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1、(10)申请公布号 CN 104313072 A (43)申请公布日 2015.01.28 CN 104313072 A (21)申请号 201410537231.6 (22)申请日 2014.10.13 C12P 17/04(2006.01) C12R 1/72(2006.01) (71)申请人 青岛科技大学 地址 266061 山东省青岛市崂山区松岭路 99 号 (72)发明人 刘均洪 冀雪 吕梅 (54) 发明名称 一种假丝酵母生产(1R,3S) 二氧基庚烯醇的 方法 (57) 摘要 用近平滑假丝酵母细胞直接催化制备光活性 (1R,3S)-1,2- （亚环己基二氧基） 庚 -6- 烯 -。
2、3- 醇， 反应罐中加入磷酸盐缓冲液， 加入硅藻土调控底 物、 产物浓度， 用酵母细胞进行生物催化反应， 产 品收率高， 对映体过量率高， 显著优于化学法。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 5 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书5页 (10)申请公布号 CN 104313072 A CN 104313072 A 1/1 页 2 1. 一种近平滑假丝酵母细胞生物催化制备 (1R,3S)-1,2-（亚环己基二氧基） 庚 -6- 烯 -3- 醇的方法， 其特征在于反应罐中加入磷酸盐缓冲液， 装料系数为 0.6-0.7， pH 为。
3、6.5， 加入吸附了底物R-亚环己基甘油醛与4-溴-1-丁烯的硅藻土， 使底物R-亚环己基 甘油醛添加量为 80-90g/L， 底物 R- 亚环己基甘油醛与底物 4- 溴 -1- 丁烯摩尔比为 1， 葡萄 糖 25-30 g， 木糖 15-20g/L， 山梨坦单月桂酸酯为 19-21g/L， 121高压灭菌 30 分钟 ； 冷却 至 26-28时， 加入湿酵母细胞使浓度为 29-32g/L， 通气比为 0.15-0.17V/（V 分钟） ， 进行 生物催化反应， 反应时间为 82-89 小时 ； 反应结束后， 分别滤出细胞、 硅藻土， 用乙酸乙酯萃 取反应液、 萃取硅藻土， 合并乙酸乙酯萃取液。
4、和萃取硅藻土的乙酸乙酯， 蒸出乙酸乙酯， 得 到产物 (1R,3S)-1,2-（亚环己基二氧基） 庚 -6- 烯 -3- 醇， 反应转化率 94-96， 产品收率 92-94， 对映体过量率 97-98。 2. 权利要求 1 所述的方法， 其特征在于湿酵母细胞制备过程如下 ： 近平滑假丝酵母 经斜面、 摇瓶、 种子罐培养得到种子液 ； 发酵罐加入培养液， 装料系数为 0.6-0.7， 121 高压灭菌 30 分钟， 冷却至 29-31， 将近平滑假丝酵母种子液接种至发酵罐， 接种比例为 6-6.5， 通气比为 0.5-1V/（V 分钟） ， 29-31培养 48-56 小时， 用过滤式离心机离。
5、心得到 湿酵母细胞， 用作生物催化反应催化剂。 3. 权利要求 1 所述的方法， 其特征在于培养液成份为 ： 葡萄糖 37-44 g/L, 木糖 7-8g/L， 玉米胚芽粉 10-12 g/L， 酵母提取物 4-5 g/L, (NH4 ) 2H PO4 12-15 g/L, KH2PO 4 6.5-7.5 g/L. MgSO4 .7H2O 0.7-0.8 g/L, NaCl 0.08-0.1 g/L; pH 值 7.0。 4. 权利要求 1 所述的方法， 其特征在于所述吸附了底物的硅藻土制作方法为， 将底物 R- 亚环己基甘油醛和 4- 溴 -1- 丁烯混溶， R- 亚环己基甘油醛与 4- 溴。
