神经变性和神经炎症的治疗.pdf

本发明提供治疗患有以神经变性和神经炎症中的至少一者为特征的病状的受试者的方法。本发明还提供减轻患有以星形胶质化增强为特征的病状的受试者的星形胶质化的方法。本发明还提供向有需要的受试者提供神经保护的方法。

权利要求书
1.  富马酸二甲酯或其药学可接受的盐在制备治疗多发性硬化患 者的药物制剂中的用途,其中所述治疗包括给该患者施用第 一剂量的该药物制剂持续第一投用时期以及施用第二剂量的 该药物制剂持续第二投用时期，其中所述第一剂量的该药物 制剂包含120mg的富马酸二甲酯并且被配制成用于在第一投 用时期以每日两次或三次经口施用，以及其中所述第二剂量 的该药物制剂包含240mg的富马酸二甲酯并且在第二投用时 期每日两次给该患者口服施用该第二剂量的该药物制剂。

2.  根据权利要求1所述的用途，其中该第一投用时期为至少一 周。

3.  根据权利要求2所述的用途，其中该第一投用时期为一周。

4.  权利要求1所述的用途，其中在第二投用时期，当该患者经 历潮红或胃肠紊乱时，每日两或三次给该患者施用含有 120mg的富马酸二甲酯的该药物制剂，持续1周到1个月。

5.  根据权利要求1所述的用途，其中在该患者进食之前或之后 至少1小时，给该患者施用该药物制剂。

6.  根据权利要求1所述的用途，其中施用给该患者的仅有活性 剂是富马酸二甲酯。

7.  根据权利要求1所述的用途，其中施用给该患者的仅有活性 剂是富马酸二甲酯和富马酸单甲酯。

8.  根据权利要求1所述的用途，其中该药物制剂为药丸、片剂、 微片剂、丸剂、微丸剂、胶囊、含有微片剂的胶囊或液体制 剂的形式。

9.  根据权利要求1所述的用途，其中该药物制剂为含有肠溶衣 微片剂的胶囊的形式。

10.  式I化合物或其药学上可接受的盐在制备治疗患有以至少一 种选自神经变性和神经炎症的症状为特征的病状的受试者的 药物中的用途：

其中R1和R2独立地选自OH、O-和(C1-6)烷氧基，条件是 R1和R2中的至少一者是(C1-6)烷氧基，
其中所述对所述受试者施用所述治疗有效量的所述至少一 种式I化合物或其药学上可接受的盐使得至少一个选自Ccl20、 Ccl3、Ccl4、Cxcl1、Cxcl10、Cxcl2、Cxcl3、Cxcl6、IL1a、Ifit3、 Nfkbia、Nfkbiz、Tnfaip2和Zc3h12a的基因在所述受试者中的 表达受到抑制。

11.  式I化合物或其药学上可接受的盐在制备减轻患有以星形胶 质化增强为特征的病状的受试者的星形胶质化的药物中的用 途：

其中R1和R2独立地选自OH、O-和(C1-6)烷氧基。

12.  一种鉴别化合物为候选神经保护剂的方法，所述方法包括
a)在靶细胞、组织或哺乳动物中诱发神经变性和神经炎症 中的至少一者，
b)在所述化合物存在的情况下测量所述靶细胞、组织或哺 乳动物中的神经变性和神经炎症中的至少一者的至少 一个标志物的表达，和
c)在所述化合物不存在的情况下测量所述靶细胞、组织或 哺乳动物中的神经变性和神经炎症中的至少一者的至 少一个标志物的表达，
其中如果在所述化合物存在的情况下神经变性和神经炎症中 的至少一者的至少一个标志物的所述表达相对于所述化合物 不存在的情况下它的表达而言有所降低，那么所述化合物被鉴 别为候选神经保护剂。

13.  一种鉴别化合物为候选神经保护剂的方法，所述方法包括
a)在靶细胞、组织或哺乳动物中诱发神经变性和神经炎症中 的至少一者，
b)在所述化合物存在的情况下测量所述靶细胞、组织或哺乳 动物中的选自以下的至少一个基因的表达水平：Ccl20、 Ccl3、Ccl4、Cxcl1、Cxcl10、Cxcl2、Cxcl3、Cxcl6、IL1a、 Ifit3、Nfkbia、Nfkbiz、Tnfaip2、和Zc3h12a，和
c)在所述化合物不存在的情况下测量所述靶细胞、组织或哺 乳动物中的所述至少一个基因的表达水平，
其中如果在所述化合物存在的情况下所述至少一个基因的 所述表达水平相对于所述化合物不存在的情况下它的表达而 言有所降低，那么所述化合物被鉴别为候选神经保护剂。

