HLA基因特异性PCR扩增引物及HLA分型的方法和试剂盒.pdf

本发明公开了一种HLA基因特异性PCR扩增引物及HLA分型的方法和试剂盒，其中，PCR扩增引物的序列包括：SEQ ID NO.1-2、3-4、5-6、7-8、9-10所示的引物序列；HLA基因分型的方法包括：利用HLA基因特异性PCR扩增引物，对样本DNA进行PCR扩增，纯化，利用基因外显子测序引物，对HLA基因扩增产物进行测序PCR扩增，纯化，测序，并与标准序列对比，确定HLA基因的型别；HLA基因分型的试剂盒包括：PCR扩增引物和测序引物。本发明在检测通量、数据质量、成本控制等方面都有质的飞跃，且数据更加可靠、真实，能避免当某些等位基因的核苷酸位于扩增区域之外时无法分型的问题。

权利要求书一种HLA基因特异性PCR扩增引物，其特征在于：其序列包括：SEQ ID NO.1‑2所示的引物序列，SEQ ID NO.3‑4所示的引物序列，SEQ ID NO.5‑6所示的引物序列，SEQ IDNO.7‑8所示的引物序列和SEQ ID NO.9‑10所示的引物序列。
如权利要求1所述的HLA基因特异性PCR扩增引物，其特征在于：所述SEQ IDNO.1‑2所示的引物序列是用于扩增HLA‑A基因的引物序列；其中，由该引物序列经PCR扩增所得到的产物的片段大小为3000bp。
如权利要求1所述的HLA基因特异性PCR扩增引物，其特征在于：所述SEQ ID NO.3‑4所示的引物序列是用于扩增HLA‑B基因的引物序列；其中，由该引物序列经PCR扩增所得到的产物的片段大小为3000bp。
如权利要求1所述的HLA基因特异性PCR扩增引物，其特征在于：所述SEQ ID NO.5‑6所示的引物序列是用于扩增HLA‑C基因的引物序列；其中，由该引物序列经PCR扩增所得到的产物的片段大小为3000bp。
如权利要求1所述的HLA基因特异性PCR扩增引物，其特征在于：所述SEQ ID NO.7‑8所示的引物序列是用于扩增HLA‑DRB1基因的引物序列；其中，由该引物序列经PCR扩增所得到的产物的片段大小为270bp。
如权利要求1所述的HLA基因特异性PCR扩增引物，其特征在于：所述SEQ IDNO.9‑10所示的引物序列是用于扩增HLA‑DQB1基因的引物序列；其中，由该引物序列经PCR扩增所得到的产物的片段大小为3800bp。
一种基因外显子测序引物，其特征在于：所述基因外显子测序引物是对于由如权利要求1所述的HLA基因特异性PCR扩增引物扩增得到的HLA基因扩增产物的基因外显子测序引物，包括：HLA‑A基因的2、3、4号外显子的测序引物，HLA‑B基因的2、3、4号外显子的测序引物，HLA‑C基因的2、3、4号外显子的测序引物，HLA‑DRB1基因的2号外显子的测序引物和HLA‑DQB1基因的2、3号外显子的测序引物；
其中，HLA‑A基因的2、3、4号外显子的测序引物，其序列包括：SEQ ID NO.11‑15所示的测序引物序列；
HLA‑B基因的2、3、4号外显子的测序引物，其序列包括：SEQ ID NO.16‑20所示的测序引物序列；
HLA‑C基因的2、3、4号外显子的测序引物，其序列包括：SEQ ID NO.21‑25所示的测序引物序列；
HLA‑DRB1基因的2号外显子的测序引物，其序列包括：SEQ ID NO.26‑27所示的测序引物序列；
HLA‑DQB1基因的2、3号外显子的测序引物，其序列包括：SEQ ID NO.28‑30所示的测序引物序列。
一种HLA基因分型的方法，其特征在于，包括步骤：
1）提取样本DNA；
2）利用权利要求1所述的HLA基因特异性PCR扩增引物，对样本DNA进行PCR扩增，纯化，得到纯化后的HLA基因扩增产物；
