将分离纯化后的若干株乳酸菌菌株分别接种于灭菌的 MRS 液体培养基中， 在 30 -37温度下培养 46-50 小时后吸取菌液在 5000rpm 下离心 10-15min， 弃去上清液保 留菌体， 向菌体中注入 95% 的生理盐水得到稀释菌液， 然后用紫外分光光度计测定稀释菌 液OD543m。
5、n的吸光度， 当所有稀释菌液的吸光度值相同时， 把所有的稀释菌液按相同的体积比 3-5% 分别接种于灭菌的 MRS 液体培养基中， 30 -37下静置培养 24-48h， 然后用紫外分 光光度计测定稀释菌液的 OD543nm， 选出的 OD543nm测定值高的菌株 ； 然后把这些菌株的培养液 在室温下继续放置 10 天， 后用 MRS 固体培养基进行平板计数， 培养时间为 24-48h, 温度为 30 -37， 选出计数结果高的菌株， 最终选出 4 株乳酸菌菌株分别保种。 4. 根据权利要求 3 所述的一种复合型乳酸菌微生态制剂的制备方法， 其特征在于 ： 所 述 MRS 液体培养基的重量份组。
6、成为 ： 大豆蛋白胨 0.5-1.5 份， 牛肉膏 0.5-1.5 份， 酵母浸粉 0.2-0.6 份， 葡萄糖 1.5-2.5 份， 磷酸氢二钾 0.1-0.3 份， 乙酸钠 0.3-0.7 份， 柠檬酸三铵 0.1-0.3 份， 硫酸镁 0.05-0.06 份， 硫酸锰 0.02-0.03 份， 吐温 0.05-0.15 份， 蒸馏水 99-101 份。 5. 根据权利要求 4 所述的一种复合型乳酸菌微生态制剂的制备方法， 其特征在于 ： 所 述的含碳酸钙的 MRS 固体培养基是在 MRS 液体培养基中按蒸馏水的重量加入 1.5-1.8% 的 琼脂粉和 1-1.2% 的碳酸钙。 6. 根据。
7、权利要求 2 所述的一种复合型乳酸菌微生态制剂的制备方法， 其特征在于 ： 所 述的将进行纯化选育后选出的四株乳酸菌菌株扩大培养， 制备复合种子液为 ： 将四株来源 不同的乳酸菌菌株进行平板划线， 挑取单菌落接入灭菌的 MRS 液体培养基中进行扩大培 养， 在30-37下培养36h-48h， 然后将四种培养液按体积比例10%， 30%， 30%， 30%混合， 然 后接种于灭菌的MRS液体培养基中， 接种量为5-20%， 在30-37下混合培养24-48h获得 复合种子液。 7. 根据权利要求 6 所述的一种复合型乳酸菌微生态制剂的制备方法， 其特征在于 ： 所 述平板划线所用的培养基为 MR。
8、S 固体培养基。 8. 根据权利要求 2 所述的一种复合型乳酸菌微生态制剂的制备方法， 其特征在于 ： 所述的将复合种子液接种发酵为 ： 将复合种子液接种到液体发酵培养基中， 待搅拌均匀后 密封在室温下发酵 3-5 天， 在密封发酵过程中每天搅拌两次， 并释放气体， 同时在发酵过 程中抽样 1-2 次， 用平板计数法观察菌体的生长及杂菌率， 并且测定 pH 值， 当活菌数到达 5108CFU/mL,杂菌率5%， pH值在3.0-4.0的条件下停止发酵， 即得复合型乳酸菌微生态 制剂。 权 利 要 求 书 CN 103146611 A 2 2/2 页 3 9. 根据权利要求 8 所述的一种复合型。
9、乳酸菌微生态制剂的制备方法， 其特征在于 ： 所 述液体发酵培养基的重量份组成为 ： 蔗糖 0.5-1 份， 酵母膏 0.2-0.5 份， 乙酸钠 0.2-0.5 份， 磷酸氢二钾 0.05-1 份， 柠檬酸三铵 0.1-0.5 份， 硫酸镁 0.058-0.065 份、 硫酸锰 0.020-0.025 份， 吐温 0.05-0.1 份， 蒸馏水 99-101 份。 10. 根据权利要求 9 所述的一种复合型乳酸菌微生态制剂的制备方法， 其特征在于 ： 所 述液体发酵培养基的重量份组成为 ： 蔗糖0.8份， 酵母膏0.4份， 乙酸钠0.3份， 磷酸氢二钾 0.5 份， 柠檬酸三铵 0.3 份，。