14.  根据权利要求13所述的方法，进一步包括：
d)在所述至少一种化合物存在的情况下测量星形胶质化，和
e)在所述至少一种化合物不存在的情况下测量星形胶质化，
其中在所述化合物存在的情况下的星形胶质化相对于所述 化合物不存在的情况下的星形胶质化的程度而言有所降低。

15.  式I化合物或其药学上可接受的盐在制备用于向有需要的受 试者提供神经保护的药物中的用途：

其中R1和R2独立地选自OH、O-和(C1-6)烷氧基，条件是 R1和R2中的至少一者是(C1-6)烷氧基，
其中所述对所述受试者施用所述治疗有效量的所述至少一 种式I化合物或其药学上可接受的盐使得至少一个选自Ccl20、 Ccl3、Ccl4、Cxcl1、Cxcl10、Cxcl2、Cxcl3、Cxcl6、IL1a、Ifit3、 Nfkbia、Nfkbiz、Tnfaip2和Zc3h12a的基因在所述受试者中的 表达受到抑制。

说明书神经变性和神经炎症的治疗
本申请是申请日为2010年4月29日、中国专利申请号为 201080021505.6(国际申请号为PCT/US2010/001282)、发明名称 为“神经变性和神经炎症的治疗”的发明专利申请的分案申请。
相关申请案交叉参考
本申请案要求2009年4月29日提交的美国临时专利申请案 第61/173,797号和2009年5月4日提交的美国临时专利申请案第 61/175,270号的优先权。据此这两个申请案的全部公开内容以引用 的方式并入本文中。
技术领域
本发明提供治疗患有以神经变性和神经炎症中的至少一者为 特征的病状的受试者的方法，所述方法通过对受试者施用治疗有效 量的至少一种式I化合物或其药学上可接受的盐。本发明还提供减 轻患有以星形胶质化增强为特征的病状的受试者的星形胶质化的 方法，所述方法包括对受试者施用治疗有效量的至少一种式I化合 物或其药学上可接受的盐。本发明还提供向有需要的受试者提供神 经保护的方法，所述方法包括对受试者施用治疗有效量的至少一种 式I化合物或其药学上可接受的盐。本发明还提供鉴别化合物为治 疗以神经变性和神经炎症中的至少一者为特征的病状的候选药剂 的筛选方法。
背景技术
星形胶质细胞是脑的主要细胞组分。这些胶质细胞占总脑质 量的约90％，且在成人脑中数量上超过神经元5至10倍。在20世 纪80年代初，表征了两种类型的星形胶质细胞：纤维性和原生质 性。纤维性星形胶质细胞(1型)具有星样形状，通常可见于白质 中，且具有在有髓鞘纤维、血液毛细管之间延伸的长突，并在血脑 屏障(BBB)周围形成血管脚板(end-feet)结构。相比而言，原生 质性星形胶质细胞(2型)是有分枝的，具有包封神经元突并存在 于灰质中的短突。
已推断胶质细胞、小胶质细胞和星形胶质细胞的活化为促成 神经变性和神经炎症疾病(包含多发性硬化(MS))的病理学的 机理。在疾病早期，星形胶质细胞可分泌募集炎症细胞的细胞因子 和趋化因子。随着疾病进展，星形胶质化被认为可促成胶质瘢痕、 轴突损坏和脱髓鞘。小胶质细胞已显示在EAE发病机理的发展和 进展中具有关键作用。由小胶质细胞产生的促发炎细胞因子加重疾 病，且趋化因子将白细胞募集到炎症部位。富马酸二甲酯(DMF) 是目前处于复发缓解型MS(RRMS)临床试验III期的实验性治疗 性BG00012的活性组分。在RRMS IIb期研究中，BG00012显著减 少钆增强型脑病变。在临床前研究中，DMF已显示抑制鼠类CNS 炎症和大鼠EAE。现已发现DMF可抑制与EAE相关的星形胶质化 和小胶质细胞活化。
小胶质细胞和星形胶质细胞在神经炎症发病机理中的作用的 某些非限制性方面显示于图2中。证明星形胶质化在神经变性和神 经炎症中的作用的证据是来自多发性硬化(MS)研究，多发性硬 化是以神经变性和神经炎症为特征的疾病的一个实例。在这一模型 中，星形胶质细胞和小胶质细胞的活化在啮齿动物MS模型中在疾 病症状发作和轴突损伤之前发生。另外，选择性切除小胶质细胞降 低EAE疾病严重度和炎症。MS患者的临床证据更提供证明星形胶 质细胞的作用的证据，这是因为星形胶质化在疾病爆发期间增加。 另外，已报导活化的星形胶质细胞为继发性进行性MS中的突出细 胞类型，且推断小胶质细胞的重新活化为MS疾病爆发的驱动因素。
