酰氯化蓝萼甲素衍生物及其制备方法和应用.pdf

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摘要
申请专利号:

CN200910056459.2

申请日:

2009.08.14

公开号:

CN101993373A

公开日:

2011.03.30

当前法律状态:

撤回

有效性:

无权

法律详情:

发明专利申请公布后的视为撤回IPC(主分类):C07C 69/78申请公布日:20110330|||公开

IPC分类号:

C07C69/78; C07C309/73; C07C67/14; C07C303/28; A61K31/235; A61K31/255; A61P35/00

主分类号:

C07C69/78

申请人:

上海金昊药业开发有限公司

发明人:

李云森; 陈子珺; 程萍; 雷启福

地址:

201203 上海市浦东新区张江哈雷路1043号8号楼303室

优先权:

专利代理机构:

上海新天专利代理有限公司 31213

代理人:

王敏杰

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内容摘要

本发明公开了一种酰氯化蓝萼甲素衍生物的结构、制备方法及其在治疗癌症中的应用。所述酰氯化蓝萼甲素衍生物的分子结构的通式如下:其中,R1为苯甲酰氯取代基-C7H6O2、苯磺酰氯取代基-C6H6O3S2或-OH,R2为苯甲酰氯取代基-C7H6O2、苯磺酰氯取代基-C6H6O3S2或-OH。本发明所公开的制备方式是在三乙胺和4-二甲氨基吡啶存在的条件下,将经提取处理后的蓝萼甲素与苯甲酰氯或苯磺酰氯反应,从而制备得到本发明所公开的酰氯化蓝萼甲素衍生物。

权利要求书

1: 一种酰氯化蓝萼甲素衍生物, 其特征在于, 是一种贝壳杉烷型四环二萜类物质, 具有 贝壳杉烷型结构、 羰基、 羟基和酰氯结构, 其分子结构的通式如下 : 其中, R1 为苯甲酰氯取代基 -C7H6O2、 苯磺酰氯取代基 -C6H6O3S2 或 -OH, R2 为苯甲酰 氯取代基 -C7H6O2、 苯磺酰氯取代基 -C6H6O3S2 或 -OH, R1 和 R2 中至少有一个为 -OH。
2: 如权利要求 1 所述的酰氯化蓝萼甲素衍生物, 其特征在于, 所述 R1 为 -C7H6O2, 所述 R2 为 -OH, 其分子结构如下 :
3: 如权利要求 1 所述的酰氯化蓝萼甲素衍生物, 其特征在于, 所述 R1 为 -OH, 所述 R2 为 -C7H6O2, 其分子结构如下 :
4: 如权利要求 1 所述的酰氯化蓝萼甲素衍生物, 其特征在于, 所述 R1 为 -C6H6O3S2, 所 述 R2 为 -OH, 其分子结构如下 : 2
5: 如权利要求 1 所述的酰氯化蓝萼甲素衍生物, 其特征在于, 所述 R1 为 -OH, 所述 R2 为 -C6H6O3S2, 其分子结构如下 :
6: 一种如权利要求 1 所述的酰氯化蓝萼甲素衍生物的制备方法, 其特征在于, 包含以 下步骤 : 步骤 1 : 提取 步骤 1.1 : 取香茶菜药材 ( 地上部分 ) 粉碎至 20 目~ 50 目 ; 步骤 1.2 : 将所得的粉碎物与 95 %乙醇按照体积比 1 ∶ 5 ~ 1 ∶ 15 混合, 加热, 在 80℃~ 90℃温度条件下回流 1 ~ 2 小时, 提取、 过滤, 得到提取液和剩余物 ; 步骤 1.3 : 将步骤 1.2 所得的剩余物与 95%乙醇按照体积比 1 ∶ 5 ~ 1 ∶ 15 混合, 加 热, 在 80℃~ 90℃温度条件下回流 1 ~ 2 小时, 提取、 过滤, 得到提取液和剩余物, 重复该步 骤1~3次; 步骤 1.4 : 合并步骤 1.2 和 1.3 所得的提取液 ; 步骤 2 : 溶剂处理 步骤 2.1 : 将步骤 1 所得的提取液加热, 在 55℃~ 65℃温度条件下加热减压浓缩, 回收 乙醇并得到粘稠的初级浓缩物 ; 步骤 2.2 : 将步骤 2.1 所得的初级浓缩物与水按照体积比 1 ∶ 8 ~ 1 ∶ 10 混合, 在室 温条件下以 60 ~ 120 转 / 分的速度搅拌 10 分钟, 随后静置 6 ~ 12 小时, 弃去上清液得到 下层固体 ; 步骤 2.3 : 将步骤 2.2 所得的固体与乙酸乙酯按照体积比 1 ∶ 4 ~ 1 ∶ 6 混合, 在 25℃~ 35℃温度条件下以 60 ~ 120 转 / 分的速度搅拌溶解, 静置 1 ~ 3 小时, 过滤得到滤液和不 溶物 ; 步骤 2.4 : 将步骤 2.3 所得的不溶物与乙酸乙酯按照体积比 1 ∶ 4 ~ 1 ∶ 6 混合, 在 25℃~ 35℃温度条件下以 60 ~ 120 转 / 分的速度搅拌溶解, 静置 1 ~ 3 小时, 过滤得到滤 液和不溶物, 重复该步骤 1 ~ 3 次 ; 3 步骤 2.5 : 合并步骤 2.3 和 2.4 所得的滤液 ; 步骤 2.6 : 将步骤 2.5 所得的滤液加热, 在 35℃~ 45℃温度条件下加热减压浓缩, 回收 乙酸乙酯, 得到固体浓缩物 ; 步骤 3 : 树脂处理 步骤 3.1 : 将步骤 2 所得的固体浓缩物与 95%乙醇按照体积比 1 ∶ 4 ~ 1 ∶ 6 混合溶 解, 得到溶液 ; 步骤 3.2 : 将步骤 3.1 所得的溶液缓慢加到 7 号树脂柱中, 起观察树脂的颜色, 在树脂 柱有 2/3 变色时, 停止加样, 并采用 200ml ~ 400ml 的 95%乙醇冲洗该树脂柱, 收集所有流 出液, 所述树脂柱的填充物为强碱性阴离子树脂并用氢氧化钠饱和至 pH 值中性 ; 步骤 3.3 : 将步骤 3.2 所得流出液加热, 并在 55℃~ 65℃温度条件下加热减压回流, 直 至溶剂干, 得到固体残留物 ; 步骤 4 : 重结晶 步骤 4.1 : 将上述残留物与 30℃~ 40℃的极性溶剂按照体积比 1 ∶ 4 ~ 1 ∶ 6 混合, 得到初级溶液, 加热, 在 30℃的~ 40℃温度条件下减压浓缩, 在 -23℃~ -13℃温度条件下 静置析晶, 过滤得到浅黄色针状结晶 ; 所述极性溶剂为按照体积比 1 ∶ 1 ~ 1 ∶ 2 混合的氯仿和丙酮的混合溶液 ; 步 骤 4.2 : 将 步 骤 4.1 所 得 的 结 晶 与 极 性 溶 剂 按 照 体 积 比 1 ∶ 4 ~ 1 ∶ 6 混 合, 在 -23℃~ -13℃温度条件下反复重结晶 2 ~ 4 次, 每次 12 ~ 24 小时, 得到中间产物蓝萼 甲素 ; 所述极性溶剂为按照体积比 1 ∶ 1 ~ 1 ∶ 4 混合的氯仿和丙酮的混合溶液 ; 步骤 5 : 衍生化 将所得中间产物溶于二氯甲烷溶液, 在冰水浴条件下, 加入苯甲酰氯或苯磺酰氯溶液、 三乙胺和 4- 二甲氨基吡啶 (DMAP), 室温搅拌, 采用二氯甲烷萃取, 合并有机相, 蒸去溶剂并 干燥, 得到酰氯化蓝萼甲素衍生物。
7: 如权利要求 6 所述的酰氯化蓝萼甲素衍生物的制备方法, 其特征在于, 所述步骤 5 进 一步包含以下步骤 : 步骤 5.1 : 将 90 ~ 110mg 步骤 4 所得蓝萼甲素溶于 3 ~ 7ml 二氯甲烷中, 并在 0℃~ 5℃ 的冰水浴条件下, 缓慢依次加入 41.5 ~ 51.5mg 苯甲酰氯、 40.6 ~ 50.6mg 三乙胺和 3.1 ~ 4.1mgDMAP, 在室温条件下搅拌反应 12 小时 ; 步骤 5.2 : 向步骤 5.1 的反应溶液中加入 5 ~ 15ml 水稀释, 随后采用 5 ~ 15ml 二氯甲 烷萃取 2 ~ 4 次, 合并有机相并采用饱和食盐水洗涤、 无水硫酸钠干燥 ; 步骤 5.3 : 将步骤 5.2 中经洗涤干燥后的有机相加热至 35℃~ 40℃减压浓缩以蒸去溶 剂, 并在室温条件下干燥, 得到白色粉末状产物 ; 步骤 5.4 : 采用高效制备薄层层析硅胶板分离步骤 5.3 所得白色粉末状产物, 将分离所 得产物溶于 15 ~ 25ml 甲醇, 过滤并将所得滤液加热至 35℃~ 40℃减压浓缩至干, 得到蓝 萼甲素的苯甲酰氯衍生物的无色晶体。
8: 如权利要求 6 所述的酰氯化蓝萼甲素衍生物的制备方法, 其特征在于, 所述步骤 5 进 一步包含以下步骤 : 步骤 5.1 : 将 90 ~ 110mg 步骤 4 所得蓝萼甲素溶于 3 ~ 7ml 二氯甲烷中, 并在 0℃~ 4 5℃的冰水浴条件下, 缓慢依次加入 106.8 ~ 126.8mg 苯磺酰氯、 86.3 ~ 96.3mg 三乙胺和 6.2 ~ 8.2mgDMAP, 在室温条件下搅拌反应 12 小时 ; 步骤 5.2 : 向步骤 5.1 的反应溶液中加入 5 ~ 15ml 水稀释, 随后采用 5 ~ 15ml 二氯甲 烷萃取 2 ~ 4 次, 合并有机相并采用饱和食盐水洗涤、 无水硫酸钠干燥 ; 步骤 5.3 : 将步骤 5.2 中经洗涤干燥后的有机相加热至 35℃~ 40℃减压浓缩以蒸去溶 剂, 并在室温条件下干燥, 得到白色粉末状产物 ; 步骤 5.4 : 采用高效制备薄层层析硅胶板分离步骤 5.3 所得白色粉末状产物, 将分离所 得产物溶于 15 ~ 25ml 甲醇, 过滤并将所得滤液加热至 35℃~ 40℃减压浓缩至干, 得到蓝 萼甲素的苯磺酰氯衍生物的无色晶体。
9: 如权利要求 1 ~ 5 所述的酰氯化蓝萼甲素衍生物在治疗癌症中的应用。
10: 如权利要求 1 ~ 5 所述的酰氯化蓝萼甲素衍生物在治疗胃癌、 肝癌、 乳腺癌、 食管 癌、 肺癌、 宫颈癌、 人结肠癌中的应用。