6、 -1- 丁烯摩尔比为 1， 用硅藻土吸收此溶液， 即得到吸附了底物的硅藻土， 调节底物与硅藻土用量， 使得底物与硅 藻土的质量比率为 0.32-0.35。 权 利 要 求 书 CN 104313072 A 2 1/5 页 3 一种假丝酵母生产 (1R,3S) 二氧基庚烯醇的方法 技术领域 0001 本发明属于制药工程技术领域， 特别涉及到近平滑假丝酵母细胞生物催化制备手 性医药中间体 (1R,3S)-1,2-（亚环己基二氧基） 庚 -6- 烯 -3- 醇的技术。 背景技术 0002 手性亚环己基二氧基） 庚 -6- 烯 -3- 醇是合成手性药物、 精细化学品、 农药品和其 他特殊材料的重要中。
7、间体。生物催化不对称合成具有环境友好、 条件温和、 选择性高等优 点,作为绿色高效制备手性化合物的优先途径,被越来越多地应用于生产一些高附加值的 手性化合物。生物催化制备手性亚环己基二氧基） 庚 -6- 烯 -3- 醇具有很好的应用前景。 0003 生物催化具有催化效率高、 选择性强、 条件温和、 环境友好等突出优点 , 是可持续 发展过程中替代和拓展传统有机化学合成的重要方法。 其中手性拆分和不对称合成是生物 催化最具吸引力的应用领域。在作为生物催化剂的六大类酶中 , 水解酶能够催化动力学拆 分外消旋体得到手性产品 , 在工业生物催化中一直扮演着重要角色。近几年来 , 氧化还原 酶在工业上的。
8、应用得到了迅速增长。目前 , 采用水解酶动力学拆分法、 生物还原法和生物 氧化法工业制备光学活性手性化合物的比例为 4:2:1。 0004 (1R,3S)-1,2-（亚环己基二氧基） 庚 -6- 烯 -3- 醇是合成手性药物、 精细化学品、 农药品的重要手性砌块， 由于有 2 个手性中心， 使得化学合成较为困难， 成本高。本发明将 采用生物催化制备 (1R,3S)-1,2-（亚环己基二氧基） 庚 -6- 烯 -3- 醇。 发明内容 0005 本发明采用近平滑假丝酵母细胞催化制备 (1R,3S)-1,2-（亚环己基二氧基） 庚 -6- 烯 -3- 醇， 反应式如下 ： 底物 R- 亚环己基甘油醛。
9、 （1） 和 4- 溴 -1- 丁烯 （2） 经近平滑假丝酵母催化反应， 得到产 物 (1R,3S)-1,2-（亚环己基二氧基） 庚 -6- 烯 -3- 醇 （3） 。有多种微生物可以催化此反应， 经过大量实验筛选， 最终确定采用近平滑假丝酵母作为催化剂， 因为其催化反应1和2反应 的效果最好， 反应收率、 对映体过量率 （ee%） 均很高。 0006 许多近平滑假丝酵母都可以进行生物催化此反应， 然而， 其效果不同， 相差很大， 经实验， 本发明选用近平滑假丝酵母菌株为 ATCC 22019D-5 ， 其催化反应效果最佳。 0007 培养介质 ： 说 明 书 CN 104313072 A 3。
10、 2/5 页 4 1、 种子培养基成份为: 酵母提取物10 g/L， 葡萄糖20 g/L， 蛋白胨20 g/L， pH6; 配 制固体培养基时添加 15g/L 的琼脂粉。 0008 2、 培养液成份 ： 葡萄糖 37-44 g/L, 木糖 7-8g/L， 玉米胚芽粉 10-12 g/L， 酵母提 取物 4-5 g/L, (NH4 ) 2H PO4 12-15 g/L, KH2PO 4 6.5-7.5 g/L. MgSO4 .7H2O 0.7-0.8 g/L, NaCl 0.08-0.1 g/L; pH 值 7.0。 0009 2、 固体培养基成份 ： 在液体培养基中加入 2% 的琼脂粉。 00。