多发性硬化(MS)是具有针对中枢神经系统(CNS)抗原的 自身免疫活性的自身免疫疾病。所述疾病的特征在于CNS的一部 分出现炎症，导致神经元轴突周围的髓鞘损失(脱髓鞘)、轴突损 失和神经元、少突胶质细胞和胶质细胞的最终死亡。关于MS和当 前疗法的综述，参见例如McAlpine's Multiple Sclerosis,Alastair  Compston等人,第四版,Churchill Livingstone Elsevier,2006。
据估计全球有2,500,000人患有MS。它是年轻成人中最常见 的CNS疾病之一。MS是慢性进行性致残疾病，通常在青春期之后 的某一时间侵袭它的受害者，诊断一般在20岁与40岁之间作出， 但发作可以更早发生。所述疾病不直接遗传，但遗传易感性在它的 发展中起一定作用。MS是一种伴有异质临床病理学和免疫学表型 的复杂疾病。
MS有四个主要临床类型：1)复发缓解型MS(RR-MS)， 以由完全康复或康复后的后遗症和残留缺陷清楚界定的复发为特 征；疾病复发之间的时期以缺乏疾病进展为特征；2)继发性进行 性MS(SP-MS)，以起初为复发缓解型过程，接着为有或无偶然 复发的进展、较小的症状缓解和平线区为特征；3)原发性进行性 MS(PP-MS)，以从偶然平线区的发作开始且允许暂时性较小改善 的疾病进展为特征；和4)进行性复发型MS(PR-MS)，以进行 性疾病发作，具有明确的急性复发，有或无完全康复为特征；复发 之间的时期以持续进展为特征。
临床上，所述疾病最通常呈现为复发缓解型疾病，且在较小 程度上呈现为神经病学残疾的稳定进展。复发缓解型MS(RR-MS) 呈病灶或多病灶神经病学功能障碍反复发作的形式。发作看起来可 经若干年随机地发生、缓解和复发。缓解通常不完全，且一次发作 接着另一次，永久性神经缺陷递增，随之逐步向下进展。对于大多 数患者，RR-MS的常见过程的特征在于与疾病进展的最终发作相关 的重复复发。疾病的后续过程是不可预知的，但大多数患复发缓解 型疾病的患者最终将发展继发性进行性疾病。在复发缓解期，复发 与临床不活动期交替发生，且视急性发作之间的神经缺陷的存在而 定，可能或可能不留有后遗症。复发缓解期期间，复发之间的时期 在临床上是稳定的。另一方面，患进行性MS的患者展示如以上所 定义的缺陷的稳定性增加，且从发作开始或在急性发作期之后，但 这一名称不排除新复发的进一步出现。
MS病理学部分由在白质中形成病灶炎症脱髓鞘病变反映出， 所述病变是患急性及复发性疾病的患者的特点。在患进行性疾病的 患者中，脑更全面地受正常出现的白质中的扩散性但分布广泛的 (主要是轴突)损伤的影响，且大面积的脱髓鞘还位于灰质中，特 别是皮质中。
大多数用于MS的当前疗法旨在减轻炎症和抑制或调节免疫 系统。到2006为止，用于MS的可用治疗减轻炎症并减少新的急 性发作的数目，但不是所有治疗都对疾病进展有效。大量临床试验 已显示慢性MS中炎症的抑制通过持续的疾病进展极少显著地限制 残疾的累积，提示神经元损伤和炎症是独立的病理过程。因此，在 MS晚期，神经变性似乎在即使在不存在明显的炎症的情况下也进 展。因此，减缓脱髓鞘，或作为补救机理的加速CNS新生髓鞘， 或者预防轴突损失和神经元死亡是治疗MS的一部分重大目标，特 别是在MS进行性形式(诸如SP-MS)的情况下。
先前已提出诸如富马酸二甲酯(DMF)的富马酸酯用于治疗 MS(参见例如Schimrigk等人,Eur.J.Neurol.,2006,13(6):604-10； Drugs R&D,2005,6(4):229-30；美国专利第6,436,992号)。
本文提供富马酸二甲酯(DMF)体内和体外减少星形胶质细 胞活化和DMF抑制炎症细胞因子和由脂多糖(LPS)刺激初级星形 胶质细胞所诱导的促炎症信号发送的证据。
发明内容
本发明提供治疗患有以至少一种选自神经变性和神经炎症的 症状为特征的病状的受试者的方法。在一些实施方案中，所述方法 包含对受试者施用治疗有效量的至少一种式I化合物：