3）利用权利要求7所述的基因外显子测序引物，对纯化后的HLA基因扩增产物进行测序PCR扩增，纯化，得到纯化后的测序扩增产物；
4）对纯化后的测序扩增产物进行HLA基因的外显子测序，并与HLA基因的外显子标准序列进行对比，确定HLA基因的型别。
如权利要求8所述的方法，其特征在于：所述步骤2）中，HLA基因扩增产物包括：HLA‑A、HLA‑B、HLA‑C、HLA‑DRB1和HLA‑DQB1基因的扩增产物。
如权利要求8所述的方法，其特征在于：所述步骤4）中，确定HLA基因的型别的操作步骤包括：
利用SEQ ID NO.11‑15所示的测序引物序列，对HLA‑A基因的2、3、4号外显子进行测序，得到的测序结果与数据库中的标准序列进行对比，来确定A基因的型别；
利用SEQ ID NO.16‑20所示的测序引物序列，对HLA‑B基因的2、3、4号外显子进行测序，得到的测序结果与数据库中的标准序列进行对比，来确定HLA‑B基因的型别；
利用SEQ ID NO.21‑25所示的测序引物序列，对HLA‑C基因的2、3、4号外显子进行测序，得到的测序结果与数据库中的标准序列进行对比，来确定HLA‑C基因的型别；
利用SEQ ID NO.26‑27所示的测序引物序列，对HLA‑DRB1基因的2号外显子进行测序，得到的测序结果与数据库中的标准序列进行对比，来确定HLA‑DRB1基因的型别；
利用SEQ ID NO.28‑30所示的测序引物序列，对HLA‑DQB1基因的2、3号外显子进行测序，得到的测序结果与数据库中的标准序列进行对比，来确定HLA‑DQB1基因的型别；
其中，所述数据库为国际组织IMGT数据库。
一种HLA基因分型的试剂盒，其特征在于，包括：如权利要求1所述的HLA基因特异性PCR扩增引物和如权利要求7所述的基因外显子测序引物。

说明书HLA基因特异性PCR扩增引物及HLA分型的方法和试剂盒
技术领域
本发明涉及一种基因的扩增引物及利用该引物进行基因分型的方法和试剂盒，特别是涉及一种HLA(人类白细胞抗原)基因特异性PCR扩增引物及利用该引物进行HLA分型的方法和试剂盒。
背景技术
人类白细胞抗原(HLA)基因位于人类第6号染色体短臂，是目前发现的人体多态性最高的基因。HLA基因分成三类：I类、II类和III类基因。其中，I类包括：HLA‑A、HLA‑B、HLA‑C基因；II类包括：HLA‑DRB1、HLA‑DQA1、HLA‑DQB1、HLA‑DPA1、HLA‑DPB1基因。
HLA系统是目前所知人体最复杂的多态系统。自1958年发现(Jean Dausset)第一个HLA抗原，到20世纪70年代，HLA便成为免疫遗传学、免疫生物学和生物化学等学科的一个重要新兴研究领域。现在，已基本弄清其系统的组成、结构和功能，闸明了其理化性质和生物学作用。这些研究成果不仅具有重要的理论意义，而且具有巨大的生物医学价值。
随着医学的发展，像白血病、地中海贫血等能用最新的基因技术进行分型检测，再寻找合适的供体进行移植治疗。目前通过HLA高分辨分型的外周血干细胞移植技术能大大提高配型效果，使患者的康复更快，更有保征。
目前国际上对HLA基因分型的方法有PCR‑SSP(序列特异引物聚合酶链式反应)，PCR‑SSO(聚合酶链式反应寡核苷酸探针杂交)以及PCR‑SBT(聚合链式反应产物直接测序分型)。
其中，SSP法需要设计出一整套基因特异性引物，通过PCR技术获得特异性产物，通过电泳分析决定HLA基因型别。其缺点不易、不能检测新的等位基因；试剂盒需不断升级；检测的信号也只说模拟的信号，不直观可靠。