说明书


酰氯化蓝萼甲素衍生物及其制备方法和应用

    技术领域 本发明涉及蓝萼甲素 (GLA) 衍生物, 特别涉及酰氯化蓝萼甲素衍生物。本发明还 涉及所述酰氯化蓝萼甲素衍生物的制备方法及其在治疗癌症中的应用。
     背景技术 唇形科香茶菜属植物。在亚洲东部和非洲西部广为分布, 全世界约有 150 种, 我国 约有 90 种 25 个变种。其中约有 30 种民间作为药用, 作为清热解毒、 抗癌消炎、 健脾、 活血、 杭菌药来使用。 人们对该属植物的 - 菇类成分作了研究, 已从中提取了百余种药类成分。 经 药理筛选发现许多二萜化合物具有细胞毒、 抗肿瘤、 杭炎活性作用。
     蓝萼香茶菜是唇形科香茶菜属植物, 分布在我国的东北、 华北, 朝鲜 . 日本, 原苏 联远东地区, 吉林省资源尤其丰富。 蓝萼香茶菜具有健胃、 清热解毒、 活血、 抗菌消炎和抗癌 活性, 用于胃炎、 肝炎初起、 感冒发热、 乳腺炎、 关节痛等疾病。现代研究发现全草对心血管 有一定的作用, 而其中的有效成分对血小板聚集及癌症有一定的影响。
     1981 年许云龙等人从蓝萼香茶菜中提取出蓝萼甲素 (glaucocalyxinA) 和蓝萼乙 素 (glaucocalyxinB), 从光谱中推断蓝萼甲素具有香茶菜属二萜典型的巧一氧 -16 一贝壳 杉烯 (ent-15-oxo-l6-kaurene) 骨架, 而蓝萼乙素是蓝萼甲素的 14 一乙酰化物, 把两者分 别乙酰化, 得到相同的乙酰化物, 从而证实了两者的相互关系。 随后赵全成也从吉林产蓝萼 香茶菜中分得这两种二萜。
     1988 年刘晨江等从北京地区产蓝萼香茶菜中分得甲素和乙素外, 还分得蓝萼丙素 (glaucocalyxinC), 结构为对映 -7p, 14a, 15a- 三羟基 -16- 贝壳杉 -3- 酮。Dongsa kimls, 除了从中分出蓝萼甲素、 蓝萼乙素和蓝萼丙素, 还分出了两种新二萜 glaucocalyxinD 和 glaucocalyxinE 并列出了这五种化合物的结构红外紫外吸收值、 最主要的 1H 一核磁共振、 13C 一核磁共振化学位移值及质谱数据值。
     金永日等从蓝萼香茶菜根中分得了蓝萼甲素, 另外王先荣等从安徽产王枣子 〔 lsodonamethystoides(Benth)CyWuetHsuan〕 中也分得蓝萼甲素。王慧芬等人用反相高效 液相色谱法外标法对不同部位及不同采集期的蓝萼香茶菜中蓝萼甲素的含量进行了测定, 结果表明叶中蓝萼甲素远高于根、 茎。不同采集期以 7-8 月份含量高, 9 月末含量下降。张 元桐等也采用反相 HPLC 测定蓝萼甲素含量, 测得蓝萼甲素含量为 1.03 %, 平均回收率为 99.2%。
     从蓝萼甲素体内外实验结果来看, 其具有较强的抗肿瘤作用, 且抗瘤谱较广, 能抑 制 Lewis 肺癌、 5180 实体型以及 HCA 实体型等实体瘤的生长, 明显增加荷腹水型 5180 腹水 型和荷 HCA 腹水型小鼠的生命延长率, 其抗肿瘤作用的强弱呈剂量依赖性。
     科研人员用 MTT 法对从毛叶香茶菜叶中分离鉴定的 14 个已知对映 - 贝壳杉烯类 二萜化合物进行了人早幼粒白血病细胞、 人卵巢癌细胞和人肺癌细胞的抗癌活性研究, 其 中具有 α- 亚甲基环戊酮结构的化合物对上述 3 种肿瘤细胞株均表现出不同程度的抑制 活性。从蓝萼香茶菜叶分离的化合物如蓝尊香茶菜甲素 (GLA) 和乙素 (GLB) 结构中具有
     α- 亚甲基环戊酮, 因而显示出较强的生物活性。
     对若干天然及化学修饰后的贝克杉烯类化合物进行了系统的体外抗肿瘤活性筛 选及构效关系研究表明, 应用化学手段破坏分子中 α- 亚甲基环戊酮结构单元, 会显著降 低贝克杉烯类化合物的抗肿瘤活性。
     由于蓝萼甲素为对映 - 贝壳杉烯类二萜化合物, 其化合物极性小, 易溶于氯仿等 非极性溶剂, 在水中不溶, 因此不适合直接作为药物进行给药 ; 蓝萼甲素体外具有明显的抗 癌作用, 但在体内需大剂量长时间用药才能产生药效。药物在体内消除很快, 半衰期短, 尚 不能直接作为药物使用。 发明内容 鉴于蓝萼甲素 (GLA) 特别是其 α- 亚甲基环戊酮结构对肿瘤细胞株活性具有良好 的抑制作用, 然而由于其极性小、 半衰期短等特点, 其不适于直接作为药物进行给药, 故现 在需要以蓝萼甲素 (GLA) 为先导化合物, 通过对先导化合物的结构改造, 来获得蓝萼甲素 的衍生物, 从而使其按照已知的代谢途径失活或不代谢, 而由原形排出体外, 从而提高药物 的安全性, 增加药效。
     本发明的目的之一在于提供具有对肿瘤细胞株良好的抑制作用的、 结构改良的酰 氯化蓝萼甲素 (GLA) 衍生物, 从而解决 GLA 极性小、 不易溶于水、 半衰期短、 在体内消除过快 等缺陷, 从而作为治疗癌症的药物使用。
     本发明的目的之二在于提供所述酰氯化蓝萼甲素衍生物的制备方法, 避免单纯的 采用有机合成所带来的毒副作用较大的缺陷, 并且避免单纯的采用原料提纯多带来的药效 较低、 无法针对性治疗某一特定癌症的缺陷。
     本发明所公开的酰氯化蓝萼甲素衍生物是一种贝壳杉烷型四环二萜类物质, 具有 贝壳杉烷型结构、 羰基、 羟基和酰氯结构, 其分子结构的通式如下 :
     其中, R1 为苯甲酰氯取代基 -C7H6O2、 苯磺酰氯取代基 -C6H6O3S2 或 -OH, R2 为苯 甲酰氯取代基 -C7H6O2、 苯磺酰氯取代基 -C6H6O3S2 或 -OH。
     故, 在较佳的优选实施例中, 所述 R1 和 R2 中至少有一个为 -OH。
     在一个优选实施例中, 所述 R1 为 -C7H6O2, 所述 R2 为 -OH, 所述衍生物分子结构如 下:
     在一个优选实施例中, 所述 R1 为 -OH, 所述 R2 为 -C7H6O2, 所述衍生物分子结构如下。
     在一个优选实施例中, 所述 R1 为 -C6H6O3S2, 所述 R2 为 -OH, 所述衍生物分子结构如下 :
     在一个优选实施例中, 所述 R1 为 -OH, 所述 R2 为 -C6H6O3S2, 所述衍生物分子结构如下 :
     上述酰氯化 GLA 衍生物由于具有 GLA 的 α- 亚甲基环戊酮结构, 故其对肿瘤细胞 株活性具有良好的抑制作用, 另一方面, 上述多肽类 GLA 进行了结构修饰, 解决了极性小、 半衰期短等缺陷特点, 适于作为治疗癌症的药物使用。
     上述酰氯化蓝萼甲素衍生物是按照以下方法进行制备的, 其包含用于制备作为先 导化合物的蓝萼甲素的步骤 1 ~ 4 以及用于结构修饰蓝萼甲素进行衍生化的步骤 5。
     所述步骤 1 为提取步骤, 具体包括以下步骤 :
     步骤 1.1 : 取香茶菜药材 ( 地上部分 ) 粉碎至 20 目~ 50 目 ;
     步骤 1.2 : 将所得的粉碎物与 95%乙醇 (A.R.) 按照体积比 1 ∶ 5 ~ 1 ∶ 15 混合, 加热, 在 80℃~ 90℃温度条件下回流 1 ~ 2 小时, 提取、 过滤, 得到提取液和剩余物 ;
     步骤 1.3 : 将步骤 1.2 所得的剩余物与 95 %乙醇 (A.R.) 按照体积比 1 ∶ 5 ~ 1 ∶ 15 混合, 加热, 在 80℃~ 90℃温度条件下回流 1 ~ 2 小时, 提取、 过滤, 得到提取液和剩 余物, 重复该步骤 1 ~ 3 次 ;
     步骤 1.4 : 合并步骤 1.2 和 1.3 所得的提取液。
     所述步骤 2 为溶剂处理步骤, 具体包括以下步骤 :
     步骤 2.1 : 将步骤 1 所得的提取液加热, 在 55℃~ 65℃温度条件下加热减压浓缩, 回收乙醇并得到粘稠的初级浓缩物 ;
     步骤 2.2 : 将步骤 2.1 所得的初级浓缩物与水按照体积比 1 ∶ 8 ~ 1 ∶ 10 混合, 在室温条件下以 60 ~ 120 转 / 分的速度搅拌 10 分钟, 随后静置 6 ~ 12 小时, 弃去上清液 得到下层固体 ;
     步骤 2.3 : 将步骤 2.2 所得的固体与乙酸乙酯 (A.R.) 按照体积比 1 ∶ 4 ~ 1 ∶ 6 混合, 在 25℃~ 35℃温度条件下以 60 ~ 120 转 / 分的速度搅拌溶解, 静置 1 ~ 3 小时, 过 滤得到滤液和不溶物 ;
     步骤 2.4 : 将步骤 2.3 所得的不溶物与乙酸乙酯 (A.R.) 按照体积比 1 ∶ 4 ~ 1 ∶ 6 混合, 在 25℃~ 35℃温度条件下以 60 ~ 120 转 / 分的速度搅拌溶解, 静置 1 ~ 3 小时, 过 滤得到滤液和不溶物, 重复该步骤 1 ~ 3 次 ;
     步骤 2.5 : 合并步骤 2.3 和 2.4 所得的滤液 ;
     步骤 2.6 : 将步骤 2.5 所得的滤液加热, 在 35℃~ 45℃温度条件下加热减压浓缩, 回收乙酸乙酯 (A.R.), 得到固体浓缩物。
     所述步骤 3 为树脂处理步骤, 具体包括以下步骤 :
     步骤 3.1 : 将步骤 2 所得的固体浓缩物与 95%乙醇 (A.R.) 按照体积比 1 ∶ 4 ~ 1 ∶ 6 混合溶解, 得到溶液 ;
     步骤 3.2 : 将步骤 3.1 所得的溶液缓慢加到 7 号树脂柱中, 起观察树脂的颜色, 在 树脂柱有 2/3 变色时, 停止加样, 并采用 200ml ~ 400ml 的 95%乙醇 (A.R.) 冲洗该树脂柱, 收集所有流出液, 所述树脂柱的填充物为强碱性阴离子树脂并用氢氧化钠饱和至 pH 值中 性;
     步骤 3.3 : 将步骤 3.2 所得流出液加热, 并在 55℃~ 65℃温度条件下加热减压回 流, 直至溶剂干, 得到固体残留物。
     所述步骤 4 为重结晶步骤, 具体包括以下步骤 :
     步骤 4.1 : 将上述残留物与 30℃~ 40℃的极性溶剂按照体积比 1 ∶ 4 ~ 1 ∶ 6 混合, 得到初级溶液, 加热, 在 30℃的~ 40℃温度条件下减压浓缩, 在 -23℃~ -13℃温度条件 下静置析晶, 过滤得到浅黄色针状结晶 ;
     所述极性溶剂为按照体积比 1 ∶ 1 ~ 1 ∶ 2 混合的氯仿 (A.R.) 和丙酮 (A.R.) 的 混合溶液 ;
     步骤 4.2 : 将步骤 4.1 所得的结晶与极性溶剂按照体积比 1 ∶ 4 ~ 1 ∶ 6 混合, 在 -23℃~ -13℃温度条件下反复重结晶 2 ~ 4 次, 每次 12 ~ 24 小时, 得到中间产物蓝萼 甲素 ;
     所述极性溶剂为按照体积比 1 ∶ 1 ~ 1 ∶ 4 混合的氯仿 (A.R.) 和丙酮 (A.R.) 的 混合溶液。
     所述步骤 5 为衍生化步骤, 具体包括以下步骤 :
     步骤 5.1 : 将 90 ~ 110mg 步骤 4 所得蓝萼甲素溶于 3 ~ 7ml 二氯甲烷中, 并在 0℃~ 5℃的冰水浴条件下, 缓慢依次加入苯甲酰氯或苯磺酰氯、 40.6 ~ 50.6mg 三乙胺和 3.1 ~ 4.1mgDMAP, 并在室温条件下搅拌反应 12 小时 ;
     步骤 5.2 : 向步骤 5.1 的反应溶液中加入 5 ~ 15ml 水稀释, 随后采用 5 ~ 15ml 二 氯甲烷萃取 2 ~ 4 次, 合并有机相并采用饱和食盐水洗涤、 无水硫酸钠干燥 ; 步骤 5.3 : 将步骤 5.2 中经洗涤干燥后的有机相加热至 35℃~ 40℃减压浓缩以蒸 去溶剂, 并在室温条件下干燥, 得到白色粉末状产物 ;
     步骤 5.4 : 采用高效制备薄层层析硅胶板分离步骤 5.3 所得白色粉末状产物, 将分 离所得产物溶于 15 ~ 25ml 甲醇, 过滤并将所得滤液加热至 35℃~ 40℃减压浓缩至干, 得 到蓝萼甲素的苯甲酰氯衍生物的无色晶体。
     经上述制备过程所得的酰氯化蓝萼甲素衍生物, 由于具有 α- 亚甲基环戊酮结 构, 故其对肿瘤细胞株具有良好的抑制作用, 可用于治疗癌症, 特别用于治疗胃癌、 肝癌、 乳 腺癌、 食管癌、 肺癌、 宫颈癌、 人结肠癌。
     本发明同时公开了所述酰氯化蓝萼甲素衍生物在治疗癌症中的应用, 特别是在治 疗胃癌、 肝癌、 乳腺癌、 食管癌、 肺癌、 宫颈癌、 人结肠癌中的应用。
     本发明所公开的前述任一结构的酰氯化蓝萼甲素衍生物可以采用药剂学上的常 规药物载体制成任何一种剂型, 包括但不限于片剂、 胶囊剂、 软胶剂、 喷雾剂、 凝胶剂、 凝胶 吸入剂、 口服剂、 混悬剂、 冲剂、 贴剂、 软膏、 丸剂、 散剂、 注射剂、 输液剂、 冻干注射剂、 脂质体 注射剂、 靶向给药注射剂、 栓剂、 缓释制剂或控释制剂。
     附图说明
     图 1 为蓝萼甲素与苯甲酰氯的反应方程式。
     图 2a 为图 1 所示反应所得蓝萼甲素与苯甲酰氯的衍生物的 HPLC 图。
     图 2b 为图 1 所示反应所得蓝萼甲素与苯甲酰氯的衍生物的 LC-MS 图。
     图 3 为蓝萼甲素与苯磺酰氯的反应方程式。
     图 4a 为图 3 所示反应所得蓝萼甲素与苯磺酰氯的衍生物的 HPLC 图。
     图 4b 为图 3 所示反应所得蓝萼甲素与苯磺酰氯的衍生物的 LC-MS 图。具体实施方式
     根据本发明的权利要求和发明内容所公开的内容, 本发明的技术方案具体如以下 实施例所述。