其中R1和R2独立地选自OH、O-和(C1-6)烷氧基，条件是R1和R2中的至少一者是(C1-6)烷氧基，或其药学上可接受的盐。在一些实施 方案中，对受试者施用治疗有效量的至少一种式I化合物或其药学 上可接受的盐使得至少一个选自Ccl20、Ccl3、Ccl4、Cxcl1、Cxcl10、 Cxcl2、Cxcl3、Cxcl6、IL1a、II1b、Tnf、Ifit3、Nfkbia、Nfkbiz、 Tnfaip2和Zc3h12a的基因在所述受试者中的表达受到抑制。在一 些实施方案中，所述以至少一种选自神经变性和神经炎症的症状为 特征的病状还以至少一个选自Ccl20、Ccl3、Ccl4、Cxcl1、Cxcl10、 Cxcl2、Cxcl3、Cxcl6、IL1a、II1b、Tnf、Ifit3、Nfkbia、Nfkbiz、 Tnfaip2和Zc3h12a的基因的表达增强为特征。在一些实施方案中， 对受试者施用治疗有效量的所述至少一种式I化合物使得至少一个 选自Gsta2、Gsta3、Gclc、Ggt1、Txnrd1、Srxn1、Sqstm1和Nqo1 的基因在受试者中的表达上调。在一些实施方案中，至少一个选自 Gsta2、Gsta3、Gclc、Ggt1、Txnrd1、Srxn1、Sqstm1和Nqo1的基 因的表达增强是在不存在至少一个选自Ccl20、Ccl3、Ccl4、Cxcl1、 Cxcl10、Cxcl2、Cxcl3、Cxcl6、IL1a、II1b、Tnf、Ifit3、Nfkbia、 Nfkbiz、Tnfaip2和Zc3h12a的基因在受试者中的表达受到抑制的情 况下达成的。在一些实施方案中，所述至少一种化合物配制成包括 所述至少一种化合物和至少一种选自载剂、佐剂和赋形剂的药学上 可接受的媒介物的药物组合物。在一些实施方案中，所述至少一种 化合物选自富马酸二甲酯和富马酸单甲酯。在一些实施方案中，对 所述受试者施用的仅有活性剂是富马酸二甲酯(DMF)。在一些实 施方案中，对所述受试者施用的仅有活性剂是富马酸单甲酯 (MMF)。在一些实施方案中，对所述受试者施用的仅有活性剂是 DMF和MMF。在一些实施方案中，所述至少一种化合物以足以在 所述受试者中减轻神经变性和神经炎症中的至少一者的量和时间 段施用。在一些实施方案中，所述以至少一种选自神经变性和神经 炎症的症状为特征的病状选自：肾上腺脑白质营养不良(Adrenal  Leukodystrophy)(ALD)、酒精中毒(Alcoholism)、亚历山大氏 病(Alexander's disease)、阿尔卑斯氏病(Alper's disease)、阿尔 茨海默氏病(Alzheimer's disease)、肌萎缩性侧索硬化(Amyotrophic  lateral sclerosis)(路葛雷克氏病(Lou Gehrig's Disease))、共济 失调毛细血管扩张(Ataxia telangiectasia)、巴腾病(Batten disease  (又名史皮莱姆-沃格特-休格尔-巴腾病 (Spielmeyer-Vogt--Batten disease))、牛海绵状脑病(Bovine  spongiform encephalopathy)(BSE)、卡纳万病(Canavan disease)、 大脑性麻痹(Cerebral palsy)、柯凯因综合征(Cockayne syndrome)、 皮质基底变性(Corticobasal degeneration)、克罗伊茨费尔特-雅各 布病(Creutzfeldt-Jakob disease)、家族性致死性失眠(Familial