10、 硫酸镁 0.06 份、 硫酸锰 0.023 份， 吐温 0.08 份， 蒸馏水 100 份。 权 利 要 求 书 CN 103146611 A 3 1/7 页 4 一种复合型乳酸菌微生态制剂的制备方法 技术领域 0001 本发明涉及乳酸菌发酵领域， 特别涉及一种复合型乳酸菌微生态制剂的制备方 法。 背景技术 0002 随着水产养殖业的迅猛发展， 乳酸菌制剂以其天然、 无毒、 无副作用、 无污染、 无残 留、 安全可靠的优越性越来越受到重视。作为一种有益的净化水质的 “生物修复剂” ， 乳酸 菌制剂在水产养殖业的应用越来越受到重视， 其应用于水产养殖业主要集中于拌料投喂、 发酵饲料及作为 EM。
11、 菌主导菌在水体泼洒。其中拌料投喂、 发酵饲料研究集中于乳酸菌在水 产动物肠胃栖息， 及调节动物肠道菌群结构和对饲料结构的改变。泼洒调节水质与乳酸菌 可以调节养殖水体、 改善养殖环境， 抑制病原菌， 抗病害， 提高免疫力、 促进动物生长有着密 切的关系。这些应用与乳酸菌以下特性关系密切 ： 首先， 乳酸菌能很好适应水产养殖环境。 水产养殖在养殖期间环境温度变动范围为 20-35、 盐度变动范围为 0-38、 pH 值变动范围 为 6.9-8.7， 在这三者变动范围内乳酸菌均能较好生长。其次， 乳酸菌大部分的菌种属耐氧 性厌氧菌， 在无氧、 低氧或高氧条件下均生长， 不仅不与养殖动物竞争氧气， 。
12、而且还能在溶 氧量较低的水体中下层大量生长繁殖， 抑制病原菌滋生。 另外， 乳酸菌在使用上不受时间限 制， 暴雨、 阴天、 晴天、 高温条件下都可以使用。 此外， 乳酸菌作为一种最早使用的益生菌， 与 其它菌种相比， 其菌体和代谢产物都为有益物， 无毒素， 实际应用中具有较高的安全性。这 些乳酸菌在水产上的应用上的这些优势使得乳酸菌在水产方面有着广泛的应用和研究。 0003 但是， 目前大部分的乳酸菌类微生态制剂包被的产品价格昂贵， 使用成本非常高 ； 而乳酸菌类微生态制剂水剂产品相对较便宜， 但是大多数产品很不稳定， 活菌数较低， 储存 周期很短， 而且运输成本较高 ； 固体和液体乳酸菌类微。
13、生态制剂产品目前大多数采用发酵 罐进行发酵， 一方面生产工艺要求严格， 需要专业的技术人员才能操作 ； 另一方面， 发酵罐 的成本较高。 发明内容 0004 本发明提出了一种复合型乳酸菌微生态制剂的制备方法， 解决了现有技术中的不 足， 是一种培养设备及操作都很简单， 而且储存时间和单一菌株发酵水剂相比很稳定的乳 酸菌微生态制剂的制备方法。 0005 本发明的技术方案是这样实现的 ： 0006 一种复合型乳酸菌微生态制剂的制备方法， 以养殖动物、 养殖水体和底泥为菌源， 通过在 MRS 液体培养基中富集后涂布固体 MRS 培养基分离出乳酸菌菌株 ； 然后将分离出的 乳酸菌菌株进行纯化选育出 2。
14、-5 株溶钙圈大， 生长快， 活力强的乳酸菌菌株 ； 接着将进行纯 化选育后选育出的乳酸菌菌株扩大培养， 制备复合种子液 ； 最后将复合种子液接种发酵即 得复合型乳酸菌微生态制剂。 0007 进一步的， 所述纯化选育出的乳酸菌菌株为四株。 说 明 书 CN 103146611 A 4 2/7 页 5 0008 其中， 所述的乳酸菌菌株进行纯化采用灭菌的 MRS 液体培养基， 进行富集培养， 将富集的菌液涂于 MRS 斜面上， 分离出在含碳酸钙的 MRS 固体培养基上溶钙圈大的菌株 若干株， 经过两次分离纯化后待用 ； 将分离纯化后的若干株乳酸菌菌株分别接种于灭菌的 MRS 液体培养基中， 在 。