     本发明所公开的制备方式是在三乙胺和 4- 二甲氨基吡啶 (DMAP) 存在的条件下, 将经提取处理后的蓝萼甲素与苯甲酰氯或苯磺酰氯反应, 从而制备得到本发明所公开的酰 氯化蓝萼甲素衍生物, 该制备过程主要包括蓝萼甲素的制备以及取代基的衍生化。以下实 施例所述制备过程, 所采用的各种化学试剂如无特别标注, 则为分析纯。
     实施例 1 : 蓝萼甲素的制备
     采用香茶菜药材 ( 地上部分 ) 作为原料, 通过提取、 溶剂处理、 树脂处理和重结晶 等步骤, 制备得到蓝萼甲素 (GLA), 其具体过程如下 :
     步骤 1 为提取步骤, 其进一步包括 :
     步骤 1.1 : 取香茶菜药材 ( 地上部分 ) 粉碎至 20 目~ 50 目 ;
     步骤 1.2 : 将所得的粉碎物与 95%乙醇 (A.R.) 按照体积比 1 ∶ 5 ~ 1 ∶ 15 混合, 加热, 在 80℃~ 90℃温度条件下回流 1 ~ 2 小时, 提取、 过滤, 得到提取液和剩余物 ;
     步骤 1.3 : 将步骤 1.2 所得的剩余物与 95 %乙醇 (A.R.) 按照体积比 1 ∶ 5 ~ 1 ∶ 15 混合, 加热, 在 80℃~ 90℃温度条件下回流 1 ~ 2 小时, 提取、 过滤, 得到提取液和剩 余物, 重复该步骤 1 ~ 3 次 ; 步骤 1.4 : 合并步骤 1.2 和 1.3 所得的提取液。
     步骤 2 为溶剂处理步骤, 其进一步包括 :
     步骤 2.1 : 将步骤 1 所得的提取液加热, 在 55℃~ 65℃温度条件下加热减压浓缩, 回收乙醇并得到粘稠的初级浓缩物 ;
     步骤 2.2 : 将步骤 2.1 所得的初级浓缩物与水按照体积比 1 ∶ 8 ~ 1 ∶ 10 混合, 在室温条件下以 60 ~ 120 转 / 分的速度搅拌 10 分钟, 随后静置 6 ~ 12 小时, 弃去上清液 得到下层固体 ;
     步骤 2.3 : 将步骤 2.2 所得的固体与乙酸乙酯 (A.R.) 按照体积比 1 ∶ 4 ~ 1 ∶ 6 混合, 在 25℃~ 35℃温度条件下以 60 ~ 120 转 / 分的速度搅拌溶解, 静置 1 ~ 3 小时, 过 滤得到滤液和不溶物 ;
     步骤 2.4 : 将步骤 2.3 所得的不溶物与乙酸乙酯 (A.R.) 按照体积比 1 ∶ 4 ~ 1 ∶ 6 混合, 在 25℃~ 35℃温度条件下以 60 ~ 120 转 / 分的速度搅拌溶解, 静置 1 ~ 3 小时, 过 滤得到滤液和不溶物, 重复该步骤 1 ~ 3 次 ;
     步骤 2.5 : 合并步骤 2.3 和 2.4 所得的滤液 ;
     步骤 2.6 : 将步骤 2.5 所得的滤液加热, 在 35℃~ 45℃温度条件下加热减压浓缩, 回收乙酸乙酯 (A.R.), 得到固体浓缩物。
     步骤 3 为树脂处理步骤, 其进一步包括 :
     步骤 3.1 : 将步骤 2 所得的固体浓缩物与 95%乙醇 (A.R.) 按照体积比 1 ∶ 4 ~ 1 ∶ 6 混合溶解, 得到溶液 ;
     步骤 3.2 : 将步骤 3.1 所得的溶液缓慢加到 7 号树脂柱中, 起观察树脂的颜色, 在 树脂柱有 2/3 变色时, 停止加样, 并采用 200ml ~ 400ml 的 95%乙醇 (A.R.) 冲洗该树脂柱, 收集所有流出液, 所述树脂柱的填充物为强碱性阴离子树脂并用氢氧化钠饱和至 pH 值中性 ;
     步骤 3.3 : 将步骤 3.2 所得流出液加热, 并在 55℃~ 65℃温度条件下加热减压回 流, 直至溶剂干, 得到固体残留物。
     步骤 4 为重结晶步骤, 其进一步包括 :
     步骤 4.1 : 将上述残留物与 30℃~ 40℃的极性溶剂按照体积比 1 ∶ 4 ~ 1 ∶ 6 混 合, 得到初级溶液, 加热, 在 30℃的~ 40℃温度条件下减压浓缩, 在 -23℃~ -13℃温度条件 下静置析晶, 过滤得到浅黄色针状结晶 ;
     所述极性溶剂为按照体积比 1 ∶ 1 ~ 1 ∶ 2 混合的氯仿 (A.R.) 和丙酮 (A.R.) 的 混合溶液 ;
     步骤 4.2 : 将步骤 4.1 所得的结晶与极性溶剂按照体积比 1 ∶ 4 ~ 1 ∶ 6 混合, 在 -23℃~ -13℃温度条件下反复重结晶 2 ~ 4 次, 每次 12 ~ 24 小时, 得到中间产物蓝萼 甲素 ;
     所述极性溶剂为按照体积比 1 ∶ 1 ~ 1 ∶ 4 混合的氯仿 (A.R.) 和丙酮 (A.R.) 的 混合溶液。
     通过上述步骤制备得到蓝萼甲素。
     实施例 2 : 衍生化 按照图 1 所示的反应方程式, 将实施例 1 所制备得到的蓝萼甲素, 采用苯甲酰氯进 行衍生化, 从而向蓝萼甲素中引入修饰取代基, 得到蓝萼甲素的苯甲酰氯衍生物, 所述衍生 化步骤 5 进一步包括 :
     步骤 5.1 : 将 90 ~ 110mg 步骤 4 所得蓝萼甲素溶于 3 ~ 7ml 二氯甲烷中, 并在 0℃~ 5℃的冰水浴条件下, 缓慢依次加入 41.5 ~ 51.5mg 苯甲酰氯、 40.6 ~ 50.6mg 三乙胺 和 3.1 ~ 4.1mgDMAP, 在室温条件下搅拌反应 12 小时 ;
     步骤 5.2 : 向步骤 5.1 的反应溶液中加入 5 ~ 15ml 水稀释, 随后采用 5 ~ 15ml 二 氯甲烷萃取 2 ~ 4 次, 合并有机相并采用饱和食盐水洗涤、 无水硫酸钠干燥 ;
     步骤 5.3 : 将步骤 5.2 中经洗涤干燥后的有机相加热至 35℃~ 40℃减压浓缩以蒸 去溶剂, 并在室温条件下干燥, 得到白色粉末状产物 ;
     步骤 5.4 : 采用高效制备薄层层析硅胶板分离步骤 5.3 所得白色粉末状产物, 采用 体积比为 10 ∶ 1 的氯仿 - 丙酮混合溶液作为展开剂, 待产物展开后, 采用紫外灯在 254nm 下检视, 刮下样品分布带, 分离得到产物, 将分离所得产物溶于 15 ~ 25ml 甲醇, 过滤并将所 得滤液加热至 35℃~ 40℃减压浓缩至干, 得到蓝萼甲素的苯甲酰氯衍生物的无色晶体。
     实施例 3 : 衍生化
     按照图 3 所示的反应方程式, 将实施例 1 所制备得到的蓝萼甲素, 采用苯磺酰氯进 行衍生化, 从而向蓝萼甲素中引入修饰取代基, 得到蓝萼甲素的苯磺酰氯衍生物, 所述衍生 化步骤 5 进一步包括 :
     步骤 5.1 : 将 90 ~ 110mg 步骤 4 所得蓝萼甲素溶于 3 ~ 7ml 二氯甲烷中, 并在 0℃~ 5℃的冰水浴条件下, 缓慢依次加入 106.8 ~ 126.8mg 苯磺酰氯、 86.3 ~ 96.3mg 三乙胺和 6.2 ~ 8.2mgDMAP, 在室温条件下搅拌反应 12 小时 ;
     步骤 5.2 : 向步骤 5.1 的反应溶液中加入 5 ~ 15ml 水稀释, 随后采用 5 ~ 15ml 二 氯甲烷萃取 2 ~ 4 次, 合并有机相并采用饱和食盐水洗涤、 无水硫酸钠干燥 ;
     步骤 5.3 : 将步骤 5.2 中经洗涤干燥后的有机相加热至 35℃~ 40℃减压浓缩以蒸
     去溶剂, 并在室温条件下干燥, 得到白色粉末状产物 ;
     步骤 5.4 : 采用高效制备薄层层析硅胶板分离步骤 5.3 所得白色粉末状产物, 采用 体积比为 10 ∶ 1 的氯仿 - 丙酮混合溶液作为展开剂, 待产物展开后, 采用紫外灯在 254nm 下检视, 刮下样品分布带, 分离得到产物, 将分离所得产物溶于 15 ~ 25ml 甲醇, 过滤并将所 得滤液加热至 35℃~ 40℃减压浓缩至干, 得到蓝萼甲素的苯磺酰氯衍生物的无色晶体。
     实施例 4 :
     采用以下技术参数改进实施例 1。
     步骤 1.1 中采用粉碎至 30 目的香茶菜药材 ( 地上部分 )。
     步骤 1.2 和步骤 1.3 的重结晶过程中, 按照体积比 1 ∶ 8 混合所得粉碎物与 95% 乙醇, 加热回流的温度为 83℃, 加热回流的时间为 1.7 小时。
     重复步骤 1.3 的重结晶过程 2 次。
     步骤 2.1 中, 加热减压浓缩的温度为 58℃。
     步骤 2.2 中, 按照体积比 1 ∶ 9 混合初级浓缩物与水, 搅拌后静置的时间为 8 小时。
     步骤 2.3 和 2.4 的重结晶过程中, 按照体积比 1 ∶ 4.5 混合步骤 2.2 所得的固体 与乙酸乙酯, 溶解的温度为 15℃, 静置的时间为 2.5 小时。
     重复步骤 2.4 的重结晶过程 2 次。
     步骤 2.6 中, 加热减压浓缩的温度为 38℃。
     步骤 3.1 中, 按照体积比 1 ∶ 4.5 将步骤 2 所得固体浓缩物溶解于 95%乙醇。
     步骤 3.2 中, 采用 250ml 的 95%乙醇冲洗树脂柱。
     步骤 3.3 中, 加热减压回流的温度为 58℃。
     步骤 4.1 中, 按照体积比 1 ∶ 4.5 混合残留物与 33℃的极性溶剂, 所述极性溶剂为 体积比 1 ∶ 1.5 的氯仿 - 丙酮混合溶液, 所述加热减压浓缩的温度为 33℃, 静置析晶的温度 为 -18℃。
     步骤 4.2 中, 按照体积比 1 ∶ 4.5 混合所得晶体与 33℃的极性溶剂, 所述极性溶剂 为体积比 1 ∶ 2 的氯仿 - 丙酮混合溶液, 所述加热减压浓缩的温度为 33℃, 静置析晶的温度 为 -18℃, 静置析晶的时间为 16 小时。
     重复步骤 4.2 的重结晶过程 2 次。
     通过上述步骤制备得到蓝萼甲素。
     实施例 5 :
     采用以下技术参数改进实施例 1。
     步骤 1.1 中采用粉碎至 40 目的香茶菜药材 ( 地上部分 )。
     步骤 1.2 和步骤 1.3 的重结晶过程中, 按照体积比 1 ∶ 12 混合所得粉碎物与 95% 乙醇, 加热回流的温度为 87℃, 加热回流的时间为 1.3 小时。
     重复步骤 1.3 的重结晶过程 2 次。
     步骤 2.1 中, 加热减压浓缩的温度为 62℃。
     步骤 2.2 中, 按照体积比 1 ∶ 9 混合初级浓缩物与水, 搅拌后静置的时间为 10 小 时。
     步骤 2.3 和 2.4 的重结晶过程中, 按照体积比 1 ∶ 5.5 混合步骤 2.2 所得的固体 与乙酸乙酯, 溶解的温度为 25℃, 静置的时间为 1.5 小时。重复步骤 2.4 的重结晶过程 2 次。
     步骤 2.6 中, 加热减压浓缩的温度为 42℃。
     步骤 3.1 中, 按照体积比 1 ∶ 5.5 将步骤 2 所得固体浓缩物溶解于 95%乙醇。
     步骤 3.2 中, 采用 350ml 的 95%乙醇冲洗树脂柱。
     步骤 3.3 中, 加热减压回流的温度为 62℃。
     步骤 4.1 中, 按照体积比 1 ∶ 5.5 混合残留物与 37℃的极性溶剂, 所述极性溶剂为 体积比 1 ∶ 1.5 的氯仿 - 丙酮混合溶液, 所述加热减压浓缩的温度为 37℃, 静置析晶的温度 为 -18℃。
     步骤 4.2 中, 按照体积比 1 ∶ 5.5 混合所得晶体与 37℃的极性溶剂, 所述极性溶剂 为体积比 1 ∶ 3 的氯仿 - 丙酮混合溶液, 所述加热减压浓缩的温度为 37℃, 静置析晶的温度 为 -18℃, 静置析晶的时间为 20 小时。
     重复步骤 4.2 的重结晶过程 2 次。
     通过上述步骤制备得到蓝萼甲素。
     实施例 6 :
     采用以下技术参数改进实施例 2。
     步骤 5.1 中, 各物质用量为, 蓝萼甲素 91mg、 二氯甲烷 3.5ml、 苯甲酰氯 42.5mg、 41.6mg 三乙胺、 DMAP3.2mg。
     步骤 5.2 中, 采用 6ml 水稀释, 采用 6ml 二氯甲烷萃取 4 次。
     步骤 5.3 中, 减压浓缩的温度为 36℃, 室温干燥可采用干燥器进行干燥。
     步骤 5.4 中, 采用 16ml 甲醇溶解分离所得产物, 减压浓缩的温度为 36℃。
     实施例 7 :
     采用以下技术参数改进实施例 2。
     步骤 5.1 中, 各物质用量为, 蓝萼甲素 93mg、 二氯甲烷 4.5ml、 苯甲酰氯 44.5mg、 43.6mg 三乙胺、 DMAP3.4mg。
     步骤 5.2 中, 采用 8ml 水稀释, 采用 8ml 二氯甲烷萃取 3 次。
     步骤 5.3 中, 减压浓缩的温度为 37℃, 室温干燥可采用干燥器进行干燥。
     步骤 5.4 中, 采用 18ml 甲醇溶解分离所得产物, 减压浓缩的温度为 37℃。
     实施例 8 :
     采用以下技术参数改进实施例 2。
     步骤 5.1 中, 各物质用量为, 蓝萼甲素 95mg、 二氯甲烷 5ml、 苯甲酰氯 46.5mg、 45.6mg 三乙胺、 DMAP3.6mg。
     步骤 5.2 中, 采用 10ml 水稀释, 采用 10ml 二氯甲烷萃取 3 次。
     步骤 5.3 中, 减压浓缩的温度为 37.5℃, 室温干燥可采用干燥器进行干燥。
