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1、(10)申请公布号 CN 104212807 A (43)申请公布日 2014.12.17 CN 104212807 A (21)申请号 201410357846.0 (22)申请日 2014.10.15 C12N 15/12(2006.01) C07K 14/46(2006.01) A23K 1/16(2006.01) A23K 1/18(2006.01) (71)申请人 中山大学 地址 510006 广东省广州市番禺区大学城外 环东路 132 号 (72)发明人 李文笙 张聪 (74)专利代理机构 广州粤高专利商标代理有限 公司 44102 代理人 陈卫 (54) 发明名称 斜带石斑鱼 o。
2、rexin-A 在调控石斑鱼糖代谢 中的应用 (57) 摘要 本发明公开了斜带石斑鱼 orexin-A 在调控 石斑鱼糖代谢中的应用。本发明通过研究发现 orexin-A 基因对石斑鱼糖代谢具有调控功能。在 发现糖代谢功能的基础上， 本实验室利用大肠杆 菌原核表达系统获得了大量粗提级别的重组石斑 鱼 orexin-A， 并将其添加到石斑鱼饲料中进行生 理实验研究其对石斑鱼生长的影响 ； 利用本发明 可以获得来源稳定、 成本低廉的石斑鱼 orexin-A 重组蛋白， 并进一步制备适合海水鱼类使用的鱼 类促生长剂或添加剂。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 5 页 序列表 2 页。
3、 附图 9 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书5页 序列表2页 附图9页 (10)申请公布号 CN 104212807 A CN 104212807 A 1/1 页 2 1. 斜带石斑鱼 orexin-A 基因在调控石斑鱼糖代谢中的应用。 2. 斜带石斑鱼 orexin-A 蛋白在制备石斑鱼苗种促生长剂或饲料添加剂中的应用。 3. 一种石斑鱼种苗促生长剂或饲料添加剂， 其特征在于， 所述促生长剂或饲料添加剂 中含有有效剂量的重组斜带石斑鱼 orexin-A 蛋白。 4. 斜带石斑鱼 orexin-A 基因在上调肝脏或肌肉中葡萄糖转运蛋白 gl。
4、ut-1 或 glut-4 表达量中的应用。 5. 根据权利要求 4 所述应用， 其特征在于， orexin-A 基因是以葡萄糖依赖的特性刺激 上调肝脏或肌肉中葡萄糖转运蛋白 glut-1 或 glut-4 的表达量。 权 利 要 求 书 CN 104212807 A 2 1/5 页 3 斜带石斑鱼 orexin-A 在调控石斑鱼糖代谢中的应用 技术领域 0001 本发明属于基因工程技术领域， 具体涉及斜带石斑鱼 orexin-A 在调控石斑鱼糖 代谢中的应用。具体应用为将石斑鱼 orexin-A 用于制备鱼苗苗种促生长剂或饲料添加剂。 背景技术 0002 斜带石斑鱼 orexin-A （又称。
5、为食欲肽） 是由 43 个氨基酸组成的蛋白质。Orexin 是 1998 年在哺乳动物中发现的新型下丘脑神经肽， 分为 orexin-A 和 orexin-B 两种， 是来 源于同一个orexin前体信使RNA经过不同剪接、 翻译后的产物。 斜带石斑鱼Orexin-A含有 一对二硫键， 由第7位与第14位的半胱氨酸构成， 蛋白大小约为4.7Kda， 其序列与结构与哺 乳动物 orexin-A 类似， 哺乳动物 orexin-A 由 33 个氨基酸及两对链内二硫键构成， 蛋白大 小约为 3.6kda。近年来， 鱼类的 orexin-A 相继被克隆出来， 其中包括斜带石斑鱼、 鳟鱼、 鳕 鱼、 罗。