SSO法的原理设计HLA基因型别特异的寡核苷酸序列作为探针，对PCR产物进行标记，以PCR产物与探针进行杂交。通过检测信号判断HLA基因型别。但该方法的缺点是不能检测新的等位基因，分辨率不高，检测信号为模拟信号。
SBT法是一种通过对扩增后的DNA进行核酸序列测序，从而判断HLA基因型别的方法。该方法是一种最直观、最准确的方法，可广泛用于HLA基因的高分辨分型检测，但是该方法对扩增过程的引物序列要求很高，引物序列直接关系到整个型别的确定，一对好的特异性引物是该方法成功的关键。
因此，为改变目前落后的HLA基因分型方法，需研发一种更加有效，且在检测通量、数据质量、成本控制等方面，更有优势的方法。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种HLA(人类白细胞抗原)基因特异性PCR扩增引物及利用该引物进行HLA分型的方法和试剂盒。通过本发明的HLA分型方法能大大提高配型效果，使患者的康复更快，更有保征。由于该方法应用测序技术，只需通过一次实验就能够确定HLA分型，并一次性达到HLA分型的最高分辨率，同时，还可发现新的等位基因，在检测通量、数据质量、成本控制等方面都有质的飞跃。
为解决上述技术问题，本发明的HLA基因特异性PCR扩增引物，其序列包括：SEQ IDNO.1‑2所示的引物序列，SEQ ID NO.3‑4所示的引物序列，SEQ ID NO.5‑6所示的引物序列，SEQ ID NO.7‑8所示的引物序列和SEQ ID NO.9‑10所示的引物序列。
所述SEQ ID NO.1‑2所示的引物序列是用于扩增HLA‑A基因的引物序列；其中，由该引物序列经PCR扩增所得到的产物的片段大小为3000bp。
所述SEQ ID NO.3‑4所示的引物序列是用于扩增HLA‑B基因的引物序列；其中，由该引物序列经PCR扩增所得到的产物的片段大小为3000bp。
所述SEQ ID NO.5‑6所示的引物序列是用于扩增HLA‑C基因的引物序列；其中，由该引物序列经PCR扩增所得到的产物的片段大小为3000bp。
所述SEQ ID NO.7‑8所示的引物序列是用于扩增HLA‑DRB1基因的引物序列；其中，由该引物序列经PCR扩增所得到的产物的片段大小为270bp。
所述SEQ ID NO.9‑10所示的引物序列是用于扩增HLA‑DQB1基因的引物序列；其中，由该引物序列经PCR扩增所得到的产物的片段大小为3800bp。
另外，本发明还提供一种基因外显子测序引物，该基因外显子测序引物是对于由上述HLA基因特异性PCR扩增引物扩增得到的HLA基因扩增产物的基因外显子测序引物，包括：HLA‑A基因的2、3、4号外显子的测序引物，HLA‑B基因的2、3、4号外显子的测序引物，HLA‑C基因的2、3、4号外显子的测序引物，HLA‑DRB1基因的2号外显子的测序引物和HLA‑DQB1基因的2、3号外显子的测序引物；
其中，HLA‑A基因的2、3、4号外显子的测序引物，其序列包括：SEQ ID NO.11‑15所示的测序引物序列；
HLA‑B基因的2、3、4号外显子的测序引物，其序列包括：SEQ ID NO.16‑20所示的测序引物序列；
HLA‑C基因的2、3、4号外显子的测序引物，其序列包括：SEQ ID NO.21‑25所示的测序引物序列；
HLA‑DRB1基因的2号外显子的测序引物，其序列包括：SEQ ID NO.26‑27所示的测序引物序列；
HLA‑DQB1基因的2、3号外显子的测序引物，其序列包括：SEQ ID NO.28‑30所示的测序引物序列。
上述的HLA基因特异性PCR扩增引物和基因外显子测序引物的序列，可如表1所示。
表1PCR扩增引物对及测序引物对

注：引物名称中的“F”和“R”分别表示引物的上游和下游