     步骤 5.4 中, 采用 20ml 甲醇溶解分离所得产物, 减压浓缩的温度为 37.5℃。
     实施例 9 :
     采用以下技术参数改进实施例 2。
     步骤 5.1 中, 各物质用量为, 蓝萼甲素 97mg、 二氯甲烷 5.5ml、 苯甲酰氯 48.5mg、 47.6mg 三乙胺、 DMAP3.8mg。
     步骤 5.2 中, 采用 12ml 水稀释, 采用 12ml 二氯甲烷萃取 3 次。步骤 5.3 中, 减压浓缩的温度为 38℃, 室温干燥可采用干燥器进行干燥。
     步骤 5.4 中, 采用 22ml 甲醇溶解分离所得产物, 减压浓缩的温度为 38℃。
     实施例 10 :
     采用以下技术参数改进实施例 2。
     步骤 5.1 中, 各物质用量为, 蓝萼甲素 99mg、 二氯甲烷 6.5ml、 苯甲酰氯 40.5mg、 49.6mg 三乙胺、 DMAP4.0mg。
     步骤 5.2 中, 采用 14ml 水稀释, 采用 14ml 二氯甲烷萃取 2 次。
     步骤 5.3 中, 减压浓缩的温度为 39℃, 室温干燥可采用干燥器进行干燥。
     步骤 5.4 中, 采用 24ml 甲醇溶解分离所得产物, 减压浓缩的温度为 39℃。
     实施例 11 :
     采用以下技术参数改进实施例 3。
     步骤 5.1 中, 各物质用量为, 蓝萼甲素 91mg、 二氯甲烷 3.5ml、 苯磺酰氯 110.8mg、 三 乙胺 87.3mg、 DMAP6.6mg。
     步骤 5.2 中, 采用 6ml 水稀释, 采用 6ml 二氯甲烷萃取 4 次。
     步骤 5.3 中, 减压浓缩的温度为 36℃, 室温干燥可采用干燥器进行干燥。
     步骤 5.4 中, 采用 16ml 甲醇溶解分离所得产物, 减压浓缩的温度为 36℃。
     实施例 12 :
     采用以下技术参数改进实施例 3。
     步骤 5.1 中, 各物质用量为, 蓝萼甲素 93mg、 二氯甲烷 4.5ml、 苯磺酰氯 113.8mg、 三 乙胺 89.3mg、 DMAP6.9mg。
     步骤 5.2 中, 采用 8ml 水稀释, 采用 8ml 二氯甲烷萃取 3 次。
     步骤 5.3 中, 减压浓缩的温度为 37℃, 室温干燥可采用干燥器进行干燥。
     步骤 5.4 中, 采用 18ml 甲醇溶解分离所得产物, 减压浓缩的温度为 37℃。
     实施例 13 :
     采用以下技术参数改进实施例 3。
     步骤 5.1 中, 各物质用量为, 蓝萼甲素 95mg、 二氯甲烷 5ml、 苯磺酰氯 116.8mg、 三乙 胺 91.3mg、 DMAP7.2mg。
     步骤 5.2 中, 采用 10ml 水稀释, 采用 10ml 二氯甲烷萃取 3 次。
     步骤 5.3 中, 减压浓缩的温度为 37.5℃, 室温干燥可采用干燥器进行干燥。
     步骤 5.4 中, 采用 20ml 甲醇溶解分离所得产物, 减压浓缩的温度为 37.5℃。
     实施例 14 :
     采用以下技术参数改进实施例 3。
     步骤 5.1 中, 各物质用量为, 蓝萼甲素 97mg、 二氯甲烷 5.5ml、 苯磺酰氯 119.8mg、 三 乙胺 93.3mg、 DMAP7.5mg。
     步骤 5.2 中, 采用 12ml 水稀释, 采用 12ml 二氯甲烷萃取 3 次。
     步骤 5.3 中, 减压浓缩的温度为 38℃, 室温干燥可采用干燥器进行干燥。
     步骤 5.4 中, 采用 22ml 甲醇溶解分离所得产物, 减压浓缩的温度为 38℃。
     实施例 15 :
     采用以下技术参数改进实施例 3。步骤 5.1 中, 各物质用量为, 蓝萼甲素 99mg、 二氯甲烷 6.5ml、 苯磺酰氯 122.8mg、 三 乙胺 95.3mg、 DMAP7.8mg。
     步骤 5.2 中, 采用 14ml 水稀释, 采用 14ml 二氯甲烷萃取 2 次。
     步骤 5.3 中, 减压浓缩的温度为 39℃, 室温干燥可采用干燥器进行干燥。
     步骤 5.4 中, 采用 24ml 甲醇溶解分离所得产物, 减压浓缩的温度为 39℃。
     实施例 16 :
     根据实施例 4 ~ 5 制备得到蓝萼甲素, 并将所得蓝萼甲素按照实施例 6 ~ 10 进行 衍生化, 特别是根据实施例 4 和实施例 8, 制备得到蓝萼甲素与苯甲酰氯的衍生物。
     采用高效液相色谱 (HPLC) 和液相色谱 - 质谱联用 (LC-MS) 检测上述蓝萼甲素与 苯甲酰氯的衍生物结构, 所得 HPLC 谱图和 LC-MS 谱图分别如图 2a 和图 2b 所示。经 HPLC 和 LC-MS 检测表明, 上述蓝萼甲素与苯甲酰氯的衍生物结构如下。
     实施例 17 :
     根据实施例 4 ~ 5 制备得到蓝萼甲素, 并将所得蓝萼甲素按照实施例 11 ~ 15 进 行衍生化, 特别是根据实施例 4 和实施例 13, 制备得到蓝萼甲素与苯磺酰氯的衍生物。
     采用高效液相色谱 (HPLC) 和液相色谱 - 质谱联用 (LC-MS) 检测上述蓝萼甲素与 苯磺酰氯的衍生物结构, 所得 HPLC 谱图和 LC-MS 谱图分别如图 4a 和图 4b 所示。经 HPLC 和 LC-MS 检测表明, 上述蓝萼甲素与苯磺酰氯的衍生物结构如下。
     实施例 18 : 酰氯化蓝萼甲素衍生物制剂的制备
     按照上述实施例制备得到具有实施例 16 的分子式结构的蓝萼甲素的苯甲酰氯衍 生物, 或按照上述实施例制备具有实施例 17 的分子式结构的蓝萼甲素的苯磺酰氯衍生物。
     将所得酰氯化的蓝萼甲素, 采用药剂学上的常规药物载体, 并采用药剂学上的常 规制备方法, 制备成药剂学上的常规剂型, 包括但不限于片剂、 胶囊剂、 软胶剂、 喷雾剂、 凝 胶剂、 凝胶吸入剂、 口服剂、 混悬剂、 冲剂、 贴剂、 软膏、 丸剂、 散剂、 注射剂、 输液剂、 冻干注射 剂、 脂质体注射剂、 靶向给药注射剂、 栓剂、 缓释制剂或控释制剂。
     实施例 19 : 酰氯化蓝萼甲素衍生物针对胃癌 AGS 细胞生长抑制作用的药效学实验
     1、 样品配制 :
     取按照上述实施例制备得到的蓝萼甲素的苯甲酰氯衍生物、 蓝萼甲素的苯磺酰氯 衍生物, 分别加入相应体积的二甲基亚砜 (DMSO) 溶解, 得到浓度为约 50mg/ml 的药物溶液, 随后震荡溶解, 所得药物溶液可在 -20℃条件下储存
     2、 细胞株 :
     胃癌 AGS 细胞
     3、 实验方法 :
     将胃癌 AGS 细胞培养于含 10%胎牛血清 (FBS) 的 F-12 培养基中。取对数生长期 的胃癌 AGS 细胞, 按常规消化后进行细胞计数。细胞计数后调整细胞浓度为 1×104 并接种 于 96 孔细胞培养板上, 置于培养箱中培养 24 小时后加药。24 小时后对照组换培养液, 实 验组加入不同浓度的受试物, 于 48 小时后应用 MTT 法 (MTT 比色法、 噻唑蓝法 ) 比色检测细 胞活力。每孔中加入浓度为 5mg/ml 的 MTT( 噻唑蓝 )20μl, 培养 4 小时后吸去培养液, 加 DMSO150μl, 摇床振荡使蓝紫色沉淀颗粒完全溶解, 在酶标仪上 490nm 处测吸光度 (A) 值。
     4、 实验结果 :
     酰氯化蓝萼甲素衍生物对人胃癌 AGS 细胞增殖的影响如下表所示
     组别 空白对照 GLA浓度 1μmol/ml 0.1μmol/ml 0.01μmol/mlA 值 (490nm) 0.4420+0.0355 0.0310+0.0208 **△△ 0.0380+0.0193 **△△ 0.0837+0.0190 **△△ 0.0853+0.0208 **△△ 0.0920+0.0347 **△△ 0.197+0.0041 **△△ 0.099+0.0209 **△△ 0.102+0.0932 **△△ 0.206+0.0112 **△△ 0.3723+0.0492抑制率 (% )92.99 91.40 81.07 82.14 80.93 73.25 79.12 77.14 72.48 15.76GLA-PHOCL1μmol/ml 0.1μmol/ml 0.01μmol/mlGLA-PHSO1μmol/ml 0.1μmol/ml 0.01μmol/mlDMSO 对照1μl/ml17101993373 A CN 101993376说0.1μl/ml 0.01l/ml明书0.08 7.9213/14 页0.4417+0.0318 0.4070+0.0288
     * 注: 表示与空白对照组比较, P < 0.05 ; **
     表示与空白对照组比较, P < 0.01 ;
     △表示与相同浓度的 DMSO 对照组比较, P < 0.05 ;
     △△表示与相同浓度的 DMSO 对照组比较, P < 0.01 ;
     GLA-PHOCL 表示蓝萼甲素的苯甲酰氯衍生物 ;
     GLA-PHSO 表示蓝萼甲素的苯磺酰氯衍生物。
     结果表明, 酰氯化蓝萼甲素 ( 蓝萼甲素的苯甲酰氯衍生物、 蓝萼甲素的苯磺酰氯 衍生物 ) 能明显抑制人胃癌 AGS 胃癌细胞的增殖, 此作用与助溶剂 DMSO 无关。
     实施例 20 : 酰氯化蓝萼甲素衍生物针对 SMMC-7721 人肝癌细胞、 MCF-7 乳腺癌肿瘤 细胞、 Eca-109 人食管癌肿瘤细胞、 A-549 肺癌肿瘤细胞、 宫颈癌 HeLa 肿瘤细胞、 人结肠癌 SW480 肿瘤细胞的生长抑制作用的药效学实验
     1、 药物与试剂 :
     受试样品, F-12 培养基, 10 %灭活胎牛血清 (FBS), 二甲基亚砜, 噻唑盐, 阿霉素 ( 阳性药 )
     2、 仪器 :
     培养箱, 超静工作台, 多功能倒置显微镜, 离心机, 自动酶标仪, 96 孔培养板
     3、 细胞株 :
     SMMC-7721 人肝癌细胞、 MCF-7 乳腺癌肿瘤细胞、 Eca-109 人食管癌肿瘤细胞、 A-549 肺癌肿瘤细胞、 宫颈癌 HeLa 肿瘤细胞、 人结肠癌 SW480 肿瘤细胞
     4、 样品配制 :
     取按照上述实施例制备得到的蓝萼甲素的苯甲酰氯衍生物、 蓝萼甲素的苯磺酰氯 衍生物, 分别加入相应体积的二甲基亚砜 (DMSO) 溶解, 得到浓度为约 50mg/ml 的药物溶液, 随后震荡溶解, 所得药物溶液可在 -20℃条件下储存
     5、 实验方法 :
     将上述肿瘤细胞培养于含 10% FBS 的 F-12 培养基中。取对数生长期的上述肿瘤 细胞, 按常规消化后进行细胞计数。细胞计数后调整细胞浓度为 1×104 并接种于 96 孔细 胞培养板上, 置于培养箱中培养 24 小时后加药。24 小时后对照组换培养液, 实验组加入不 同浓度的受试物, 于 48 小时后应用 MTT 法 (MTT 比色法、 噻唑蓝法 ) 比色检测细胞活力。每 孔中加入浓度为 5mg/ml 的 MTT( 噻唑蓝 )20μl, 培养 4 小时后吸去培养液, 加 DMSO150μl, 摇床振荡使蓝紫色沉淀颗粒完全溶解, 在酶标仪上 490nm 处测吸光度 (A) 值。
     6、 实验结果 :
     酰 氯 化 蓝 萼 甲 素 衍 生 物 对 SMMC-7721 人 肝 癌 细 胞、 MCF-7 乳 腺 癌 肿 瘤 细 胞、 Eca-109 人食管癌肿瘤细胞、 A-549 肺癌肿瘤细胞、 宫颈癌 HeLa 肿瘤细胞、 人结肠癌 SW480 肿瘤细胞增殖的影响如下表所示
     注: GLA-PHOCL 表示蓝萼甲素的苯甲酰氯衍生物 ;
     GLA-PHSO 表示蓝萼甲素的苯磺酰氯衍生物。
     结果表明, 酰氯化蓝萼甲素 ( 蓝萼甲素的苯甲酰氯衍生物、 蓝萼甲素的苯磺酰氯 衍生物 ) 能明显抑制 SMMC-7721 人肝癌细胞、 MCF-7 乳腺癌肿瘤细胞、 Eca-109 人食管癌肿 瘤细胞、 A-549 肺癌肿瘤细胞、 宫颈癌 HeLa 肿瘤细胞、 人结肠癌 SW480 肿瘤细胞的生长, 此 作用与助溶剂 DMSO 无关。
     实施例 21 : 酰氯化蓝萼甲素衍生物制剂的应用
     根据实施例 19 ~ 20, 按照上述实施例制备得到具有实施例 16 的分子式结构的蓝 萼甲素的苯甲酰氯衍生物, 或按照上述实施例制备具有实施例 17 的分子式结构的蓝萼甲 素的苯磺酰氯衍生物, 用于癌症的治疗, 特别是在治疗胃癌、 肝癌、 乳腺癌、 食管癌、 肺癌、 宫 颈癌、 人结肠癌中的应用。
     上述内容为本发明的具体实施例的例举, 对于其中未详尽描述的试剂、 设备、 操作 方法等, 应当理解为采取本领域已有的普通及常规试剂、 设备、 操作方法等来予以实施。
     同时本发明上述实施例仅为说明本发明技术方案之用, 仅为本发明技术方案的列 举, 并不用于限制本发明的技术方案及其保护范围。 采用等同技术手段、 等同试剂等对本发 明权利要求书及说明书所公开的技术方案的改进应当认为是没有超出本发明权利要求书 及说明书所公开的范围。
    