6、非鱼、 青鳉及斑马鱼等， 在基因序列与氨基酸序列的同源性上， 斜带石斑鱼 orexin-A 与其他的鱼类的同源性高于哺乳动物， 表现出在鱼类中较高的保守性。 0003 目前， 对于鱼类 orexin-A 功能及应用的研究很少， 对于哺乳动物及鱼类中的 orexin-A 研究主要集中在 orexin-A 对摄食、 体重的调控及睡眠觉醒的调控方面， 哺乳 动物中近年来已经陆续有研究表明 orexin-A 可以调控机体代谢， 而在鱼类研究中针对 orexin-A 对于糖代谢调控方面的研究则未见报道。 发明内容 0004 本发明要解决的技术问题是为了克服现有技术中缺乏有效促进石斑鱼苗种生长 的饵料添加。
7、剂的缺陷， 提供斜带石斑鱼 orexin-A 基因在调控石斑鱼糖代谢中的应用。 0005 本发明的另一个目的是提供斜带石斑鱼 orexin-A 蛋白在制备石斑鱼鱼苗苗种促 生长剂或饲料添加剂中的应用。 0006 本发明的目的通过以下技术方案予以实现 ： 斜带石斑鱼 orexin-A 基因在调控石斑鱼糖代谢中的应用。本发明通过研究发现， 用人 工合成超纯级别重组斜带石斑鱼 orexin-A 进行腹腔注射斜带石斑鱼， 结果展示， 重组斜带 石斑鱼 orexin-A 以葡萄糖依赖性刺激石斑鱼的糖代谢。 0007 本发明用于表达斜带石斑鱼 orexin-A 的基因片段是以斜带石斑鱼下丘脑总 RNA 反。
8、转录得到的 cDNA 为模板， 经 PCR 方法扩增而得到的， 它来源于斜带石斑鱼下丘脑 cDNA 上 的前体 orexin-A 片段。按照上述的斜带石斑鱼 orexin-A 重组蛋白基因序列， 它正好是斜 带石斑鱼 orexin-A 前体基因 139bp 至 267bp（相当于 1 位至 43 位氨基酸） 的片段， 其核苷 酸序列及其所编码的氨基酸序列如 SEQ ID NO ： 12 所示。 0008 本发明通过研究发现 ： 斜带石斑鱼 orexin-A 基因可以以葡萄糖依赖的特性刺激 上调肝脏或肌肉中葡萄糖转运蛋白 glut-1 或 glut-4 的表达量。所以， 本发明还保护斜带 石斑鱼。
9、 orexin-A 基因在上调肝脏或肌肉中葡萄糖转运蛋白 glut-1 或 glut-4 表达量中的 应用。 说 明 书 CN 104212807 A 3 2/5 页 4 0009 本发明提供斜带石斑鱼 orexin-A 蛋白在制备石斑鱼鱼苗苗种促生长剂或饲料添 加剂中的应用。本发明将高效表达并进行粗提纯的重组斜带石斑鱼 orexin-A 蛋白作为饲 料添加剂投喂斜带石斑鱼鱼苗， 实验结果展示 ： 饲料中添加重组斜带石斑鱼 orexin-A 蛋白 能够显著性的促进石斑鱼鱼苗的生长。 0010 石斑鱼是海洋珊瑚礁鱼类,属鮨科(Serranidae)， 石斑鱼属(Epinephelus)， 有30。
10、 多种。石斑鱼是一种名贵的海水鱼类， 具有极高的经济价值和营养价值。石斑鱼的苗种培 育是养殖生产持续发展的关键， 但目前在石斑鱼人工养殖中还没有一种能有效促进其苗种 生长的饵料添加剂。 0011 一种石斑鱼种苗促生长剂或饲料添加剂， 所述促生长剂或饲料添加剂中含有有效 剂量的重组斜带石斑鱼 orexin-A 蛋白。 本发明的有益效果是 ： 本发明通过研究发现 orexin-A 基因对石斑鱼糖代谢具有调控功能， 具体为斜带石斑 鱼 orexin-A 基因可以以葡萄糖依赖的特性刺激上调肝脏或肌肉中葡萄糖转运蛋白 glut-1 或 glut-4 的表达量。所以， 将 orexin-A 蛋白作为良好的。
11、添加剂加入饲料中， 显著性的促进 石斑鱼鱼苗的生长。 附图说明 0012 图 1. 以斜带石斑鱼下丘脑总 RNA 反转录得到的 cDNA 为模板的 orexin-A 基因中 间片段 PCR 扩增产物的凝胶电泳分析图， 其中 ： M. 分子量标准 ； 1. PCR 扩增产物。 0013 图 2. 重组质粒 PCR 和酶切鉴定凝胶电泳分析图， 其中 ： M1、 M2. 分子量标准 ； 1. PCR 鉴定 ； 2. BamH I与Hind III双酶切鉴定。 0014 图 3. 重组斜带石斑鱼 orexin-A 基因表达产物的 SDS-PAGE 凝胶电泳图谱， 其中 M 是蛋白分子量， 泳道 14 。