再者，本发明还提供了一种利用上述引物和测序引物进行HLA基因分型的方法，包括步骤：
1)提取样本DNA；
2)利用权利要求1所述的HLA基因特异性PCR扩增引物，对样本DNA进行PCR扩增，纯化，得到纯化后的HLA基因扩增产物；
3)利用权利要求7所述的基因外显子测序引物，对纯化后的HLA基因扩增产物进行测序PCR扩增，纯化，得到纯化后的测序扩增产物；
4)对纯化后的测序扩增产物进行HLA基因的外显子测序，并与HLA基因的外显子标准序列进行对比，确定HLA基因的型别。
所述步骤2)中，HLA基因扩增产物包括：HLA‑A、HLA‑B、HLA‑C、HLA‑DRB1和HLA‑DQB1基因的扩增产物。
所述步骤4)中，确定HLA基因的型别的操作步骤包括：
利用SEQ ID NO.11‑15所示的测序引物序列，对HLA‑A基因的2、3、4号外显子进行测序，得到的测序结果与数据库中的标准序列进行对比，来确定A基因的型别；
利用SEQ ID NO.16‑20所示的测序引物序列，对HLA‑B基因的2、3、4号外显子进行测序，得到的测序结果与数据库中的标准序列进行对比，来确定HLA‑B基因的型别；
利用SEQ ID NO.21‑25所示的测序引物序列，对HLA‑C基因的2、3、4号外显子进行测序，得到的测序结果与数据库中的标准序列进行对比，来确定HLA‑C基因的型别；
利用SEQ ID NO.26‑27所示的测序引物序列，对HLA‑DRB1基因的2号外显子进行测序，得到的测序结果与数据库中的标准序列进行对比，来确定HLA‑DRB1基因的型别；
利用SEQ ID NO.28‑30所示的测序引物序列，对HLA‑DQB1基因的2、3号外显子进行测序，得到的测序结果与数据库中的标准序列进行对比，来确定HLA‑DQB1基因的型别；
其中，所述数据库为国际组织IMGT数据库(http：//www.ebi.ac.uk/imgt/)。
本发明的测序过程中，以ABI公司Big Dye Terminator V3.1为主要试剂(含有dNTP、ddNTP和荧光素)，用纯化后的PCR扩增产物为模板，加入特异性测序引物进行循环扩增。HLA基因检测常规位点为A、B、C(exon2F/R、exon3F/R、exon4F)、DQB1(exon2F/R、exon3F)、DRB1(exon2F/R)，非常规位点及引物扩增可根据需要进行检测。测序扩增产物经过乙醇‑EDTA‑Na2沉淀纯化处理后，用去离子甲酰胺溶解变性，ABI3730XL测序仪毛细管电泳并自动对结果进行分析处理，获得所需片段碱基序列并以4色峰图形式呈现。
本发明还提供一种HLA基因分型的试剂盒，包括：如上所述的HLA基因特异性PCR扩增引物和基因外显子测序引物。
通过本发明设计优化后的基因引物分别能高效扩增出相应的基因片段，因此，为后续的基因分型奠定基础。较目前HLA‑SBT方法所扩增出的片段来看，由本发明设计优化后的引物条带具有更加单一、无杂带等优良特点。
本发明的改进的HLA基因分型方法(PCR‑SBT分型方法)，可以扩增出待测的HLA‑A、HLA‑B、HLA‑C、HLA‑DRB1、HLA‑DQB1。运用该方法，只需通过一次实验就能够读取大量样本的HLA序列数据，并一次性达到HLA分型的最高分辨率，同时还可发现新的等位基因，以及在测序结果方面，与以前方法相比，峰图质量等有较大的改善，从而对型别的判定更加合理和准确。因此，本发明在检测通量、数据质量、成本控制等方面都有质的飞跃。应用这种新技术进行高分辨配型，成本不到传统技术的一半，而且本发明得到的数据更加可靠、真实。
另外，与传统方法相比，由于使用本发明的方法和扩增引物能够将全长基因都能够扩增出来，因此在接下来的分型过程中，能够避免当某些等位基因的核苷酸位于扩增区域之外时无法分型的问题。