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1、10申请公布号CN101993373A43申请公布日20110330CN101993373ACN101993373A21申请号200910056459222申请日20090814C07C69/78200601C07C309/73200601C07C67/14200601C07C303/28200601A61K31/235200601A61K31/255200601A61P35/0020060171申请人上海金昊药业开发有限公司地址201203上海市浦东新区张江哈雷路1043号8号楼303室72发明人李云森陈子珺程萍雷启福74专利代理机构上海新天专利代理有限公司31213代理人王敏杰54发明名称。

2、酰氯化蓝萼甲素衍生物及其制备方法和应用57摘要本发明公开了一种酰氯化蓝萼甲素衍生物的结构、制备方法及其在治疗癌症中的应用。所述酰氯化蓝萼甲素衍生物的分子结构的通式如下其中,R1为苯甲酰氯取代基C7H6O2、苯磺酰氯取代基C6H6O3S2或OH,R2为苯甲酰氯取代基C7H6O2、苯磺酰氯取代基C6H6O3S2或OH。本发明所公开的制备方式是在三乙胺和4二甲氨基吡啶存在的条件下,将经提取处理后的蓝萼甲素与苯甲酰氯或苯磺酰氯反应,从而制备得到本发明所公开的酰氯化蓝萼甲素衍生物。51INTCL19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书4页说明书14页附图4页CN101993376A1/。

3、4页21一种酰氯化蓝萼甲素衍生物,其特征在于,是一种贝壳杉烷型四环二萜类物质,具有贝壳杉烷型结构、羰基、羟基和酰氯结构,其分子结构的通式如下其中,R1为苯甲酰氯取代基C7H6O2、苯磺酰氯取代基C6H6O3S2或OH,R2为苯甲酰氯取代基C7H6O2、苯磺酰氯取代基C6H6O3S2或OH,R1和R2中至少有一个为OH。2如权利要求1所述的酰氯化蓝萼甲素衍生物,其特征在于,所述R1为C7H6O2,所述R2为OH,其分子结构如下3如权利要求1所述的酰氯化蓝萼甲素衍生物,其特征在于,所述R1为OH,所述R2为C7H6O2,其分子结构如下4如权利要求1所述的酰氯化蓝萼甲素衍生物,其特征在于,所述R1为。

4、C6H6O3S2,所述R2为OH,其分子结构如下权利要求书CN101993373ACN101993376A2/4页35如权利要求1所述的酰氯化蓝萼甲素衍生物,其特征在于,所述R1为OH,所述R2为C6H6O3S2,其分子结构如下6一种如权利要求1所述的酰氯化蓝萼甲素衍生物的制备方法,其特征在于,包含以下步骤步骤1提取步骤11取香茶菜药材地上部分粉碎至20目50目;步骤12将所得的粉碎物与95乙醇按照体积比15115混合,加热,在8090温度条件下回流12小时,提取、过滤,得到提取液和剩余物;步骤13将步骤12所得的剩余物与95乙醇按照体积比15115混合,加热,在8090温度条件下回流12小时。