12、是不同批次的诱导后表达产物， 泳道 56 是未诱表达产物。 0015 图 4. 重组斜带石斑鱼 orexin-A 基因表达产物的 Western Blot 图谱， 其中泳道 16 是不同批次诱导后表达产物。 0016 图 5. 重组斜带石斑鱼 orexin-A 飞行时间质谱 MS/MS 检测一级质谱结果。 0017 图 6. 重组斜带石斑鱼 orexin-A 飞行时间质谱 MS/MS 检测二级质谱结果。 0018 图 7. 对斜带石斑鱼腹腔注射 orexin-A 对肝脏组织 glut-1 表达量的影响。 0019 图 8. 对斜带石斑鱼腹腔共注射 orexin-A 与葡萄糖对肝脏组织 glut。
13、-1 表达量的 影响。 0020 图 9. 对斜带石斑鱼腹腔注射 orexin-A 对肝脏组织 glut-4 表达量的影响。 0021 图 10. 对斜带石斑鱼腹腔共注射 orexin-A 与葡萄糖对肝脏组织 glut-4 表达量的 影响。 0022 图 11. 对斜带石斑鱼腹腔共注射 orexin-A 对肌肉组织 glut-1 表达量的影响。 0023 图 12. 对斜带石斑鱼腹腔共注射 orexin-A 与葡萄糖对肌肉组织 glut-1 表达量的 影响。 0024 图 13. 对斜带石斑鱼腹腔共注射 orexin-A 对肌肉组织 glut-4 表达量的影响。 0025 图 14. 对斜带石。
14、斑鱼腹腔共注射 orexin-A 与葡萄糖对肌肉组织 glut-4 表达量的 影响。 说 明 书 CN 104212807 A 4 3/5 页 5 0026 图 15.orexin-A 蛋白作为饲料添加剂投喂斜带石斑鱼鱼苗对石斑鱼体重的影响。 0027 图 16.orexin-A 蛋白作为饲料添加剂投喂斜带石斑鱼鱼苗对石斑鱼肝、 肌糖原的 影响。 具体实施方式 0028 下面结合说明书附图和具体实施例进一步详细说明本发明。除非特别说明， 本发 明采用的试剂、 设备为本技术领域常规试剂和设备。 0029 实施例 1 ： 斜带石斑鱼 orexin-A 基因的合成与表达载体的构建 根据已发表的石斑鱼。
15、前体 orexin 的 cDNA 序列， 以与斜带石斑鱼下丘脑的 cDNA 全序列为引物设计模板， 设计合成一对特异性引物并且加入了保护碱基， 上游引 物 F 的 序 列 为 ： 5 - CGGGATCCGCACAGCGTGTCTGAGTGC-3 ， 下 游 引 物 R 的 序 列 为 ： 5 - CCCAAGCTTCAGGGTGAGAATGCCAGC-3 。PCR 反应是以斜带石斑鱼下丘脑总 RNA 反转录得到的 cDNA 为模板， 经 PCR 方法扩增 orexin-A 序列， 反应条件为 ： 95预变性 5 分钟 ； 下边为 38 个循环， 分为 95变性 30 秒， 58退火 30 秒。
16、， 72延伸 15 秒， 共 40 个循环 ； PCR 扩增产 物的电泳鉴定图见图 1。从图 1 可见第一次 PCR 扩增了一段长约 150bp 的序列。将目的条 带用 E.Z.N.A. Gel Extraction Kit 回收。 0030 质粒 pET22b+ 与 orexin-A PCR 胶回收产物经限制酶BamH I与Hind III双酶切 后， 酶切产物用 E.Z.N.A. Gel Extraction Kit 回收。胶回收后的 orexin-A 基因片段与 载体片段按 3:1 混合， 用 MBI T4 连接酶 22连接 16 小时后用标准氯化钙转化法转入大肠 杆菌 DH5 中， 筛。
17、选具氨苄青霉素抗性的转化子， 以标准方法提取质粒， 筛选大小约 5.4kb 的重组质粒， 用限制酶BamH I与Hind III双酶切重组质粒， 得到 150bp 和 5.4kb 的两个 片段， 大小分别与斜带石斑鱼 orexin-A 基因和表达载体 pET22b+ 大小相同， 证明斜带石斑 鱼 orexin-A 基因已克隆入大肠杆菌表达载体 pET22b+ 中， 将重组质粒 pET22b-orexin-A 用 pET22b 的一对通用引物进行序列测定， 测序结果与 Genebank 的序列进行比较， 结果表明克 隆的 PCR 产物是斜带石斑鱼 orexin-A 基因， 重组质粒命名为 pET。