15、30 -37温度下培养 46-50 小时后吸取菌液在 5000rpm 下离心 10-15min， 弃去上清液保留菌体， 向菌体中注入 95% 的生理盐水得到稀释菌液， 然后用紫外 分光光度计测定稀释菌液OD543mn的吸光度， 当所有稀释菌液的吸光度值相同时， 一般吸光度 在 0.8-1.2 之间时， 把所有的稀释菌液按相同的体积比 3-5% 分别接种于灭菌的 MRS 液体培 养基中， 30 -37下静置培养 24-48h， 然后用紫外分光光度计测定稀释菌液的 OD543nm， 选 出 8-12 株的 OD543nm测定值高的菌株， 这个 OD543nm测定值在 0.5-1.0 之间 ； 然后。
16、把这些菌株 的培养液在室温下继续放置10天， 后用MRS固体培养基进行平板计数， 培养时间为24-48h, 温度为 30 -37， 选出计数结果高的菌株， 最终选出四株乳酸菌菌株分别保种， 一般计数 结果的活菌数在 109CFU/mL 都可以进行保种。 0009 上述 MRS 液体培养基的重量份组成为 ： 大豆蛋白胨 0.5-1.5 份， 牛肉膏 0.5-1.5 份， 酵母浸粉 0.2-0.6 份， 葡萄糖 1.5-2.5 份， 磷酸氢二钾 0.1-0.3 份， 乙酸钠 0.3-0.7 份， 柠檬酸三铵 0.1-0.3 份， 硫酸镁 0.05-0.06 份， 硫酸锰 0.02-0.03 份， 。
17、吐温 0.05-0.15 份， 蒸 馏水 99-101 份。 0010 上述的含碳酸钙的 MRS 固体培养基是在 MRS 液体培养基中按蒸馏水的重量加入 1.5-1.8% 的琼脂粉和 1-1.2% 的碳酸钙。 0011 其中， 所述的将进行纯化选育后选出的四株乳酸菌菌株扩大培养， 制备复合种子 液为 ： 将四株来源不同的乳酸菌菌株进行平板划线， 进行平板划线所用的培养基为 MRS 固 体培养基， 灭菌后冷却至 44-46在超净台中倒入平板中， 待平板冷却凝固后按 10 倍梯度 稀释法进行平板涂布计数， 并观察杂菌。挑取单菌落接入灭菌的 MRS 液体培养基中进行扩 大培养， 在 30 -37下培。
18、养 36h-48h， 然后将四种培养液按体积比例 10%， 30%， 30%， 30% 混合， 然后接种于灭菌的 MRS 液体培养基中， 接种量为 5-20%， 在 30 -37下混合培养 24-48h 获得复合种子液。 0012 其中， 所述的将复合种子液接种发酵为 ： 将复合种子液接种到液体发酵培养基中， 待搅拌均匀后密封在室温下发酵 3-5 天， 在密封发酵过程中每天搅拌两次， 并释放气体， 同 时在发酵过程中抽样1-2次， 用平板计数法观察菌体的生长及杂菌率， 并且测定pH值， 当活 菌数到达 5108CFU/mL, 杂菌率 5%， pH 值在 3.0-4.0 的条件下停止发酵， 即得。
19、复合型乳 酸菌微生态制剂。 0013 上述的液体发酵培养基的重量份组成为 ： 蔗糖 0.5-1 份， 酵母膏 0.2-0.5 份， 乙酸 钠 0.2-0.5 份， 磷酸氢二钾 0.05-1 份， 柠檬酸三铵 0.1-0.5 份， 硫酸镁 0.058-0.065 份、 硫 酸锰 0.020-0.025 份， 吐温 0.05-0.1 份， 蒸馏水 99-101 份。 0014 进一步的， 上述的液体发酵培养基的重量份组成为 ： 蔗糖0.8份， 酵母膏0.4份， 乙 酸钠 0.3 份， 磷酸氢二钾 0.5 份， 柠檬酸三铵 0.3 份， 硫酸镁 0.06 份、 硫酸锰 0.023 份， 吐温 0.0。