Fatal  Insomnia)、额颞叶变性(Frontotemporal lobar degeneration)、亨 廷顿氏病(Huntington's disease)、HIV相关性痴呆(HIV-associated  dementia)、肯尼迪氏病(Kennedy's disease)、克利伯氏病(Krabbe's  disease)、路易体性痴呆(Lewy body dementia)、神经莱姆病 (Neuroborreliosis)、马查多-约瑟夫病(Machado-Joseph disease) (脊髓小脑性共济失调3型)、多系统萎缩(Multiple System  Atrophy)、多发性硬化(Multiple sclerosis)、发作性睡病 (Narcolepsy)、尼曼-皮克病(Niemann Pick disease)、巴金森氏 病(Parkinson's disease)、佩利措伊斯-梅茨巴赫病 (Pelizaeus-Merzbacher Disease)、皮克氏病(Pick's disease)、原 发性脊髓侧索硬化(Primary lateral sclerosis)、朊病毒病(Prion  diseases)、进行性核上眼神经麻痹症(Progressive Supranuclear  Palsy)、雷夫苏姆氏病(Refsum's disease)、山霍夫病(Sandhoff  disease)、谢耳德氏病(Schilder's disease)、恶性贫血继发性脊髓 亚急性联合变性(Subacute combined degeneration of spinal cord  secondary to Pernicious Anaemia)、史皮莱姆-沃格特-休格尔-巴腾 病(又名巴腾病)、脊髓小脑共济失调(Spinocerebellar ataxia)、 脊髓性肌萎缩(Spinal muscular atrophy)、史提尔-里查德森-奥尔 泽斯基病(Steele-Richardson-Olszewski disease)、脊髓痨(Tabes  dorsalis)、中毒性脑病(Toxic encephalopathy)、LHON(莱伯氏 遗传性视神经病变(Leber's Hereditary optic neuropathy))、MELAS (线粒体脑肌病；乳酸性酸中毒；中风)、MERRF(肌肉阵挛性癫 痫；破碎红纤维病)、PEO(进行性眼外肌麻痹(Progressive External  Opthalmoplegia))、利氏综合征(Leigh's Syndrome)、MNGIE(肌 病和眼外肌瘫痪；神经病；胃肠病；脑病)、科恩-塞亚综合征 (Kearns-Sayre Syndrome)(KSS)、NARP、遗传性痉挛性截瘫 (Hereditary Spastic Paraparesis)、线粒体肌病(Mitochondrial  myopathy)和弗里德赖希共济失调(Friedreich Ataxia)。在一些实 施方案中，以神经变性和神经炎症中的至少一者为特征的病状是多 发性硬化(MS)。在一些实施方案中，受试者没有患MS。在一些 实施方案中，受试者患有复发缓解型多发性硬化，且治疗降低临床 复发的频率并延迟躯体残疾的累积。在一些实施方案中，受试者患 有复发缓解型多发性硬化，且治疗降低临床恶化的频率。
本发明还提供减轻患有以星形胶质化增强为特征的病状的受 试者的星形胶质化的方法。在一些实施方案中，所述方法包含对受 试者施用治疗有效量的至少一种式I化合物：