附图说明
下面结合附图与具体实施方式对本发明作进一步详细的说明：
图1是实施例中的HLA‑A、HLA‑B基因的PCR产物电泳图，其中，A为HLA‑A基因，B为HLA‑B基因；
图2是实施例中的HLA‑C基因的PCR产物电泳图；
图3是实施例中的HLA‑DRB1基因的PCR产物电泳图；
图4是实施例中的HLA‑DQB1基因的PCR产物电泳图；
图5是测序引物A2F测序峰图；
图6是测序引物A2R测序峰图；
图7是测序引物A3F测序峰图；
图8是测序引物A3R测序峰图；
图9是测序引物A4F测序峰图；
图10是测序引物B2F测序峰图；
图11是测序引物B2R测序峰图；
图12是测序引物B3F测序峰图；
图13是测序引物B3R测序峰图；
图14是测序引物B4F测序峰图；
图15是测序引物C2F测序峰图；
图16是测序引物C2R测序峰图；
图17是测序引物C3F测序峰图；
图18是测序引物C3R测序峰图；
图19是测序引物C4F测序峰图；
图20是测序引物DRB12F测序峰图；
图21是测序引物DRB12R测序峰图；
图22是测序引物DQB12F测序峰图；
图23是测序引物DQB12R测序峰图；
图24是测序引物DQB13F测序峰图。
具体实施方式
实施例1对已知基因型别的样本进行HLA分型检测
在本实施中，采用如表1所示的PCR扩增引物对和测序引物，对12例已知HLA基因型的人血样进行HLA‑A、HLA‑B、HLA‑C、HLA‑DRB1、HLA‑DQB1位点的高分辨基因分型确认。试验的具体步骤如下：
1、提取基因组DNA
(1)吸取600μl混匀全血到已作标记的2ml EP管中；
(2)加1000μl红细胞裂解液(碧云天生物技术研究所，货号C3702)，充分振荡均匀直至混合液光亮，11000rpm离心1min；
(3)弃上清，EP管开口向下扣在吸水纸上，尽量排出剩余残液；
(4)加1000μl红细胞裂解液，重复(2)；
(5)弃上清，EP管开口向下放吸水纸上，尽量排出剩余液体；
(6)观察红细胞是否裂解充分，如不充分，则重复步骤(4)和(5)，直至裂解充分(观察其沉淀的颜色即可)，然后，再进行以下的下游实验。
以下步骤按Qiagen公司的提取基因组DNA的试剂盒的操作流程进行：
(7)加入200μl ATL，振荡15s，3000rpm短暂离心(如5s)；
(8)加入20μl(10mg/ml)Proteinase K和200μl AL，振荡15s，3000rpm短暂离心；
(9)将其置于56℃孵育10min以上，期间对每隔2‑3min对其轻摇一次；
(10)观察液体变清亮后，孵育完毕，3000rpm短暂离心；
(11)加200μl无水乙醇，轻轻颠倒EP管15～20次(直到线性DNA形成)；
(12)3000rpm短暂离心后，将其转至已作相应标记的管中，室温放置1‑2min；
(13)6000×g离心1min，丢弃收集管，将离心柱转至一新的收集管中；
(14)加入500μl AW1，6000×g离心1min，丢弃收集管，将离心柱转至一新的收集管中；
(15)加入500μl AW2，6000×g离心1min，丢弃收集管，将离心柱转至一新的收集管中；
(16)14000rpm，离心3min；
(17)将离心柱转至一新1.5ml EP管中，打开盖子，晾干2‑3min；(根据实验室的通风环境，可增加晾干的时间)
(18)取出一支56℃预温的ddH2O，向离心柱的中心加入50μl ddH2O，然后室温静置1min；
(19)6000×g离心1min后，弃掉离心柱，盖上EP管保存，得到基因组DNA模板。
2、PCR扩增