11、10 酵母细胞制备。近平滑假丝酵母经斜面、 摇瓶、 种子罐培养得到种子液 ； 发酵罐加 入培养液， 近平滑假丝酵母经斜面、 摇瓶、 种子罐培养得到种子液 ； 发酵罐加入培养液， 装料 系数为0.6-0.7， 121高压灭菌30分钟， 冷却至27-28， 将近平滑假丝酵母种子液接种至 发酵罐， 接种比例为 6-6.5， 通气比为 0.5-1V/ （V 分钟） ， 29-31培养 48-56 小时， 用过滤 式离心机离心得到湿酵母细胞， 用作生物催化反应催化剂。 0011 由于底物、 产物均对酵母细胞有抑制作用， 为了减少底物、 产物对细胞的抑制， 本 发明采用硅藻土吸附底物， 反应中， 当底物被。
12、细胞催化反应， 浓度降低时， 底物从硅藻土溶 出， 补充反应消耗的底物。 同时， 产物被硅藻土吸附， 减少了其在水中的浓度， 从而大幅度降 低了底物、 产物对细胞的抑制。 底物与硅藻土的比率， 决定了反应液中底物、 产物的浓度， 而 且， 浓度还与反应温度、 反应液成份有关。不同细胞对底物、 产物的敏感度不同， 所以， 要进 行大量实验， 才能确定最佳的底物与硅藻土的比率。实验表明， 对于本发明的菌株、 反应液 成份、 反应温度， 最佳的底物与硅藻土的比率为 0.32-0.35。具体吸附时， 将底物 R- 亚环己 基甘油醛和 4- 溴 -1- 丁烯混溶， R- 亚环己基甘油醛与 4- 溴 -1。
13、- 丁烯摩尔比为 1， 用硅藻土 吸收此溶液， 即得到吸附了底物的硅藻土。 调节底物与硅藻土用量， 使得底物与硅藻土的质 量比率为 0.32-0.35。所用硅藻土为普通硅藻土， 从市场上购买后， 灭菌， 无菌保存待用。 0012 底部通气搅拌反应罐中加入磷酸盐缓冲液， 装料系数为 0.6-0.7， pH 为 6.5， 加入 吸附了底物 R- 亚环己基甘油醛与 4- 溴 -1- 丁烯的硅藻土， 使底物 R- 亚环己基甘油醛添加 量为80-90 g/L， 底物R-亚环己基甘油醛与底物4-溴-1-丁烯摩尔比为1， 由此2种底物浓 度均确定了。 葡萄糖25-30 g， 木糖15-20g/L， 山梨坦单。
14、月桂酸酯为19-21g/L， 121高压灭 菌 30 分钟 ； 冷却至 26-28时， 加入湿酵母细胞使浓度为 29-32g/L， 通气比为 0.15-0.17V/ （V 分钟） ， 即每分钟通气量为 0.15-0.17 倍反应液体积， 进行生物催化反应， 反应时间为 82-89 小时 ； 反应结束后， 分别滤出细胞、 硅藻土， 用乙酸乙酯萃取反应液、 萃取硅藻土， 合 并乙酸乙酯萃取液和萃取硅藻土的乙酸乙酯， 蒸出乙酸乙酯， 得到产物 (1R,3S)-1,2- （亚环 己基二氧基） 庚-6-烯-3-醇， 反应转化率94-96， 产品收率92-94， 对映体过量率 （ee%） 97-98。 0。
15、013 本发明所开展工作包括菌株选择 （从近百个菌株中选择） 、 催化反应条件优化 （反 应温度、 通气量、 pH） 、 反应介质选择和浓度优化 （底物浓度、 葡萄糖含量、 木糖含量、 表面活 性剂种类 （20 多种选 1） 及浓度、 其它多种成份选择排除） ， 采用固体吸附控制底物产物浓 度， 从而减少对细胞的抑制， 试验了白土、 硅藻土、 棉纱布、 苎麻纱布、 大孔树酯等多种固体 材料， 还曾进行了水 - 有机溶剂 2 相体系试验。由于试验量很大， 尽管采用了响应面优化设 计试验， 大幅度减少了试验量， 试验量仍然很大， 全部试验进行 2 年多才完成， 达成目前的 技术方案。对于光活性产物。