其中R1和R2独立地选自OH、O-和(C1-6)烷氧基，或其药学上可接 受的盐。在一些实施方案中，对受试者施用治疗有效量的至少一种 式I化合物或其药学上可接受的盐使得至少一个选自Ccl20、Ccl3、 Ccl4、Cxcl1、Cxcl10、Cxcl2、Cxcl3、Cxcl6、IL1a、II1b、Tnf、Ifit3、 Nfkbia、Nfkbiz、Tnfaip2和Zc3h12a的基因在所述受试者中的表达 受到抑制。在一些实施方案中，对受试者施用治疗有效量的所述至 少一种式I化合物使得至少一个选自Gsta2、Gsta3、Gclc、Ggt1、 Txnrd1、Srxn1、Sqstm1和Nqo1的基因在受试者中的表达上调。在 一些实施方案中，至少一个选自Gsta2、Gsta3、Gclc、Ggt1、Txnrd1、 Srxn1、Sqstm1和Nqo1的基因的表达增强是在不存在至少一个选自 Ccl20、Ccl3、Ccl4、Cxcl1、Cxcl10、Cxcl2、Cxcl3、Cxcl6、IL1a、 II1b、Tnf、Ifit3、Nfkbia、Nfkbiz、Tnfaip2和Zc3h12a的基因在受 试者中的表达受到抑制的情况下达成的。在一些实施方案中，所述 至少一种化合物配制成包括所述至少一种化合物和至少一种选自 载剂、佐剂和赋形剂的药学上可接受的媒介物的药物组合物。在一 些实施方案中，所述至少一种化合物配制成包括所述至少一种化合 物和至少一种选自载剂、佐剂和赋形剂的药学上可接受的媒介物的 药物组合物。在一些实施方案中，所述至少一种化合物选自富马酸 二甲酯和富马酸单甲酯。在一些实施方案中，对所述受试者施用的 仅有活性剂是富马酸二甲酯(DMF)。在一些实施方案中，对所述 受试者施用的仅有活性剂是富马酸单甲酯(MMF)。在一些实施方 案中，对所述受试者施用的仅有活性剂是DMF和MMF。在一些实 施方案中，所述至少一种化合物以足以在所述受试者中减轻神经变 性和神经炎症中的至少一者的量和时间段施用。在一些实施方案 中，所述以星形胶质化增强为特征的病状选自：肾上腺脑白质营养 不良(ALD)、酒精中毒、亚历山大氏病、阿尔卑斯氏病、阿尔茨 海默氏病、肌萎缩性侧索硬化(路葛雷克氏病)、共济失调毛细血 管扩张、巴腾病(又名史皮莱姆-沃格特-休格尔-巴腾病)、牛海绵 状脑病(BSE)、卡纳万病、大脑性麻痹、柯凯因综合征、皮质基 底变性、克罗伊茨费尔特-雅各布病、家族性致死性失眠、额颞叶变 性、亨廷顿氏病、HIV相关性痴呆、肯尼迪氏病、克利伯氏病、路 易体性痴呆、神经莱姆病、马查多-约瑟夫病(脊髓小脑性共济失调 3型)、多系统萎缩、多发性硬化、发作性睡病、尼曼-皮克病、巴 金森氏病、佩利措伊斯-梅茨巴赫病、皮克氏病、原发性脊髓侧索硬 化、朊病毒病、进行性核上眼神经麻痹症、雷夫苏姆氏病、山霍夫 病、谢耳德氏病、恶性贫血继发性脊髓亚急性联合变性、史皮莱姆 -沃格特-休格尔-巴腾病(又名巴腾病)、脊髓小脑共济失调、脊髓 性肌萎缩、史提尔-里查德森-奥尔泽斯基病、脊髓痨、中毒性脑病、 LHON(莱伯氏遗传性视神经病变)、MELAS(线粒体脑肌病；乳 酸性酸中毒；中风)、MERRF(肌肉阵挛性癫痫；破碎红纤维病)、 PEO(进行性眼外肌麻痹)、利氏综合征、MNGIE(肌病和眼外肌 瘫痪；神经病；胃肠病；脑病)、科恩-塞亚综合征(KSS)、NARP、 遗传性痉挛性截瘫、线粒体肌病和弗里德赖希共济失调。在一些实 施方案中，以神经变性和神经炎症中的至少一者为特征的病状是多 发性硬化(MS)。在一些实施方案中，受试者没有患MS。在一些 实施方案中，受试者患有复发缓解型多发性硬化，且治疗降低临床 复发的频率并延迟躯体残疾的累积。在一些实施方案中，受试者患 有复发缓解型多发性硬化，且治疗降低临床恶化的频率。
本发明还提供鉴别化合物为候选神经保护剂的方法。在一些 实施方案中，所述方法包括a)在靶细胞、组织或哺乳动物中诱发 神经变性和神经炎症中的至少一者，b)在所述化合物存在的情况 下测量所述靶细胞、组织或哺乳动物中的神经变性和神经炎症中的 至少一者的至少一个标志物的表达，和c)在所述化合物不存在的 情况下测量所述靶细胞、组织或哺乳动物中的神经变性和神经炎症 中的至少一者的至少一个标志物的表达，其中如果在所述化合物存 在的情况下神经变性和神经炎症中的至少一者的至少一个标志物 的所述表达相对于所述化合物不存在的情况下它的表达而言有所 降低，那么所述化合物鉴别为候选神经保护剂。在一些实施方案中， 所述方法更包括：d)在所述至少一种化合物存在的情况下测量星 形胶质化，和e)在所述至少一种化合物不存在的情况下测量星形 胶质化，其中在所述化合物存在的情况下的星形胶质化相对于所述 化合物不存在的情况下的星形胶质化的程度而言有所降低。在一些 实施方案中，所述至少一个标志物是至少一个选自Ccl20、Ccl3、 Ccl4、Cxcl1、Cxcl10、Cxcl2、Cxcl3、Cxcl6、IL1a、II1b、Tnf、Ifit3、 Nfkbia、Nfkbiz、Tnfaip2和Zc3h12a的基因的表达水平。
本发明还提供向有需要的受试者提供神经保护的方法。在一 些实施方案中，所述方法包含对受试者施用治疗有效量的至少一种 式I化合物：