(1)根据编的DNA模板顺序，按照对应的DNA条码号和孔号，在96孔1.5ml离心管架上排列好存放DNA模板的离心管的顺序，并复核一遍，以确保DNA模板顺序正确，标记用于PCR反应的进口Axygen96孔板(即反应板，其命名规则为“实验日期‑P位点”，如：20091001‑Pabc)或进口Axygen200μl反应管。用移液器按顺序从DNA管中转移2μl模板(若模板浓度低，可转移5μl)到进口Axygen96孔反应板(或进口Axygen200μl反应管)上，根据需要做的位点数转移相应的次数(每个样本每位点一个反应)。样品应加到反应孔底部，若加样过程中，样品未加到反应孔底部，则加样完成后要短时离心，封口待用。
(2)分别使用不同的引物对(如表1所示)，扩增步骤1中提取的基因组DNA，即使用A‑F(SEQ ID NO.1所示)和A‑R(SEQ ID NO.2所示)、B‑F(SEQ ID NO.3所示)和B‑R(SEQID NO.4所示)、C‑F(SEQ ID NO.5所示)和C‑R(SEQ ID NO.6所示)、DRB1‑F(SEQ ID NO.7所示)和DRB1‑R(SEQ ID NO.8所示)、DQB1‑F(SEQ ID NO.9所示)和DQB1‑R(SEQ IDNO.10所示)引物对进行PCR扩增。使用不同的引物对进行扩增时，其扩增过程和反应体系均是相似的。
所述PCR扩增过程为：
96℃2min；
95C30s，61C30s，72C3min(36个循环)；
15℃∞。
上述PCR反应体系，具体反应成分和用量可如表2所示。
表2PCR反应体系
成分用量2×GC buffer I(Mg2+plus)12.5μldNTP Mixture(各2.5mM)4.0μlPrimer(10pmol/l)1μlTakara LA Taq(5U/μU)0.3μlDNA2.0μlddH2O5.2μl
对获得的PCR扩增产物，进行1.5%的琼脂糖凝胶电泳，结果显示(如图1‑4所示)：从电泳图上看HLA‑A、HLA‑B、HLA‑C、HLA‑DRB1、HLA‑DQB1基因通过本发明设计的引物均得到较为单一的条带，且条带明亮，可见获得足够的DNA量，即经上述设计的特异性引物对HLA基因的常规位点进行扩增，获得大小分别为3000bp的HLA‑A、HLA‑B和HLA‑C基因扩增片段、270bp的HLA‑DRB1基因扩增片段、3800bp的HLA‑DQB1基因扩增片段，而且电泳条带具有单一、无杂带等优良特点。
3、利用SAP消化酶进行PCR产物纯化
得到的PCR产物先进行3000rpm、5s离心处理后，每孔加入1μlSAP消化酶(takara，D2660A)37℃反应15min，然后65℃反应15min，得到的产物作为测序扩增的模板。
4、使用测序引物进行产物的测序扩增
分别使用不同的测序引物，对步骤3中纯化后的PCR产物进行测序PCR扩增，即：
使用A2F(SEQ ID NO.11所示)、A2R(SEQ ID NO.12所示)、A3F(SEQ ID NO.13所示)、A3R(SEQ ID NO.14所示)、A4F(SEQ ID NO.15所示)测序引物分别扩增HLA‑A基因第2、3、4号外显子；
使用B2F(SEQ ID NO.16所示)、B2R(SEQ ID NO.17所示)、B3F(SEQ ID NO.18所示)、B3R(SEQ ID NO.19所示)、B4F(SEQ ID NO.20所示)测序引物分别扩增HLA‑B基因的2、3、4号外显子；
使用C2F(SEQ ID NO.21所示)、CS2R(SEQ ID NO.22所示)、CS3F(SEQ ID NO.23所示)、C3R(SEQ ID NO.24所示)、C4F(SEQ ID NO.25所示)测序引物分别扩增HLA‑C基因第2、3、4号外显子；