18、22b-orexin-A。质粒构建 与酶切分析图见图 2。 0031 实施例 2 高效表达斜带石斑鱼 orexin-A 的大肠杆菌重组株 pET22b-orexin-A-Origami 的构建 CaCl2法将 pET22b-orexin-A 转化 Origami 2(DE3)， 在含氨苄青霉素、 链霉素及四环素 的 LB 平板上筛选转化子， 经质粒检测和酶切分析获得含 pET22b-orexin-A 的重组转化子 pET22b-orexin-A-Origami。 0032 实施例 3 ： 利用大肠杆菌基因工程菌 pET22b-orexin-A-Origami 生产重组斜带石斑鱼 orexin-。
19、A ： 挑取大肠杆菌基因工程菌 pET22b-orexin-A-Origami 单菌落接种在含有 100ug/ml 氨苄青 霉素、 50ug/ml链霉素、 25ug/ml四环素的LB液体培养基中， 37， 200转/分培养过夜， 次日 按 1:50 接种量接种于适当体积的相同培养基中， 37培养至 A600为 0.5 0.6， 加入 IPTG （终浓度为 0.8mmol/l） 和 20葡萄糖 （终浓度为 0.2） ， 于 37诱导培养 6 小时后收菌。 合成的斜带石斑鱼胚胎期 orexin-A 在大肠杆菌基因工程菌 pET22b-orexin-A-Origami 中 已获得高效表达。 说 明 。
20、书 CN 104212807 A 5 4/5 页 6 0033 取少量细胞加 2 电泳上样缓冲液， 煮沸 5 分钟后按标准方法跑 SDS-PAGE 凝胶 电泳。结果见图 9， 显示经诱导的 pET22b-orexin-A-Origami 在约 7kD 的位置上出现一 条新的蛋白带， 未诱导的 pET22b-orexin-A-Origami 不出现此带， 证明斜带石斑鱼胚胎期 orexin-A 已在 pET22b-orexin-A-Origami 中诱导表达， 见图 3。 0034 将重组斜带石斑鱼胚胎期 orexin-A 采用免疫印迹 （Western blot） 方法进行免疫 活性鉴定。一抗。
21、为兔抗 His 标签单克隆抗体， 二抗为羊抗兔 IgG-AP。结果见图 4， 显示兔抗 His 标签单克隆抗体能识别我们用大肠杆菌表达的融合 orexin-A 蛋白。 0035 将SDS-PAGE上的蛋白进行点靶后进行时间飞行质谱MS/MS检测， 检测结果表明目 标蛋白与预期蛋白完全匹配， 见图 5、 6。结合 pET22b-orexin-A 重组子的 DNA 测序结果， 证 明得到的蛋白是重组斜带石斑鱼 orexin-A。 0036 实施例 4 用人工合成超纯级别重组斜带石斑鱼 orexin-A 进行腹腔注射斜带石斑鱼并测定 orexin-A 对石斑鱼糖代谢调控功能的检测。 0037 实验用。
22、石斑鱼驯养于循环海水养殖池中， 自然光照， 每天早7:00和晚6:00分别进 行饱食投喂， 驯养两周， 在注射实验进行前， 对实验用鱼进行饥饿 3 天处理。对于 orexin-A 注射组， 实验鱼随机分成 4 组， 每组 44 条， 分别注射 0ng/g B.W.、 10ng/g B.W.、 100ng/g B.W.、 1000ng/g B.W. 的 OXA， OXA 用 PBS 稀释， 对照组 0ng/g B.W. 注射 PBS。每组注射后 0h、 2h、 4h、 6h 取肝脏、 肌肉 （白肌） ， 液氮速冻， 保存于 -80备用。对于 orexin-A+ 葡萄糖注 射组， 实验鱼随机分成4。
23、组， 每组44条， 分别注射0ng/g B.W.、 10ng/g B.W.、 100ng/g B.W.、 1000ng/g B.W. 的 OXA， OXA 用 0.002 g/g 的葡萄糖 （PBS 溶解）溶液稀释， 对照组 0ng/g B.W. 注射 0.002 g/g B.W. 的葡萄糖。每组注射后 0h、 2h、 4h、 6h 取肝脏、 肌肉 （白肌） ， 液氮 速冻， 保存于 -80备用。 0038 所取样本参照 Trizol Reagent(Invitrogen, Inc.) 说明书进行 RNA 提取， 参照 Toyobo FSK-100 试剂盒说明书进行反转录， 参照 Toyobo。