其中R1和R2独立地选自OH、O-和(C1-6)烷氧基，条件是R1和R2中的至少一者是(C1-6)烷氧基，或其药学上可接受的盐，其中对受试 者施用治疗有效量的至少一种式I化合物或其药学上可接受的盐使 得至少一个选自Ccl20、Ccl3、Ccl4、Cxcl1、Cxcl10、Cxcl2、Cxcl3、 Cxcl6、IL1a、II1b、Tnf、Ifit3、Nfkbia、Nfkbiz、Tnfaip2和Zc3h12a 的基因在所述受试者中的表达受到抑制。在一些实施方案中，所述 以至少一种选自神经变性和神经炎症的症状为特征的病状还以至 少一个选自Ccl20、Ccl3、Ccl4、Cxcl1、Cxcl10、Cxcl2、Cxcl3、 Cxcl6、IL1a、II1b、Tnf、Ifit3、Nfkbia、Nfkbiz、Tnfaip2和Zc3h12a 的基因的表达增强为特征。在一些实施方案中，对受试者施用治疗 有效量的所述至少一种式I化合物使得至少一个选自Gsta2、Gsta3、 Gclc、Ggt1、Txnrd1、Srxn1、Sqstm1和Nqo1的基因在受试者中的 表达上调。在一些实施方案中，至少一个选自Gsta2、Gsta3、Gclc、 Ggt1、Txnrd1、Srxn1、Sqstm1和Nqo1的基因的表达增强是在不存 在至少一个选自Ccl20、Ccl3、Ccl4、Cxcl1、Cxcl10、Cxcl2、Cxcl3、 Cxcl6、IL1a、II1b、Tnf、Ifit3、Nfkbia、Nfkbiz、Tnfaip2和Zc3h12a 的基因在受试者中的表达受到抑制的情况下达成的。在一些实施方 案中，所述至少一种化合物配制成包括所述至少一种化合物和至少 一种选自载剂、佐剂和赋形剂的药学上可接受的媒介物的药物组合 物。在一些实施方案中，所述至少一种化合物选自富马酸二甲酯和 富马酸单甲酯。在一些实施方案中，对所述受试者施用的仅有活性 剂是富马酸二甲酯(DMF)。在一些实施方案中，对所述受试者施 用的仅有活性剂是富马酸单甲酯(MMF)。在一些实施方案中，对 所述受试者施用的仅有活性剂是DMF和MMF。在一些实施方案中， 所述至少一种化合物以足以在所述受试者中减轻神经变性和神经 炎症中的至少一者的量和时间段施用。在一些实施方案中，所述以 至少一种选自神经变性和神经炎症的症状为特征的病状选自：肾上 腺脑白质营养不良(ALD)、酒精中毒、亚历山大氏病、阿尔卑斯 氏病、阿尔茨海默氏病、肌萎缩性侧索硬化(路葛雷克氏病)、共 济失调毛细血管扩张、巴腾病(又名史皮莱姆-沃格特-休格尔-巴腾 病)、牛海绵状脑病(BSE)、卡纳万病、大脑性麻痹、柯凯因综 合征、皮质基底变性、克罗伊茨费尔特-雅各布病、家族性致死性失 眠、额颞叶变性、亨廷顿氏病、HIV相关性痴呆、肯尼迪氏病、克 利伯氏病、路易体性痴呆、神经莱姆病、马查多-约瑟夫病(脊髓小 脑性共济失调3型)、多系统萎缩、多发性硬化、发作性睡病、尼 曼-皮克病、巴金森氏病、佩利措伊斯-梅茨巴赫病、皮克氏病、原 发性脊髓侧索硬化、朊病毒病、进行性核上眼神经麻痹症、雷夫苏 姆氏病、山霍夫病、谢耳德氏病、恶性贫血继发性脊髓亚急性联合 变性、史皮莱姆-沃格特-休格尔-巴腾病(又名巴腾病)、脊髓小脑 共济失调、脊髓性肌萎缩、史提尔-里查德森-奥尔泽斯基病、脊髓 痨、中毒性脑病、LHON(莱伯氏遗传性视神经病变)、MELAS(线 粒体脑肌病；乳酸性酸中毒；中风)、MERRF(肌肉阵挛性癫痫； 破碎红纤维病)、PEO(进行性眼外肌麻痹)、利氏综合征、MNGIE (肌病和眼外肌瘫痪；神经病；胃肠病；脑病)、科恩-塞亚综合征 (KSS)、NARP、遗传性痉挛性截瘫、线粒体肌病和弗里德赖希 共济失调。在一些实施方案中，以神经变性和神经炎症中的至少一 者为特征的病状是多发性硬化(MS)。在一些实施方案中，受试 者没有患MS。在一些实施方案中，受试者患有复发缓解型多发性 硬化，且治疗降低临床复发的频率并延迟躯体残疾的累积。在一些 实施方案中，受试者患有复发缓解型多发性硬化，且治疗降低临床 恶化的频率。
附图说明
图1A：大鼠EAE模型中的DMF剂量反应。
图1B：BG00012对胶质细胞的抑制。
图2：星形胶质细胞和小胶质细胞在神经炎症发病机理中的 作用的各种分子介质。
图3A：在有和没有DMF治疗的情况下，大鼠脊髓的星形胶 质细胞染色。
图3B：利用Aperio颜色反褶积(color deconvolution)的形 态定量。
图3C：腹灰质和白质区。
图3D：腹灰质和白质中阳性GFAP染色的形态定量。