5、,提取、过滤,得到提取液和剩余物,重复该步骤13次;步骤14合并步骤12和13所得的提取液;步骤2溶剂处理步骤21将步骤1所得的提取液加热,在5565温度条件下加热减压浓缩,回收乙醇并得到粘稠的初级浓缩物;步骤22将步骤21所得的初级浓缩物与水按照体积比18110混合,在室温条件下以60120转/分的速度搅拌10分钟,随后静置612小时,弃去上清液得到下层固体;步骤23将步骤22所得的固体与乙酸乙酯按照体积比1416混合,在2535温度条件下以60120转/分的速度搅拌溶解,静置13小时,过滤得到滤液和不溶物;步骤24将步骤23所得的不溶物与乙酸乙酯按照体积比1416混合,在2535温度条件下。

6、以60120转/分的速度搅拌溶解,静置13小时,过滤得到滤液和不溶物,重复该步骤13次;权利要求书CN101993373ACN101993376A3/4页4步骤25合并步骤23和24所得的滤液;步骤26将步骤25所得的滤液加热,在3545温度条件下加热减压浓缩,回收乙酸乙酯,得到固体浓缩物;步骤3树脂处理步骤31将步骤2所得的固体浓缩物与95乙醇按照体积比1416混合溶解,得到溶液;步骤32将步骤31所得的溶液缓慢加到7号树脂柱中,起观察树脂的颜色,在树脂柱有2/3变色时,停止加样,并采用200ML400ML的95乙醇冲洗该树脂柱,收集所有流出液,所述树脂柱的填充物为强碱性阴离子树脂并用氢氧化。

7、钠饱和至PH值中性;步骤33将步骤32所得流出液加热,并在5565温度条件下加热减压回流,直至溶剂干,得到固体残留物;步骤4重结晶步骤41将上述残留物与3040的极性溶剂按照体积比1416混合,得到初级溶液,加热,在30的40温度条件下减压浓缩,在2313温度条件下静置析晶,过滤得到浅黄色针状结晶;所述极性溶剂为按照体积比1112混合的氯仿和丙酮的混合溶液;步骤42将步骤41所得的结晶与极性溶剂按照体积比1416混合,在2313温度条件下反复重结晶24次,每次1224小时,得到中间产物蓝萼甲素;所述极性溶剂为按照体积比1114混合的氯仿和丙酮的混合溶液;步骤5衍生化将所得中间产物溶于二氯甲烷溶。

8、液,在冰水浴条件下,加入苯甲酰氯或苯磺酰氯溶液、三乙胺和4二甲氨基吡啶DMAP,室温搅拌,采用二氯甲烷萃取,合并有机相,蒸去溶剂并干燥,得到酰氯化蓝萼甲素衍生物。7如权利要求6所述的酰氯化蓝萼甲素衍生物的制备方法,其特征在于,所述步骤5进一步包含以下步骤步骤51将90110MG步骤4所得蓝萼甲素溶于37ML二氯甲烷中,并在05的冰水浴条件下,缓慢依次加入415515MG苯甲酰氯、406506MG三乙胺和3141MGDMAP,在室温条件下搅拌反应12小时;步骤52向步骤51的反应溶液中加入515ML水稀释,随后采用515ML二氯甲烷萃取24次,合并有机相并采用饱和食盐水洗涤、无水硫酸钠干燥;步骤。

9、53将步骤52中经洗涤干燥后的有机相加热至3540减压浓缩以蒸去溶剂,并在室温条件下干燥,得到白色粉末状产物;步骤54采用高效制备薄层层析硅胶板分离步骤53所得白色粉末状产物,将分离所得产物溶于1525ML甲醇,过滤并将所得滤液加热至3540减压浓缩至干,得到蓝萼甲素的苯甲酰氯衍生物的无色晶体。8如权利要求6所述的酰氯化蓝萼甲素衍生物的制备方法,其特征在于,所述步骤5进一步包含以下步骤步骤51将90110MG步骤4所得蓝萼甲素溶于37ML二氯甲烷中,并在0权利要求书CN101993373ACN101993376A4/4页55的冰水浴条件下,缓慢依次加入10681268MG苯磺酰氯、863963。

10、MG三乙胺和6282MGDMAP,在室温条件下搅拌反应12小时;步骤52向步骤51的反应溶液中加入515ML水稀释,随后采用515ML二氯甲烷萃取24次,合并有机相并采用饱和食盐水洗涤、无水硫酸钠干燥;步骤53将步骤52中经洗涤干燥后的有机相加热至3540减压浓缩以蒸去溶剂,并在室温条件下干燥,得到白色粉末状产物;步骤54采用高效制备薄层层析硅胶板分离步骤53所得白色粉末状产物,将分离所得产物溶于1525ML甲醇,过滤并将所得滤液加热至3540减压浓缩至干,得到蓝萼甲素的苯磺酰氯衍生物的无色晶体。9如权利要求15所述的酰氯化蓝萼甲素衍生物在治疗癌症中的应用。10如权利要求15所述的酰氯化蓝萼甲。

11、素衍生物在治疗胃癌、肝癌、乳腺癌、食管癌、肺癌、宫颈癌、人结肠癌中的应用。权利要求书CN101993373ACN101993376A1/14页6酰氯化蓝萼甲素衍生物及其制备方法和应用技术领域0001本发明涉及蓝萼甲素GLA衍生物,特别涉及酰氯化蓝萼甲素衍生物。本发明还涉及所述酰氯化蓝萼甲素衍生物的制备方法及其在治疗癌症中的应用。背景技术0002唇形科香茶菜属植物。在亚洲东部和非洲西部广为分布,全世界约有150种,我国约有90种25个变种。其中约有30种民间作为药用,作为清热解毒、抗癌消炎、健脾、活血、杭菌药来使用。人们对该属植物的菇类成分作了研究,已从中提取了百余种药类成分。经药理筛选发现许多。

12、二萜化合物具有细胞毒、抗肿瘤、杭炎活性作用。0003蓝萼香茶菜是唇形科香茶菜属植物,分布在我国的东北、华北,朝鲜日本,原苏联远东地区,吉林省资源尤其丰富。蓝萼香茶菜具有健胃、清热解毒、活血、抗菌消炎和抗癌活性,用于胃炎、肝炎初起、感冒发热、乳腺炎、关节痛等疾病。现代研究发现全草对心血管有一定的作用,而其中的有效成分对血小板聚集及癌症有一定的影响。00041981年许云龙等人从蓝萼香茶菜中提取出蓝萼甲素GLAUCOCALYXINA和蓝萼乙素GLAUCOCALYXINB,从光谱中推断蓝萼甲素具有香茶菜属二萜典型的巧一氧16一贝壳杉烯ENT15OXOL6KAURENE骨架,而蓝萼乙素是蓝萼甲素的14。

13、一乙酰化物,把两者分别乙酰化,得到相同的乙酰化物,从而证实了两者的相互关系。随后赵全成也从吉林产蓝萼香茶菜中分得这两种二萜。00051988年刘晨江等从北京地区产蓝萼香茶菜中分得甲素和乙素外,还分得蓝萼丙素GLAUCOCALYXINC,结构为对映7P,14A,15A三羟基16贝壳杉3酮。DONGSAKIMLS,除了从中分出蓝萼甲素、蓝萼乙素和蓝萼丙素,还分出了两种新二萜GLAUCOCALYXIND和GLAUCOCALYXINE并列出了这五种化合物的结构红外紫外吸收值、最主要的1H一核磁共振、13C一核磁共振化学位移值及质谱数据值。0006金永日等从蓝萼香茶菜根中分得了蓝萼甲素,另外王先荣等从安。

14、徽产王枣子LSODONAMETHYSTOIDESBENTHCYWUETHSUAN中也分得蓝萼甲素。王慧芬等人用反相高效液相色谱法外标法对不同部位及不同采集期的蓝萼香茶菜中蓝萼甲素的含量进行了测定,结果表明叶中蓝萼甲素远高于根、茎。不同采集期以78月份含量高,9月末含量下降。张元桐等也采用反相HPLC测定蓝萼甲素含量,测得蓝萼甲素含量为103,平均回收率为992。0007从蓝萼甲素体内外实验结果来看,其具有较强的抗肿瘤作用,且抗瘤谱较广,能抑制LEWIS肺癌、5180实体型以及HCA实体型等实体瘤的生长,明显增加荷腹水型5180腹水型和荷HCA腹水型小鼠的生命延长率,其抗肿瘤作用的强弱呈剂量依赖。

15、性。0008科研人员用MTT法对从毛叶香茶菜叶中分离鉴定的14个已知对映贝壳杉烯类二萜化合物进行了人早幼粒白血病细胞、人卵巢癌细胞和人肺癌细胞的抗癌活性研究,其中具有亚甲基环戊酮结构的化合物对上述3种肿瘤细胞株均表现出不同程度的抑制活性。从蓝萼香茶菜叶分离的化合物如蓝尊香茶菜甲素GLA和乙素GLB结构中具有说明书CN101993373ACN101993376A2/14页7亚甲基环戊酮,因而显示出较强的生物活性。0009对若干天然及化学修饰后的贝克杉烯类化合物进行了系统的体外抗肿瘤活性筛选及构效关系研究表明,应用化学手段破坏分子中亚甲基环戊酮结构单元,会显著降低贝克杉烯类化合物的抗肿瘤活性。00。

16、10由于蓝萼甲素为对映贝壳杉烯类二萜化合物,其化合物极性小,易溶于氯仿等非极性溶剂,在水中不溶,因此不适合直接作为药物进行给药;蓝萼甲素体外具有明显的抗癌作用,但在体内需大剂量长时间用药才能产生药效。药物在体内消除很快,半衰期短,尚不能直接作为药物使用。发明内容0011鉴于蓝萼甲素GLA特别是其亚甲基环戊酮结构对肿瘤细胞株活性具有良好的抑制作用,然而由于其极性小、半衰期短等特点,其不适于直接作为药物进行给药,故现在需要以蓝萼甲素GLA为先导化合物,通过对先导化合物的结构改造,来获得蓝萼甲素的衍生物,从而使其按照已知的代谢途径失活或不代谢,而由原形排出体外,从而提高药物的安全性,增加药效。001。

17、2本发明的目的之一在于提供具有对肿瘤细胞株良好的抑制作用的、结构改良的酰氯化蓝萼甲素GLA衍生物,从而解决GLA极性小、不易溶于水、半衰期短、在体内消除过快等缺陷,从而作为治疗癌症的药物使用。0013本发明的目的之二在于提供所述酰氯化蓝萼甲素衍生物的制备方法,避免单纯的采用有机合成所带来的毒副作用较大的缺陷,并且避免单纯的采用原料提纯多带来的药效较低、无法针对性治疗某一特定癌症的缺陷。0014本发明所公开的酰氯化蓝萼甲素衍生物是一种贝壳杉烷型四环二萜类物质,具有贝壳杉烷型结构、羰基、羟基和酰氯结构,其分子结构的通式如下00150016其中,R1为苯甲酰氯取代基C7H6O2、苯磺酰氯取代基C6H。

18、6O3S2或OH,R2为苯甲酰氯取代基C7H6O2、苯磺酰氯取代基C6H6O3S2或OH。0017故,在较佳的优选实施例中,所述R1和R2中至少有一个为OH。0018在一个优选实施例中,所述R1为C7H6O2,所述R2为OH,所述衍生物分子结构如下0019说明书CN101993373ACN101993376A3/14页80020在一个优选实施例中,所述R1为OH,所述R2为C7H6O2,所述衍生物分子结构如下。00210022在一个优选实施例中,所述R1为C6H6O3S2,所述R2为OH,所述衍生物分子结构如下00230024在一个优选实施例中,所述R1为OH,所述R2为C6H6O3S2,所述。