16、而言， 当反应转化率 94-96， 产品收率 92-94时， 对映体过量 率 （ee%） 仍然高达 97-98， 是非常不易的， 我们的工作取得了显著进步。 说 明 书 CN 104313072 A 4 3/5 页 5 0014 实施例 1 种子培养基成份为: 酵母提取物10 g/L， 葡萄糖20 g/L， 蛋白胨20 g/L， pH6; 配制固 体培养基时添加 15g/L 的琼脂粉。 0015 培养液成份为 ： 葡萄糖 37 g/L, 木糖 78g/L， 玉米胚芽粉 10 g/L， 酵母提取物 4 g/L, (NH4 ) 2H PO4 12 g/L, KH2PO 4 6.5 g/L. MgS。
17、O4 .7H2O 0.7 g/L, NaCl 0.08 g/L; pH 值 7.0。 0016 湿酵母细胞制备过程如下 ： 近平滑假丝酵母 ATCC 22019D-5 经斜面、 摇瓶培养， 得到种子液。10L 发酵罐加入培养液 ； 发酵罐加入培养液， 装料系数为 0.6， 121高压灭菌 30 分钟， 冷却至 27， 将近平滑假丝酵母种子液接种至发酵罐， 接种比例为 6， 通气比为 0.5V/（V 分钟） ， 29培养 48 小时， 用过滤式离心机离心得到湿酵母细胞， 用作生物催化反 应催化剂。 0017 吸附了底物的硅藻土制作方法为， 将底物 R- 亚环己基甘油醛和 4- 溴 -1- 丁烯混。
18、 溶， R- 亚环己基甘油醛与 4- 溴 -1- 丁烯摩尔比为 1， 用硅藻土吸收此溶液， 即得到吸附了底 物的硅藻土， 调节底物与硅藻土用量， 使得底物与硅藻土的质量比率为0.32。 所用硅藻土为 普通硅藻土， 从市场上购买后， 灭菌， 无菌保存待用， 其它实施例硅藻土处理相同。 0018 50L底部通气搅拌反应罐中加入磷酸盐缓冲液， 装料系数为0.6， pH为6.5， 加入吸 附了底物 R- 亚环己基甘油醛与 4- 溴 -1- 丁烯的硅藻土， 使底物 R- 亚环己基甘油醛添加量 为 80 g/L， 底物 R- 亚环己基甘油醛与底物 4- 溴 -1- 丁烯摩尔比为 1， 葡萄糖 25 g， 。
19、木糖 15 g/L， 山梨坦单月桂酸酯为 19g/L， 121高压灭菌 30 分钟 ； 冷却至 26时， 加入湿酵母细胞 使浓度为 29g/L， 通气比为 0.15V/ （V 分钟） ， 即每分钟通气量为 0.15 倍反应液体积， 进行生 物催化反应， 反应时间为 82 小时 ； 反应结束后， 分别滤出细胞、 硅藻土， 用乙酸乙酯萃取反 应液、 萃取硅藻土， 合并乙酸乙酯萃取液和萃取硅藻土的乙酸乙酯， 蒸出乙酸乙酯， 得到产 物 (1R,3S)-1,2-（亚环己基二氧基） 庚 -6- 烯 -3- 醇， 反应转化率 94， 产品收率 92， 对 映体过量率 （ee%） 98。 0019 实施例 。
20、2 种子培养基成份为: 酵母提取物10 g/L， 葡萄糖20 g/L， 蛋白胨20 g/L， pH6; 配制固 体培养基时添加 15g/L 的琼脂粉。 0020 培养液成份为 ： 葡萄糖 44 g/L, 木糖 8g/L， 玉米胚芽粉 12 g/L， 酵母提取物 5 g/ L, (NH4 ) 2H PO4 15 g/L, KH2PO 4 7.5 g/L. MgSO4 .7H2O 0.8 g/L, NaCl 0.1 g/L; pH 值 7.0。 0021 湿酵母细胞制备过程如下 ： 近平滑假丝酵母 ATCC 22019D-5 经斜面、 摇瓶培养， 得到种子液。 100L发酵罐加入培养液 ； 发酵罐。