20、8 份， 蒸馏水 100 份。 0015 上述液体发酵培养基的制备方法为 ： 将酵母膏按比例加入自来水中蒸煮， 待水开 后继续蒸煮 5 分钟， 后加入余下的成分， 溶解完全后倒入消毒的塑料桶中冷却待用。 0016 与现有技术相比， 本发明的有益效果是 ： 说 明 书 CN 103146611 A 5 3/7 页 6 0017 本发明从水产养殖动物肠道、 养殖水体和底泥中筛选乳酸菌， 通过不断地纯化， 筛 选到生长速度高， 产酸能力强， 温度适应范围宽的多株菌株进行复配发酵， 发酵液含有比单 菌株发酵更多的代谢产物及风味物质， 通过复配发酵， 菌株之间互相影响， 形成的菌液稳定 性更高， 活性更。
21、好， 储存时间更长。通过养殖试验发现， 复合发酵液拌料对鱼类具有较好的 诱食作用， 同时提高养殖动物的免疫力。此外， 用该复合乳酸菌发酵液泼洒养殖水体， 发现 对水质指标具有明显的改善作用， 泼洒复合发酵液的氨氮的降低幅度是 35.56%， 而对照组 的氨氮增加了 45.49%， 而泼洒复合发酵液的亚硝酸盐的降低幅度是对照组的 2 倍。 0018 （1） 采用由多种不同来源形态不同的乳酸菌复配而成， 形成了具有多样性、 复杂而 又稳定的乳酸菌群落， 各个菌株能互利共存， 优势互补， 协同发挥作用， 功能强大， 在养殖水 体中使用对水质指标的改善效果更好， 是单一的乳酸菌制剂所无法实现的。 00。
22、19 （2） 本发明最大的特点是采用了简易的发酵设备， 简易的发酵设备不但可以节约 成本， 而且操作简单。本发明没有采用目前广泛使用的发酵罐， 而只是使用了塑料桶来发 酵， 没有复杂的发酵工序及操作说明， 不但可以节约购买发酵罐的成本， 而且在发酵过程中 不需要加热， 节约了电费 ； 另外， 该发酵工艺操作简单， 对专业性操作知识要求较低， 可以很 好的为所有养殖用户所用。 0020 （3） 本发明的产品为水剂产品， 但具有固体包被乳酸菌产品的稳定性且不需要喷 雾干燥、 包被等复杂工序及材料， 在一定程度上节约了成本。 0021 （4） 本发明产品的代谢产物更加丰富。 乳酸菌不是一个微生物分类。
23、学上的名称， 细 菌分类有数百个属， 不同属甚至不同菌株之间的代谢产物都有较大的差异， 所以共同发酵 能够产生更加丰富的代谢产物， 丰富的酶系、 风味物质、 有机酸、 乳酸菌素等代谢产物使得 产品的味道更好， 营养更丰富。 丰富的风味物质及有机酸使得在拌料使用时诱食效果更强， 丰富的酶系可降解单一菌株没法降解的大分子蛋白质及产生更多的益生元， 对养殖动物肠 道的改善效果更佳。 0022 （5） 目前水剂乳酸菌制剂的最大的缺点是产品不稳定， 长时间储存有益活菌数会 迅速下降， 导致使用效果不明显。而本产品的乳酸菌经过复配联合发酵， 菌株之间互相影 响， 使得产品更加稳定， 和一般的单菌株发酵液相。
24、比， 储存时间至少延长 30 天。 0023 （6） 功能更全面。 根据资料及研究显示， 乳酸菌在水产养殖中使用具有提高机体免 疫力， 促进养殖动物生长， 抑制有害菌繁殖， 促进藻类生长， 降低氨氮亚盐， 改善水质， 降低 水体有机物积累， 减少耗氧的功能， 但是一般来说单一的菌株发酵液只能发挥其中的一种 功能， 而复配产品菌株多， 可以全面的发挥这些功能。 具体实施方式 0024 下面对本发明中的技术方案进行清楚、 完整地描述， 显然， 所描述的实施例仅仅是 本发明的其中的几个实施例， 而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例， 本领域普通 技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他。