19、衍生物分子结构如下0025说明书CN101993373ACN101993376A4/14页90026上述酰氯化GLA衍生物由于具有GLA的亚甲基环戊酮结构,故其对肿瘤细胞株活性具有良好的抑制作用,另一方面,上述多肽类GLA进行了结构修饰,解决了极性小、半衰期短等缺陷特点,适于作为治疗癌症的药物使用。0027上述酰氯化蓝萼甲素衍生物是按照以下方法进行制备的,其包含用于制备作为先导化合物的蓝萼甲素的步骤14以及用于结构修饰蓝萼甲素进行衍生化的步骤5。0028所述步骤1为提取步骤,具体包括以下步骤0029步骤11取香茶菜药材地上部分粉碎至20目50目;0030步骤12将所得的粉碎物与95乙醇AR按照。

20、体积比15115混合,加热,在8090温度条件下回流12小时,提取、过滤,得到提取液和剩余物;0031步骤13将步骤12所得的剩余物与95乙醇AR按照体积比15115混合,加热,在8090温度条件下回流12小时,提取、过滤,得到提取液和剩余物,重复该步骤13次;0032步骤14合并步骤12和13所得的提取液。0033所述步骤2为溶剂处理步骤,具体包括以下步骤0034步骤21将步骤1所得的提取液加热,在5565温度条件下加热减压浓缩,回收乙醇并得到粘稠的初级浓缩物;0035步骤22将步骤21所得的初级浓缩物与水按照体积比18110混合,在室温条件下以60120转/分的速度搅拌10分钟,随后静置6。

21、12小时,弃去上清液得到下层固体;0036步骤23将步骤22所得的固体与乙酸乙酯AR按照体积比1416混合,在2535温度条件下以60120转/分的速度搅拌溶解,静置13小时,过滤得到滤液和不溶物;0037步骤24将步骤23所得的不溶物与乙酸乙酯AR按照体积比1416混合,在2535温度条件下以60120转/分的速度搅拌溶解,静置13小时,过滤得到滤液和不溶物,重复该步骤13次;0038步骤25合并步骤23和24所得的滤液;0039步骤26将步骤25所得的滤液加热,在3545温度条件下加热减压浓缩,回收乙酸乙酯AR,得到固体浓缩物。0040所述步骤3为树脂处理步骤,具体包括以下步骤0041步骤。

22、31将步骤2所得的固体浓缩物与95乙醇AR按照体积比1416混合溶解,得到溶液;0042步骤32将步骤31所得的溶液缓慢加到7号树脂柱中,起观察树脂的颜色,在树脂柱有2/3变色时,停止加样,并采用200ML400ML的95乙醇AR冲洗该树脂柱,收集所有流出液,所述树脂柱的填充物为强碱性阴离子树脂并用氢氧化钠饱和至PH值中性;0043步骤33将步骤32所得流出液加热,并在5565温度条件下加热减压回流,直至溶剂干,得到固体残留物。0044所述步骤4为重结晶步骤,具体包括以下步骤0045步骤41将上述残留物与3040的极性溶剂按照体积比1416混说明书CN101993373ACN101993376。

23、A5/14页10合,得到初级溶液,加热,在30的40温度条件下减压浓缩,在2313温度条件下静置析晶,过滤得到浅黄色针状结晶;0046所述极性溶剂为按照体积比1112混合的氯仿AR和丙酮AR的混合溶液;0047步骤42将步骤41所得的结晶与极性溶剂按照体积比1416混合,在2313温度条件下反复重结晶24次,每次1224小时,得到中间产物蓝萼甲素;0048所述极性溶剂为按照体积比1114混合的氯仿AR和丙酮AR的混合溶液。0049所述步骤5为衍生化步骤,具体包括以下步骤0050步骤51将90110MG步骤4所得蓝萼甲素溶于37ML二氯甲烷中,并在05的冰水浴条件下,缓慢依次加入苯甲酰氯或苯磺酰。

24、氯、406506MG三乙胺和3141MGDMAP,并在室温条件下搅拌反应12小时;0051步骤52向步骤51的反应溶液中加入515ML水稀释,随后采用515ML二氯甲烷萃取24次,合并有机相并采用饱和食盐水洗涤、无水硫酸钠干燥;0052步骤53将步骤52中经洗涤干燥后的有机相加热至3540减压浓缩以蒸去溶剂,并在室温条件下干燥,得到白色粉末状产物;0053步骤54采用高效制备薄层层析硅胶板分离步骤53所得白色粉末状产物,将分离所得产物溶于1525ML甲醇,过滤并将所得滤液加热至3540减压浓缩至干,得到蓝萼甲素的苯甲酰氯衍生物的无色晶体。0054经上述制备过程所得的酰氯化蓝萼甲素衍生物,由于具。

25、有亚甲基环戊酮结构,故其对肿瘤细胞株具有良好的抑制作用,可用于治疗癌症,特别用于治疗胃癌、肝癌、乳腺癌、食管癌、肺癌、宫颈癌、人结肠癌。0055本发明同时公开了所述酰氯化蓝萼甲素衍生物在治疗癌症中的应用,特别是在治疗胃癌、肝癌、乳腺癌、食管癌、肺癌、宫颈癌、人结肠癌中的应用。0056本发明所公开的前述任一结构的酰氯化蓝萼甲素衍生物可以采用药剂学上的常规药物载体制成任何一种剂型,包括但不限于片剂、胶囊剂、软胶剂、喷雾剂、凝胶剂、凝胶吸入剂、口服剂、混悬剂、冲剂、贴剂、软膏、丸剂、散剂、注射剂、输液剂、冻干注射剂、脂质体注射剂、靶向给药注射剂、栓剂、缓释制剂或控释制剂。附图说明0057图1为蓝萼甲。

26、素与苯甲酰氯的反应方程式。0058图2A为图1所示反应所得蓝萼甲素与苯甲酰氯的衍生物的HPLC图。0059图2B为图1所示反应所得蓝萼甲素与苯甲酰氯的衍生物的LCMS图。0060图3为蓝萼甲素与苯磺酰氯的反应方程式。0061图4A为图3所示反应所得蓝萼甲素与苯磺酰氯的衍生物的HPLC图。0062图4B为图3所示反应所得蓝萼甲素与苯磺酰氯的衍生物的LCMS图。说明书CN101993373ACN101993376A6/14页11具体实施方式0063根据本发明的权利要求和发明内容所公开的内容,本发明的技术方案具体如以下实施例所述。0064本发明所公开的制备方式是在三乙胺和4二甲氨基吡啶DMAP存在的。

27、条件下,将经提取处理后的蓝萼甲素与苯甲酰氯或苯磺酰氯反应,从而制备得到本发明所公开的酰氯化蓝萼甲素衍生物,该制备过程主要包括蓝萼甲素的制备以及取代基的衍生化。以下实施例所述制备过程,所采用的各种化学试剂如无特别标注,则为分析纯。0065实施例1蓝萼甲素的制备0066采用香茶菜药材地上部分作为原料,通过提取、溶剂处理、树脂处理和重结晶等步骤,制备得到蓝萼甲素GLA,其具体过程如下0067步骤1为提取步骤,其进一步包括0068步骤11取香茶菜药材地上部分粉碎至20目50目;0069步骤12将所得的粉碎物与95乙醇AR按照体积比15115混合,加热,在8090温度条件下回流12小时,提取、过滤,得到。

28、提取液和剩余物;0070步骤13将步骤12所得的剩余物与95乙醇AR按照体积比15115混合,加热,在8090温度条件下回流12小时,提取、过滤,得到提取液和剩余物,重复该步骤13次;0071步骤14合并步骤12和13所得的提取液。0072步骤2为溶剂处理步骤,其进一步包括0073步骤21将步骤1所得的提取液加热,在5565温度条件下加热减压浓缩,回收乙醇并得到粘稠的初级浓缩物;0074步骤22将步骤21所得的初级浓缩物与水按照体积比18110混合,在室温条件下以60120转/分的速度搅拌10分钟,随后静置612小时,弃去上清液得到下层固体;0075步骤23将步骤22所得的固体与乙酸乙酯AR按。

29、照体积比1416混合,在2535温度条件下以60120转/分的速度搅拌溶解,静置13小时,过滤得到滤液和不溶物;0076步骤24将步骤23所得的不溶物与乙酸乙酯AR按照体积比1416混合,在2535温度条件下以60120转/分的速度搅拌溶解,静置13小时,过滤得到滤液和不溶物,重复该步骤13次;0077步骤25合并步骤23和24所得的滤液;0078步骤26将步骤25所得的滤液加热,在3545温度条件下加热减压浓缩,回收乙酸乙酯AR,得到固体浓缩物。0079步骤3为树脂处理步骤,其进一步包括0080步骤31将步骤2所得的固体浓缩物与95乙醇AR按照体积比1416混合溶解,得到溶液;0081步骤3。

30、2将步骤31所得的溶液缓慢加到7号树脂柱中,起观察树脂的颜色,在树脂柱有2/3变色时,停止加样,并采用200ML400ML的95乙醇AR冲洗该树脂柱,收集所有流出液,所述树脂柱的填充物为强碱性阴离子树脂并用氢氧化钠饱和至PH值中性;说明书CN101993373ACN101993376A7/14页120082步骤33将步骤32所得流出液加热,并在5565温度条件下加热减压回流,直至溶剂干,得到固体残留物。0083步骤4为重结晶步骤,其进一步包括0084步骤41将上述残留物与3040的极性溶剂按照体积比1416混合,得到初级溶液,加热,在30的40温度条件下减压浓缩,在2313温度条件下静置析晶,。

31、过滤得到浅黄色针状结晶;0085所述极性溶剂为按照体积比1112混合的氯仿AR和丙酮AR的混合溶液;0086步骤42将步骤41所得的结晶与极性溶剂按照体积比1416混合,在2313温度条件下反复重结晶24次,每次1224小时,得到中间产物蓝萼甲素;0087所述极性溶剂为按照体积比1114混合的氯仿AR和丙酮AR的混合溶液。0088通过上述步骤制备得到蓝萼甲素。0089实施例2衍生化0090按照图1所示的反应方程式,将实施例1所制备得到的蓝萼甲素,采用苯甲酰氯进行衍生化,从而向蓝萼甲素中引入修饰取代基,得到蓝萼甲素的苯甲酰氯衍生物,所述衍生化步骤5进一步包括0091步骤51将90110MG步骤4。

32、所得蓝萼甲素溶于37ML二氯甲烷中,并在05的冰水浴条件下,缓慢依次加入415515MG苯甲酰氯、406506MG三乙胺和3141MGDMAP,在室温条件下搅拌反应12小时;0092步骤52向步骤51的反应溶液中加入515ML水稀释,随后采用515ML二氯甲烷萃取24次,合并有机相并采用饱和食盐水洗涤、无水硫酸钠干燥;0093步骤53将步骤52中经洗涤干燥后的有机相加热至3540减压浓缩以蒸去溶剂,并在室温条件下干燥,得到白色粉末状产物;0094步骤54采用高效制备薄层层析硅胶板分离步骤53所得白色粉末状产物,采用体积比为101的氯仿丙酮混合溶液作为展开剂,待产物展开后,采用紫外灯在254NM。

33、下检视,刮下样品分布带,分离得到产物,将分离所得产物溶于1525ML甲醇,过滤并将所得滤液加热至3540减压浓缩至干,得到蓝萼甲素的苯甲酰氯衍生物的无色晶体。0095实施例3衍生化0096按照图3所示的反应方程式,将实施例1所制备得到的蓝萼甲素,采用苯磺酰氯进行衍生化,从而向蓝萼甲素中引入修饰取代基,得到蓝萼甲素的苯磺酰氯衍生物,所述衍生化步骤5进一步包括0097步骤51将90110MG步骤4所得蓝萼甲素溶于37ML二氯甲烷中,并在05的冰水浴条件下,缓慢依次加入10681268MG苯磺酰氯、863963MG三乙胺和6282MGDMAP,在室温条件下搅拌反应12小时;0098步骤52向步骤51。