使用DRB1S2F(SEQ ID NO.26所示)、DRB12R(SEQ ID NO.27所示)引物分别扩增HLA‑DRB1基因第2号外显子；
使用DQB12F(SEQ ID NO.28所示)、DQB12R(SEQ ID NO.29所示)、DQB13F(SEQID NO.30所示)引物分别扩增HLA‑DQB1基因第2、3号外显子。
各测序PCR扩增反应的条件和反应体系部是相同的。
测序PCR扩增反应条件为：
96℃2min；
96℃10s，50℃20s，60℃2min(25个循环)；
15℃∞。
测序PCR扩增反应体系为5ul，其组成如表3所示，其中，2.5×BigDye和5×Buffer均购自美国应用生物系统公司(Applied Biosystems，ABI)。
表3测序PCR扩增反应体系

5、EDTA/无水乙醇纯化测序扩增产物
(1)96孔板：每5μl的测序PCR扩增后的反应体系中，加0.125mol/L EDTA‑Na2溶液2μl，85%乙醇33μl，盖上硅胶垫，检查加量，如有漏加或少加的孔应立即补足，充分振荡3分钟，3000g，4℃，离心30分钟。
(2)96孔板每孔加70%乙醇50μl，盖上硅胶垫，检查加量，如有漏加或少加的孔应立即补足，振荡2分钟，3000g，4C，离心15分钟。
(3)测序反应板置避光通风处30分钟，风干至无乙醇气味。96孔板每孔加10μl HI‑DI甲酰胺(ABI公司)，盖封口膜，振荡5秒后，1000±100rpm离心15s。
(4)变性处理，PCR仪96℃，2分钟；转至另一台没开机的PCR仪，盖紧放置1分钟取出，得到纯化后的测序扩增产物。
6、在ABI3730XL上进行外显子测序
采用毛细管电泳技术取代传统的聚丙烯酰胺平板电泳，应用四色荧光染料标记的ddNTP(标记终止物法)，因此通过单引物PCR测序反应，生成的PCR产物则是相差1个碱基的3'末端为4种不同荧光染料的单链DNA混合物，使得四种荧光染料的测序PCR产物可在一根毛细管内电泳，从而避免了泳道间迁移率差异的影响，大大提高了测序的精确度。由于分子大小不同，在毛细管电泳中的迁移率也不同，当其通过毛细管读数窗口段时，激光检测器窗口中的CCD(charge‑coupled device)摄影机检测器就可对荧光分子逐个进行检测，激发的荧光经光栅分光，以区分代表不同碱基信息的不同颜色的荧光，并在CCD摄影机上同步成像，分析软件可自动将不同荧光转变为DNA序列，从而达到DNA测序的目的。
本步骤中，采用ABI3730XL测序仪，对纯化后的测序扩增产物进行测序。该步骤是HLA分型中实验操作的最后的一个环节。该环节能把基因序列信息转化为可读的峰图信息(如图5‑24所示)，从所得到的测序峰图来看，通过本发明设计的引物序列测序后得到的测序峰图具有清晰准确、杂峰少等优点。
将测序后得到的结果与国际组织IMGT数据库(http：//www.ebi.ac.uk/imgt/)中公布的HLA标准型别进行比对；由Nomi1.0、Chromas等专业软件对测序后峰图进行分析处理，根据样本的匹配程度高低得到样本型别的结论，结果如表4所示。
由表4可知，本发明的检测结果与已知样本的检测结果完全一致，因此，通过本发明设计的PCR扩增引物和测序引物序列能够完全确定HLA分型。
根据上述HLA基因分型的检测方法和检测结果，本发明还可提供一种HLA基因分型的试剂盒，包括：如上所述的HLA基因特异性PCR扩增引物和基因外显子测序引物。另外，该试剂盒还可包括：除引物外的其他PCR扩增所需试剂，除测序引物外的其他测序扩增所需试剂。利用该试剂盒，能快速、简便地确定HLA基因分型。