25、实施例， 都属于本发明保护的范 围。 0025 实施例 1 ： 0026 一种复合型乳酸菌微生态制剂的制备方法， 以养殖动物、 养殖水体和底泥为菌源， 通过在 MRS 液体培养基中富集后涂布固体 MRS 培养基分离出乳酸菌菌株 ； 然后将分离出的 说 明 书 CN 103146611 A 6 4/7 页 7 乳酸菌菌株进行纯化选育出三株溶钙圈大， 生长快， 活力强的乳酸菌菌株 ； 接着将进行纯化 选育后选育出的乳酸菌菌株扩大培养， 制备复合种子液 ； 最后将复合种子液接种发酵即得 复合型乳酸菌微生态制剂 ： 0027 （1） 以养殖动物、 养殖水体和底泥为菌源， 通过在 MRS 液体培养基中富。
26、集后涂布固 体 MRS 培养基分离出乳酸菌菌株 ； 0028 （2） 将分离出的乳酸菌菌株进行纯化选育出三株溶钙圈大， 生长快， 活力强的乳酸 菌菌株 ： 0029 乳酸菌菌株进行纯化采用灭菌的 MRS 液体培养基， 进行富集培养， 将富集的菌液 涂于MRS斜面上， 分离出在含碳酸钙的MRS固体培养基上溶钙圈大的菌株， 经过两次分离纯 化后选出 18 株待用 ； 将分离纯化后的 18 株乳酸菌菌株分别接种于灭菌的 MRS 液体培养基 中， 在 32温度下培养 46 小时后吸取 5ml 菌液在 5000rpm 下离心 15min， 弃去上清液保留 菌体， 向菌体中注入 95% 的生理盐水得到稀释。
27、菌液， 然后用紫外分光光度计测定稀释菌液 OD543mn的吸光度， 当所有稀释菌液的吸光度值相同时， 当吸光度在 1.1 时， 把所有的稀释菌 液按相同的体积比例 3% 分别接种于灭菌的 MRS 液体培养基中， 32下静置培养 24h， 然后 用紫外分光光度计测定稀释菌液的 OD543nm， 选出 10 株的 OD543nm测定值高的菌株， 这个 OD543nm 测定值在 0.8 时 ； 然后把这些菌株的培养液在室温下继续放置 10 天， 后用 MRS 固体培养基 进行平板计数， 培养时间为 46h, 温度为 30， 选出计数结果最高的菌株， 最终选出三株乳 酸菌菌株分别保种 ； 0030 上。
28、述所用的 MRS 液体培养基的组成为 ： 大豆蛋白胨 1g， 牛肉膏 1g， 酵母浸粉 0.5g， 葡萄糖 2g， 磷酸氢二钾 0.2g， 乙酸钠 0.5g， 柠檬酸三铵 0.2g， 硫酸镁 0.058g， 硫酸锰 0.025g， 吐温 0.1g， 蒸馏水 100g。 0031 上述的含碳酸钙的 MRS 固体培养基是在 MRS 液体培养基中按蒸馏水的重量加入 1.5% 的琼脂粉和 1.0% 的碳酸钙 ； 即 ： 大豆蛋白胨 1g， 牛肉膏 1g， 酵母浸粉 0.5g， 葡萄糖 2g， 磷酸氢二钾 0.2g， 乙酸钠 0.5g， 柠檬酸三铵 0.2g， 硫酸镁 0.058g， 硫酸锰 0.025。
29、g， 吐温 0.1g， 蒸馏水 100g、 琼脂粉 1.5g、 碳酸钙 1.0g。 0032 （3） 将进行纯化选育后选育出的乳酸菌菌株扩大培养， 制备复合种子液 ： 0033 将三株来源不同的乳酸菌菌株进行平板划线， 进行平板划线所用的培养基为 MRS 固体培养基， 灭菌后冷却至 45在超净台中倒入平板中， 待平板冷却凝固后按 10 倍梯度稀 释法进行平板涂布计数， 并观察杂菌。挑取单菌落接入灭菌的 MRS 液体培养基中进行扩大 培养， 在 32下培养 36h， 然后将三种培养液按体积比例 20%， 40%， 40% 混合， 然后接种于灭 菌的 MRS 液体培养基中， 接种量为 10%， 在。