21、加入培养液， 装料系数为0.7， 121高压灭菌 30 分钟， 冷却至 31， 将近平滑假丝酵母种子液接种至发酵罐， 接种比例为 6.5， 通气比 为 1V/（V 分钟） ， 31培养 56 小时， 用过滤式离心机离心得到湿酵母细胞， 用作生物催化反 应催化剂。 0022 吸附了底物的硅藻土制作方法为， 将底物 R- 亚环己基甘油醛和 4- 溴 -1- 丁烯混 溶， R- 亚环己基甘油醛与 4- 溴 -1- 丁烯摩尔比为 1， 用硅藻土吸收此溶液， 即得到吸附了底 物的硅藻土， 调节底物与硅藻土用量， 使得底物与硅藻土的质量比率为0.35。 所用硅藻土为 普通硅藻土， 从市场上购买后， 灭菌，。
22、 无菌保存待用， 其它实施例硅藻土处理相同。 说 明 书 CN 104313072 A 5 4/5 页 6 0023 500L 底部通气搅拌反应罐中加入磷酸盐缓冲液， 装料系数为 0.7， pH 为 6.5， 加入 吸附了底物 R- 亚环己基甘油醛与 4- 溴 -1- 丁烯的硅藻土， 使底物 R- 亚环己基甘油醛添加 量为 90 g/L， 底物 R- 亚环己基甘油醛与底物 4- 溴 -1- 丁烯摩尔比为 1， 葡萄糖 30 g， 木糖 20g/L， 山梨坦单月桂酸酯为 21g/L， 121高压灭菌 30 分钟 ； 冷却至 28时， 加入湿酵母细 胞使浓度为 32g/L， 通气比为 0.17V/。
23、 （V 分钟） ， 即每分钟通气量为 0.12 倍反应液体积， 进行 生物催化反应， 反应时间为 89 小时 ； 反应结束后， 分别滤出细胞、 硅藻土， 用乙酸乙酯萃取 反应液、 萃取硅藻土， 合并乙酸乙酯萃取液和萃取硅藻土的乙酸乙酯， 蒸出乙酸乙酯， 得到 产物 (1R,3S)-1,2-（亚环己基二氧基） 庚 -6- 烯 -3- 醇， 反应转化率 96， 产品收率 94， 对映体过量率 （ee%） 97。 0024 实施例 3 种子培养基成份为: 酵母提取物10 g/L， 葡萄糖20 g/L， 蛋白胨20 g/L， pH6; 配制固 体培养基时添加 15g/L 的琼脂粉。 0025 培养液成。
24、份为 ： 葡萄糖 40 g/L, 木糖 7.5g/L， 玉米胚芽粉 11 g/L， 酵母提取物 4.5 g/L, (NH4 ) 2H PO4 13 g/L, KH2PO 4 7 g/L. MgSO4 .7H2O 0.75 g/L, NaCl 0.09 g/ L; pH 值 7.0。 0026 湿酵母细胞制备过程如下 ： 近平滑假丝酵母 ATCC 22019D-5 经斜面、 摇瓶培养， 得到种子液。250L 发酵罐加入培养液 ； 发酵罐加入培养液， 装料系数为 0.65， 121高压灭 菌 30 分钟， 冷却至 30， 将近平滑假丝酵母种子液接种至发酵罐， 接种比例为 6.3， 通气 比为 0.。
25、8V/（V 分钟） ， 30培养 52 小时， 用过滤式离心机离心得到湿酵母细胞， 用作生物催 化反应催化剂。 0027 吸附了底物的硅藻土制作方法为， 将底物 R- 亚环己基甘油醛和 4- 溴 -1- 丁烯混 溶， R- 亚环己基甘油醛与 4- 溴 -1- 丁烯摩尔比为 1， 用硅藻土吸收此溶液， 即得到吸附了底 物的硅藻土， 调节底物与硅藻土用量， 使得底物与硅藻土的质量比率为0.33。 所用硅藻土为 普通硅藻土， 从市场上购买后， 灭菌， 无菌保存待用， 其它实施例硅藻土处理相同。 0028 1000L 底部通气搅拌反应罐中加入磷酸盐缓冲液， 装料系数为 0.65， pH 为 6.5， 。