34、的反应溶液中加入515ML水稀释,随后采用515ML二氯甲烷萃取24次,合并有机相并采用饱和食盐水洗涤、无水硫酸钠干燥;0099步骤53将步骤52中经洗涤干燥后的有机相加热至3540减压浓缩以蒸说明书CN101993373ACN101993376A8/14页13去溶剂,并在室温条件下干燥,得到白色粉末状产物;0100步骤54采用高效制备薄层层析硅胶板分离步骤53所得白色粉末状产物,采用体积比为101的氯仿丙酮混合溶液作为展开剂,待产物展开后,采用紫外灯在254NM下检视,刮下样品分布带,分离得到产物,将分离所得产物溶于1525ML甲醇,过滤并将所得滤液加热至3540减压浓缩至干,得到蓝萼甲素的。

35、苯磺酰氯衍生物的无色晶体。0101实施例40102采用以下技术参数改进实施例1。0103步骤11中采用粉碎至30目的香茶菜药材地上部分。0104步骤12和步骤13的重结晶过程中,按照体积比18混合所得粉碎物与95乙醇,加热回流的温度为83,加热回流的时间为17小时。0105重复步骤13的重结晶过程2次。0106步骤21中,加热减压浓缩的温度为58。0107步骤22中,按照体积比19混合初级浓缩物与水,搅拌后静置的时间为8小时。0108步骤23和24的重结晶过程中,按照体积比145混合步骤22所得的固体与乙酸乙酯,溶解的温度为15,静置的时间为25小时。0109重复步骤24的重结晶过程2次。01。

36、10步骤26中,加热减压浓缩的温度为38。0111步骤31中,按照体积比145将步骤2所得固体浓缩物溶解于95乙醇。0112步骤32中,采用250ML的95乙醇冲洗树脂柱。0113步骤33中,加热减压回流的温度为58。0114步骤41中,按照体积比145混合残留物与33的极性溶剂,所述极性溶剂为体积比115的氯仿丙酮混合溶液,所述加热减压浓缩的温度为33,静置析晶的温度为18。0115步骤42中,按照体积比145混合所得晶体与33的极性溶剂,所述极性溶剂为体积比12的氯仿丙酮混合溶液,所述加热减压浓缩的温度为33,静置析晶的温度为18,静置析晶的时间为16小时。0116重复步骤42的重结晶过程。

37、2次。0117通过上述步骤制备得到蓝萼甲素。0118实施例50119采用以下技术参数改进实施例1。0120步骤11中采用粉碎至40目的香茶菜药材地上部分。0121步骤12和步骤13的重结晶过程中,按照体积比112混合所得粉碎物与95乙醇,加热回流的温度为87,加热回流的时间为13小时。0122重复步骤13的重结晶过程2次。0123步骤21中,加热减压浓缩的温度为62。0124步骤22中,按照体积比19混合初级浓缩物与水,搅拌后静置的时间为10小时。0125步骤23和24的重结晶过程中,按照体积比155混合步骤22所得的固体与乙酸乙酯,溶解的温度为25,静置的时间为15小时。说明书CN10199。

38、3373ACN101993376A9/14页140126重复步骤24的重结晶过程2次。0127步骤26中,加热减压浓缩的温度为42。0128步骤31中,按照体积比155将步骤2所得固体浓缩物溶解于95乙醇。0129步骤32中,采用350ML的95乙醇冲洗树脂柱。0130步骤33中,加热减压回流的温度为62。0131步骤41中,按照体积比155混合残留物与37的极性溶剂,所述极性溶剂为体积比115的氯仿丙酮混合溶液,所述加热减压浓缩的温度为37,静置析晶的温度为18。0132步骤42中,按照体积比155混合所得晶体与37的极性溶剂,所述极性溶剂为体积比13的氯仿丙酮混合溶液,所述加热减压浓缩的温。

39、度为37,静置析晶的温度为18,静置析晶的时间为20小时。0133重复步骤42的重结晶过程2次。0134通过上述步骤制备得到蓝萼甲素。0135实施例60136采用以下技术参数改进实施例2。0137步骤51中,各物质用量为,蓝萼甲素91MG、二氯甲烷35ML、苯甲酰氯425MG、416MG三乙胺、DMAP32MG。0138步骤52中,采用6ML水稀释,采用6ML二氯甲烷萃取4次。0139步骤53中,减压浓缩的温度为36,室温干燥可采用干燥器进行干燥。0140步骤54中,采用16ML甲醇溶解分离所得产物,减压浓缩的温度为36。0141实施例70142采用以下技术参数改进实施例2。0143步骤51中。

40、,各物质用量为,蓝萼甲素93MG、二氯甲烷45ML、苯甲酰氯445MG、436MG三乙胺、DMAP34MG。0144步骤52中,采用8ML水稀释,采用8ML二氯甲烷萃取3次。0145步骤53中,减压浓缩的温度为37,室温干燥可采用干燥器进行干燥。0146步骤54中,采用18ML甲醇溶解分离所得产物,减压浓缩的温度为37。0147实施例80148采用以下技术参数改进实施例2。0149步骤51中,各物质用量为,蓝萼甲素95MG、二氯甲烷5ML、苯甲酰氯465MG、456MG三乙胺、DMAP36MG。0150步骤52中,采用10ML水稀释,采用10ML二氯甲烷萃取3次。0151步骤53中,减压浓缩的。

41、温度为375,室温干燥可采用干燥器进行干燥。0152步骤54中,采用20ML甲醇溶解分离所得产物,减压浓缩的温度为375。0153实施例90154采用以下技术参数改进实施例2。0155步骤51中,各物质用量为,蓝萼甲素97MG、二氯甲烷55ML、苯甲酰氯485MG、476MG三乙胺、DMAP38MG。0156步骤52中,采用12ML水稀释,采用12ML二氯甲烷萃取3次。说明书CN101993373ACN101993376A10/14页150157步骤53中,减压浓缩的温度为38,室温干燥可采用干燥器进行干燥。0158步骤54中,采用22ML甲醇溶解分离所得产物,减压浓缩的温度为38。0159实。

42、施例100160采用以下技术参数改进实施例2。0161步骤51中,各物质用量为,蓝萼甲素99MG、二氯甲烷65ML、苯甲酰氯405MG、496MG三乙胺、DMAP40MG。0162步骤52中,采用14ML水稀释,采用14ML二氯甲烷萃取2次。0163步骤53中,减压浓缩的温度为39,室温干燥可采用干燥器进行干燥。0164步骤54中,采用24ML甲醇溶解分离所得产物,减压浓缩的温度为39。0165实施例110166采用以下技术参数改进实施例3。0167步骤51中,各物质用量为,蓝萼甲素91MG、二氯甲烷35ML、苯磺酰氯1108MG、三乙胺873MG、DMAP66MG。0168步骤52中,采用6。

43、ML水稀释,采用6ML二氯甲烷萃取4次。0169步骤53中,减压浓缩的温度为36,室温干燥可采用干燥器进行干燥。0170步骤54中,采用16ML甲醇溶解分离所得产物,减压浓缩的温度为36。0171实施例120172采用以下技术参数改进实施例3。0173步骤51中,各物质用量为,蓝萼甲素93MG、二氯甲烷45ML、苯磺酰氯1138MG、三乙胺893MG、DMAP69MG。0174步骤52中,采用8ML水稀释,采用8ML二氯甲烷萃取3次。0175步骤53中,减压浓缩的温度为37,室温干燥可采用干燥器进行干燥。0176步骤54中,采用18ML甲醇溶解分离所得产物,减压浓缩的温度为37。0177实施例。

44、130178采用以下技术参数改进实施例3。0179步骤51中,各物质用量为,蓝萼甲素95MG、二氯甲烷5ML、苯磺酰氯1168MG、三乙胺913MG、DMAP72MG。0180步骤52中,采用10ML水稀释,采用10ML二氯甲烷萃取3次。0181步骤53中,减压浓缩的温度为375,室温干燥可采用干燥器进行干燥。0182步骤54中,采用20ML甲醇溶解分离所得产物,减压浓缩的温度为375。0183实施例140184采用以下技术参数改进实施例3。0185步骤51中,各物质用量为,蓝萼甲素97MG、二氯甲烷55ML、苯磺酰氯1198MG、三乙胺933MG、DMAP75MG。0186步骤52中,采用1。

45、2ML水稀释,采用12ML二氯甲烷萃取3次。0187步骤53中,减压浓缩的温度为38,室温干燥可采用干燥器进行干燥。0188步骤54中,采用22ML甲醇溶解分离所得产物,减压浓缩的温度为38。0189实施例150190采用以下技术参数改进实施例3。说明书CN101993373ACN101993376A11/14页160191步骤51中,各物质用量为,蓝萼甲素99MG、二氯甲烷65ML、苯磺酰氯1228MG、三乙胺953MG、DMAP78MG。0192步骤52中,采用14ML水稀释,采用14ML二氯甲烷萃取2次。0193步骤53中,减压浓缩的温度为39,室温干燥可采用干燥器进行干燥。0194步骤。

46、54中,采用24ML甲醇溶解分离所得产物,减压浓缩的温度为39。0195实施例160196根据实施例45制备得到蓝萼甲素,并将所得蓝萼甲素按照实施例610进行衍生化,特别是根据实施例4和实施例8,制备得到蓝萼甲素与苯甲酰氯的衍生物。0197采用高效液相色谱HPLC和液相色谱质谱联用LCMS检测上述蓝萼甲素与苯甲酰氯的衍生物结构,所得HPLC谱图和LCMS谱图分别如图2A和图2B所示。经HPLC和LCMS检测表明,上述蓝萼甲素与苯甲酰氯的衍生物结构如下。01980199实施例170200根据实施例45制备得到蓝萼甲素,并将所得蓝萼甲素按照实施例1115进行衍生化,特别是根据实施例4和实施例13,。

47、制备得到蓝萼甲素与苯磺酰氯的衍生物。0201采用高效液相色谱HPLC和液相色谱质谱联用LCMS检测上述蓝萼甲素与苯磺酰氯的衍生物结构,所得HPLC谱图和LCMS谱图分别如图4A和图4B所示。经HPLC和LCMS检测表明,上述蓝萼甲素与苯磺酰氯的衍生物结构如下。02020203实施例18酰氯化蓝萼甲素衍生物制剂的制备0204按照上述实施例制备得到具有实施例16的分子式结构的蓝萼甲素的苯甲酰氯衍生物,或按照上述实施例制备具有实施例17的分子式结构的蓝萼甲素的苯磺酰氯衍生物。0205将所得酰氯化的蓝萼甲素,采用药剂学上的常规药物载体,并采用药剂学上的常规制备方法,制备成药剂学上的常规剂型,包括但不限。

48、于片剂、胶囊剂、软胶剂、喷雾剂、凝胶剂、凝胶吸入剂、口服剂、混悬剂、冲剂、贴剂、软膏、丸剂、散剂、注射剂、输液剂、冻干注射剂、脂质体注射剂、靶向给药注射剂、栓剂、缓释制剂或控释制剂。说明书CN101993373ACN101993376A12/14页170206实施例19酰氯化蓝萼甲素衍生物针对胃癌AGS细胞生长抑制作用的药效学实验02071、样品配制0208取按照上述实施例制备得到的蓝萼甲素的苯甲酰氯衍生物、蓝萼甲素的苯磺酰氯衍生物,分别加入相应体积的二甲基亚砜DMSO溶解,得到浓度为约50MG/ML的药物溶液,随后震荡溶解,所得药物溶液可在20条件下储存02092、细胞株0210胃癌AGS细胞02113、实验方法0212将胃癌AGS细胞培养于含10胎牛血清FBS的F12培养基中。取对数生长期的胃癌AGS细胞,按常规消化后进行细胞计数。细胞计数后调整细胞浓度为1104并接种于96孔细胞培养板上,置于培养箱中培养24小时后加药。24小时后对照组换培养液,实验组加入不同浓度的受试物,于48小时后应用MTT法MTT比色法、噻唑蓝法比色检测细胞活力。每孔中加入。

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