30、 36下混合培养 46h 获得复合种子液 ； 0034 （4） 将复合种子液接种发酵即得复合型乳酸菌微生态制剂 ： 0035 将复合种子液接种到液体发酵培养基中， 待搅拌均匀后密封在室温下发酵 3.5 天， 在密封发酵过程中每天搅拌两次， 并释放气体， 同时在发酵过程中抽样 2 次， 用平板计 数法观察菌体的生长及杂菌率， 并且测定pH值， 当活菌数到达5108CFU/mL,杂菌率5%， pH 值在 3.5 的条件下停止发酵， 即得复合型乳酸菌微生态制剂。 0036 上述的液体发酵培养基的组成为 ： 蔗糖 0.5g， 酵母膏 0.3g， 乙酸钠 0.2g， 磷酸氢二 钾 0.08g， 柠檬酸三。
31、铵 0.2g， 硫酸镁 0.06g、 硫酸锰 0.02g， 吐温 0.08g， 蒸馏水 100g。 0037 上述液体发酵培养基的制备方法为 ： 先将酵母膏加入自来水中蒸煮， 待水开后继 说 明 书 CN 103146611 A 7 5/7 页 8 续蒸煮 5 分钟， 后加入余下的成分， 溶解完全后倒入消毒的塑料桶中冷却待用。 0038 实施例 2 ： 0039 一种复合型乳酸菌微生态制剂的制备方法， 以养殖动物、 养殖水体和底泥为菌源， 通过在 MRS 液体培养基中富集后涂布固体 MRS 培养基分离出乳酸菌菌株 ； 然后将分离出的 乳酸菌菌株进行纯化选育出四株溶钙圈大， 生长快， 活力强的乳。
32、酸菌菌株 ； 接着将进行纯化 选育后选育出的乳酸菌菌株扩大培养， 制备复合种子液 ； 最后将复合种子液接种发酵即得 复合型乳酸菌微生态制剂 ： 0040 （1） 以养殖动物、 养殖水体和底泥为菌源， 通过在 MRS 液体培养基中富集后涂布固 体 MRS 培养基分离出乳酸菌菌株 ； 0041 （2） 将分离出的乳酸菌菌株进行纯化选育出四株溶钙圈大， 生长快， 活力强的乳酸 菌菌株 ： 0042 乳酸菌菌株进行纯化采用灭菌的 MRS 液体培养基， 进行富集培养， 将富集的菌液 涂于MRS斜面上， 分离出在含碳酸钙的MRS固体培养基上溶钙圈大的菌株， 经过两次分离纯 化后选出 20 株待用 ； 将分。
33、离纯化后的 20 株乳酸菌菌株分别接种于灭菌的 MRS 液体培养基 中， 在 37温度下培养 48 小时后吸取 5ml 菌液在 5000rpm 下离心 10min， 弃去上清液保留 菌体， 向菌体中注入 95% 的生理盐水得到稀释菌液， 然后用紫外分光光度计测定稀释菌液 OD543mn的吸光度， 当所有稀释菌液的吸光度值相同时， 当吸光度在 0.8 时， 把所有的稀释菌 液按相同的体积比例 5% 分别接种于灭菌的 MRS 液体培养基中， 36下静置培养 48h， 然后 用紫外分光光度计测定稀释菌液的 OD543nm， 选出 12 株的 OD543nm测定值高的菌株， 这个 OD543nm 测定。
34、值在 0.6 时 ； 然后把这些菌株的培养液在室温下继续放置 10 天， 后用 MRS 固体培养基 进行平板计数， 培养时间为 28h, 温度为 35， 选出计数结果最高的菌株， 最终选出四株乳 酸菌菌株分别保种 ； 0043 上述所用的 MRS 液体培养基的组成为 ： 大豆蛋白胨 1.5g， 牛肉膏 0.5g， 酵母浸粉 0.3g， 葡萄糖1.5g， 磷酸氢二钾0.1g， 乙酸钠0.3g， 柠檬酸三铵0.3g， 硫酸镁0.052g， 硫酸锰 0.023g， 吐温 0.05g， 蒸馏水 99g。 0044 上述的含碳酸钙的 MRS 固体培养基是在 MRS 液体培养基中按蒸馏水的重量加入 1.8。