26、加 入吸附了底物 R- 亚环己基甘油醛与 4- 溴 -1- 丁烯的硅藻土， 使底物 R- 亚环己基甘油醛添 加量为 85 g/L， 底物 R- 亚环己基甘油醛与底物 4- 溴 -1- 丁烯摩尔比为 1， 葡萄糖 28 g， 木 糖 18 g/L， 山梨坦单月桂酸酯为 20g/L， 121高压灭菌 30 分钟 ； 冷却至 27时， 加入湿酵 母细胞使浓度为 30g/L， 通气比为 0.16V/ （V 分钟） ， 即每分钟通气量为 0.16 倍反应液体积， 进行生物催化反应， 反应时间为 87 小时 ； 反应结束后， 分别滤出细胞、 硅藻土， 用乙酸乙酯 萃取反应液、 萃取硅藻土， 合并乙酸乙酯萃。
27、取液和萃取硅藻土的乙酸乙酯， 蒸出乙酸乙酯， 得到产物 (1R,3S)-1,2-（亚环己基二氧基） 庚 -6- 烯 -3- 醇， 反应转化率 95， 产品收率 93， 对映体过量率 （ee%） 97.5。 0029 实施例 4 种子培养基成份为: 酵母提取物10 g/L， 葡萄糖20 g/L， 蛋白胨20 g/L， pH6; 配制固 体培养基时添加 15g/L 的琼脂粉。 0030 培养液成份为 ： 葡萄糖 42 g/L, 木糖 8g/L， 玉米胚芽粉 12 g/L， 酵母提取物 5 g/ L, (NH4 ) 2H PO4 15 g/L, KH2PO 4 7.5 g/L. MgSO4 .7H2。
28、O 0.75 g/L, NaCl 0.1 g/L; pH 值 7.0。 说 明 书 CN 104313072 A 6 5/5 页 7 0031 湿酵母细胞制备过程如下 ： 近平滑假丝酵母 ATCC 22019D-5 经斜面、 摇瓶培养， 得到种子液。5000L 发酵罐加入培养液 ； 发酵罐加入培养液， 装料系数为 0.7， 121高压灭 菌 30 分钟， 冷却至 31， 将近平滑假丝酵母种子液接种至发酵罐， 接种比例为 6.5， 通气 比为 1V/（V 分钟） ， 31培养 56 小时， 用过滤式离心机离心得到湿酵母细胞， 用作生物催化 反应催化剂。 0032 吸附了底物的硅藻土制作方法为， 。
29、将底物 R- 亚环己基甘油醛和 4- 溴 -1- 丁烯混 溶， R- 亚环己基甘油醛与 4- 溴 -1- 丁烯摩尔比为 1， 用硅藻土吸收此溶液， 即得到吸附了底 物的硅藻土， 调节底物与硅藻土用量， 使得底物与硅藻土的质量比率为0.35。 所用硅藻土为 普通硅藻土， 从市场上购买后， 灭菌， 无菌保存待用， 其它实施例硅藻土处理相同。 0033 20L底部通气搅拌反应罐中加入磷酸盐缓冲液， 装料系数为0.7， pH为6.5， 加入吸 附了底物 R- 亚环己基甘油醛与 4- 溴 -1- 丁烯的硅藻土， 使底物 R- 亚环己基甘油醛添加量 为 90 g/L， 底物 R- 亚环己基甘油醛与底物 4。
30、- 溴 -1- 丁烯摩尔比为 1， 葡萄糖 30 g， 木糖 19 g/L， 山梨坦单月桂酸酯为 20g/L， 121高压灭菌 30 分钟 ； 冷却至 28时， 加入湿酵母细胞 使浓度为 32g/L， 通气比为 0.165V/ （V 分钟） ， 即每分钟通气量为 0.165 倍反应液体积， 进行 生物催化反应， 反应时间为 89 小时 ； 反应结束后， 分别滤出细胞、 硅藻土， 用乙酸乙酯萃取 反应液、 萃取硅藻土， 合并乙酸乙酯萃取液和萃取硅藻土的乙酸乙酯， 蒸出乙酸乙酯， 得到 产物 (1R,3S)-1,2-（亚环己基二氧基） 庚 -6- 烯 -3- 醇， 反应转化率 96， 产品收率 93， 对映体过量率 （ee%） 98。 说 明 书 CN 104313072 A 7 。