24、 SYBR-Green 说明书进行实时荧光 定量PCR检测相关基因的表达量变化。 试验结果如图7、 8、 9、 10、 11、 12、 13、 14。 Orexin-A在 肝脏、 肌肉中均以葡萄糖依赖的特性刺激葡萄糖转运蛋白 glut-1， glut-4 的表达量上调。 0039 实施例 5 orexin-A 蛋白作为饲料添加剂投喂斜带石斑鱼鱼苗对石斑鱼生长特性的影响 实验用斜带石斑鱼购自广东省大亚湾养殖示范基地， 共 480 尾， 体重平均为 50g， 体长 平均 15cm。驯养于循环海水养殖池中， 自然光照， 每天早 7:00 和晚 6:00 分别进行饱食投 喂， 驯养两周。 驯化完成后，。
25、 条件与驯化时期相同， 在投喂前进行蛋白喷洒， 使蛋白均匀喷洒 到饲料表面， 投喂前后进行饲料称重记录。长期投喂添加重组 Orexin-A 的饲料对斜带石斑 鱼体重的影响见图 15， 对照组投喂喷洒灭菌超纯水的常规含糖饲料， 实验组在常规含糖饲 料的基础上添加不同剂量的重组 Orexin-A， 实验连续投喂 6 周， 所得数据用标准差 标准 误来表示 （n=40） ， 标记星号表示实验组与对照组相比产生的显著性差异水平， 显著性结果 通过单因素方差分析得到， 采用Duncan分析方法 （P 中山大学 斜带石斑鱼 orexin-A 在调控石斑鱼糖代谢中的应用 4 PatentIn version。
26、 3.3 1 129 DNA Orexin-A 基因片段序列 1 cacagcgtgt ctgagtgctg cagacaacca cctcgcaatt gtcgcctcca tgtgttgctt 60 tgtcgctctg gcagcaaaaa tctgggggga acgctcacag gagacgctgc tgctggcatt 120 ctcaccctg 129 2 43 PRT Orexin-A 基因片段编码氨基酸序列 2 His Ser Val Ser Glu Cys Cys Arg Gln Pro Pro Arg Asn Cys Arg Leu 1 5 10 15 His Val 。
27、Leu Leu Cys Arg Ser Gly Ser Lys Asn Leu Gly Gly Thr Leu 20 25 30 序 列 表 CN 104212807 A 8 2/2 页 9 Thr Gly Asp Ala Ala Ala Gly Ile Leu Thr Leu 35 40 3 27 DNA 上游引物 F 3 cgggatccgc acagcgtgtc tgagtgc 27 4 27 DNA 下游引物 R 4 cccaagcttc agggtgagaa tgccagc 27 序 列 表 CN 104212807 A 9 1/9 页 10 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN。
28、 104212807 A 10 2/9 页 11 图 3 图 4 说 明 书 附 图 CN 104212807 A 11 3/9 页 12 图 5 图 6 说 明 书 附 图 CN 104212807 A 12 4/9 页 13 图 7 图 8 说 明 书 附 图 CN 104212807 A 13 5/9 页 14 图 9 图 10 说 明 书 附 图 CN 104212807 A 14 6/9 页 15 图 11 说 明 书 附 图 CN 104212807 A 15 7/9 页 16 图 12 图 13 说 明 书 附 图 CN 104212807 A 16 8/9 页 17 图 14 图 15 说 明 书 附 图 CN 104212807 A 17 9/9 页 18 图 16 说 明 书 附 图 CN 104212807 A 18 。