35、% 的琼脂粉和 1.1% 的碳酸钙 ； 即 ： 大豆蛋白胨 1.5g， 牛肉膏 0.5g， 酵母浸粉 0.3g， 葡萄 糖 1.5g， 磷酸氢二钾 0.1g， 乙酸钠 0.3g， 柠檬酸三铵 0.3g， 硫酸镁 0.052g， 硫酸锰 0.023g， 吐温 0.05g， 蒸馏水 99g、 琼脂粉 1.782g、 碳酸钙 1.089g。 0045 （3） 将进行纯化选育后选育出的乳酸菌菌株扩大培养， 制备复合种子液 ： 0046 将四株来源不同的乳酸菌菌株进行平板划线， 进行平板划线所用的培养基为 MRS 固体培养基， 灭菌后冷却至 44在超净台中倒入平板中， 待平板冷却凝固后按 10 倍梯度稀。
36、 释法进行平板涂布计数， 并观察杂菌。挑取单菌落接入灭菌的 MRS 液体培养基中进行扩大 培养， 在 36下培养 46h， 然后将四种培养液按体积比例 10%， 30%， 30%， 30% 混合， 然后接种 于灭菌的 MRS 液体培养基中， 接种量为 15%， 在 35下混合培养 36h 获得复合种子液 ； 0047 （4） 将复合种子液接种发酵即得复合型乳酸菌微生态制剂 ： 0048 将复合种子液接种到液体发酵培养基中， 待搅拌均匀后密封在室温下发酵 4 天， 在密封发酵过程中每天搅拌两次， 并释放气体， 同时在发酵过程中抽样 2 次， 用平板计数法 观察菌体的生长及杂菌率， 并且测定pH值。
37、， 当活菌数到达5108CFU/mL,杂菌率5%， pH值 说 明 书 CN 103146611 A 8 6/7 页 9 在 4.0 的条件下停止发酵， 即得复合型乳酸菌微生态制剂。 0049 上述的液体发酵培养基的组成为 ： 蔗糖 0.8g， 酵母膏 0.4g， 乙酸钠 0.3g， 磷酸氢二 钾 0.5g， 柠檬酸三铵 0.3g， 硫酸镁 0.06g、 硫酸锰 0.023g， 吐温 0.08g， 蒸馏水 100g。 0050 上述液体发酵培养基的制备方法为 ： 先将酵母膏加入自来水中蒸煮， 待水开后继 续蒸煮 5 分钟， 后加入余下的成分， 溶解完全后倒入消毒的塑料桶中冷却待用。 0051 。
38、实施例 3 ： 0052 一种复合型乳酸菌微生态制剂的制备方法， 以养殖动物、 养殖水体和底泥为菌源， 通过在 MRS 液体培养基中富集后涂布固体 MRS 培养基分离出乳酸菌菌株 ； 然后将分离出的 乳酸菌菌株进行纯化选育出五株溶钙圈大， 生长快， 活力强的乳酸菌菌株 ； 接着将进行纯化 选育后选育出的乳酸菌菌株扩大培养， 制备复合种子液 ； 最后将复合种子液接种发酵即得 复合型乳酸菌微生态制剂 ： 0053 （1） 以养殖动物、 养殖水体和底泥为菌源， 通过在 MRS 液体培养基中富集后涂布固 体 MRS 培养基分离出乳酸菌菌株 ； 0054 （2） 将分离出的乳酸菌菌株进行纯化选育出五株溶。
39、钙圈大， 生长快， 活力强的乳酸 菌菌株 ： 0055 乳酸菌菌株进行纯化采用灭菌的 MRS 液体培养基， 进行富集培养， 将富集的菌液 涂于MRS斜面上， 分离出在含碳酸钙的MRS固体培养基上溶钙圈大的菌株， 经过两次分离纯 化后选出 22 株待用 ； 将分离纯化后的 22 株乳酸菌菌株分别接种于灭菌的 MRS 液体培养基 中， 在 35温度下培养 50 小时后吸取 5ml 菌液在 5000rpm 下离心 12min， 弃去上清液保留 菌体， 向菌体中注入 95% 的生理盐水得到稀释菌液， 然后用紫外分光光度计测定稀释菌液 OD543mn的吸光度， 当所有稀释菌液的吸光度值相同时， 当吸光度。
40、在 0.9 时， 把所有的稀释菌 液按相同的体积比例4%分别接种于灭菌的MRS液体培养基中， 35下静置培养36h， 然后用 紫外分光光度计测定稀释菌液的 OD543nm， 选出 8 株的 OD543nm测定值高的菌株， 这个 OD543nm测 定值在 1.0 时 ； 然后把这些菌株的培养液在室温下继续放置 10 天， 后用 MRS 固体培养基进 行平板计数， 培养时间为 28h, 温度为 35， 选出计数结果最高的菌株， 最终选出五株乳酸 菌菌株分别保种 ； 0056 上述所用的 MRS 液体培养基的组成为 ： 大豆蛋白胨 0.8g， 牛肉膏 0.8g， 酵母浸粉 0.4g， 葡萄糖2.5g。
41、， 磷酸氢二钾0.1g， 乙酸钠0.7g， 柠檬酸三铵0.1g， 硫酸镁0.052g， 硫酸锰 0.03g， 吐温 0.12g， 蒸馏水 101g。 0057 上述的含碳酸钙的 MRS 固体培养基是在 MRS 液体培养基中按蒸馏水的重量加入 1.6% 的琼脂粉和 1.1% 的碳酸钙 ； 即大豆蛋白胨 0.8g， 牛肉膏 0.8g， 酵母浸粉 0.4g， 葡萄糖 2.5g， 磷酸氢二钾 0.1g， 乙酸钠 0.7g， 柠檬酸三铵 0.1g， 硫酸镁 0.052g， 硫酸锰 0.03g， 吐温 0.12g， 蒸馏水 101g、 琼脂粉 1.616g、 碳酸钙 1.111g。 0058 （3） 将进。
42、行纯化选育后选育出的乳酸菌菌株扩大培养， 制备复合种子液 ： 0059 将五株来源不同的乳酸菌菌株进行平板划线， 进行平板划线所用的培养基为 MRS 固体培养基， 灭菌后冷却至 46在超净台中倒入平板中， 待平板冷却凝固后按 10 倍梯度稀 释法进行平板涂布计数， 并观察杂菌。挑取单菌落接入灭菌的 MRS 液体培养基中进行扩大 培养， 在 36下培养 40h， 然后将五种培养液按体积比例 12%， 22%， 22%， 22%， 22% 混合， 然后 接种于灭菌的 MRS 液体培养基中， 接种量为 20%， 在 33下混合培养 24h 获得复合种子液 ； 说 明 书 CN 103146611 A。
43、 9 7/7 页 10 0060 （4） 将复合种子液接种发酵即得复合型乳酸菌微生态制剂 ： 0061 将复合种子液接种到液体发酵培养基中， 待搅拌均匀后密封在室温下发酵 3 天， 在密封发酵过程中每天搅拌两次， 并释放气体， 同时在发酵过程中抽样 2 次， 用平板计数法 观察菌体的生长及杂菌率， 并且测定pH值， 当活菌数到达5108CFU/mL,杂菌率5%， pH值 在 3.0 的条件下停止发酵， 即得复合型乳酸菌微生态制剂。 0062 上述的液体发酵培养基的组成为 ： 蔗糖 1.0g， 酵母膏 0.5g， 乙酸钠 0.5g， 磷酸氢二 钾 0.8g， 柠檬酸三铵 0.5g， 硫酸镁 0.065g、 硫酸锰 0.025g， 吐温 0.1g， 蒸馏水 101g。 0063 上述液体发酵培养基的制备方法为 ： 先将酵母膏加入自来水中蒸煮， 待水开后继 续蒸煮 5 分钟， 后加入余下的成分， 溶解完全后倒入消毒的塑料桶中冷却待用。 0064 以上所述仅为本发明的较佳实施例而已， 并不用以限制本发明， 凡在本发明的精 神和原则之内， 所作的任何修改、 等同替换、 改进等， 均应包含在本发明的保护范围之内。 说 明 书 CN 103146611 A 10 。