图4A：BG200012抑制GFAP的表达。
图4B：BG200012抑制LPS诱导的TNF表达。
图4C：星形胶质细胞中对BG00012的体外PD反应。
图4D：BG00012治疗后的星形胶质细胞活力。
图5：BG00012抑制炎症细胞因子和由初级星形胶质细胞的 LPS刺激所诱导的促炎症信号发送。
图6A：培养的星形胶质细胞中的谷胱甘肽水平。
图6B：培养的星形胶质细胞的代谢活性。
图6C：培养的星形胶质细胞的细胞活力。
图7A：经MMF治疗的细胞的原始荧光迹线。
图7B：经MMF治疗的细胞中的Ca++运动。
图7C：数据的非线性回归分析。
图8A：培养的星形胶质细胞的细胞活力。
图8B：培养的星形胶质细胞的代谢活性。
图8C：培养的星形胶质细胞中的ATP水平。
图9：DMF和MMF增加初级大鼠和人类星形胶质细胞中的 Nrf2的细胞水平。
图10：初级大鼠星形胶质细胞中受DMF刺激的典型信号发 送途径。
图11：初级大鼠星形胶质细胞中受DMF影响的主要细胞功 能。
图12：DMF治疗减轻EAE(大鼠脊髓)期间的髓鞘损失。
具体实施方式
以神经变性和神经炎症中的至少一者为特征的病状是这些 过程中的任一者或两者导致受试者神经系统不能正常工作的病状。 正常功能的损失可位于中枢神经系统(例如脑、脊髓)和末梢神经 系统的任一或两者中。所述病状的实例包含但不限于肾上腺脑白质 营养不良(ALD)、酒精中毒、亚历山大氏病、阿尔卑斯氏病、阿 尔茨海默氏病、肌萎缩性侧索硬化(路葛雷克氏病)、共济失调毛 细血管扩张、巴腾病(又名史皮莱姆-沃格特-休格尔-巴腾病)、牛 海绵状脑病(BSE)、卡纳万病、大脑性麻痹、柯凯因综合征、皮质 基底变性、克罗伊茨费尔特-雅各布病、家族性致死性失眠、额颞叶 变性、亨廷顿氏病、HIV相关性痴呆、肯尼迪氏病、克利伯氏病、 路易体性痴呆、神经莱姆病、马查多-约瑟夫病(脊髓小脑性共济失 调3型)、多系统萎缩、多发性硬化、发作性睡病、尼曼-皮克病、 巴金森氏病、佩利措伊斯-梅茨巴赫病、皮克氏病、原发性脊髓侧索 硬化、朊病毒病、进行性核上眼神经麻痹症、雷夫苏姆氏病、山霍 夫病、谢耳德氏病、恶性贫血继发性脊髓亚急性联合变性、史皮莱 姆-沃格特-休格尔-巴腾病(又名巴腾病)、脊髓小脑共济失调、脊 髓性肌萎缩、史提尔-里查德森-奥尔泽斯基病、脊髓痨、中毒性脑 病、LHON(莱伯氏遗传性视神经病变)、MELAS(线粒体脑肌病； 乳酸性酸中毒；中风)、MERRF(肌肉阵挛性癫痫；破碎红纤维病)、 PEO(进行性眼外肌麻痹)、利氏综合征、MNGIE(肌病和眼外肌 瘫痪；神经病；胃肠病；脑病)、科恩-塞亚综合征(KSS)、NARP、 遗传性痉挛性截瘫、线粒体肌病和弗里德赖希共济失调。
在一些实施方案中，对患者施用如本文所述的至少一种化合 物或其药学上可接受的盐产生“神经保护”，或换言之，对患者施 用化合物的作用是神经保护。神经保护包括神经系统、它的细胞、 结构和功能在损伤或损害之后的维持、抢救、康复和再生中的至少 一者。在一些实施方案中，神经保护包括初级神经保护和二级神经 保护中的至少一者。“初级神经保护”是包括直接调节驻留在CNS 内的神经细胞(至少一种选自神经元、少突神经胶质细胞、星形胶 质细胞和小胶质细胞的细胞类型)的结构和/或功能的保护。“二级 神经保护”是包括调节通常驻留在CNS外部的至少一种细胞类型 (例如免疫细胞)的结构或功能的保护。在二级神经保护中，至少 一种化合物或其药学上可接受的盐直接或间接地作用于通常驻留 在CNS外部的至少一种细胞类型上以调节所述至少一种细胞类型 的结构和/或功能。所述至少一种细胞类型随后直接或以别的方式调 节驻留在CNS内的神经细胞(至少一种选自神经元、少突神经胶 质细胞、星形胶质细胞和小胶质细胞的细胞类型)的结构和/或功能。 在一些实施方案中，神经保护包括减轻受试者的神经变性或神经炎 症的严重性或等级。神经系统、它的细胞、结构和功能的“维持” 包括至少一种化合物或其药学上可接受的盐在本文公开的疾病或 病状的至少一种病征或症状显现之前施用于受试者且减轻疾病或 病状最后的严重性和/或降低疾病和/或病状的发作等级的实施方 案。
在一些实施方案中，待治疗的病状的特征为诸如在受试者的 神经细胞中的促炎症基因的表达增强。在受试者经历星形胶质化的 情况下，例如至少一个选自Ccl20、Ccl3、Ccl4、Cxcl1、Cxcl10、 Cxcl2、Cxcl3、Cxcl6、IL1a、II1b、Tnf、Ifit3、Nfkbia、Nfkbiz、 Tnfaip2和Zc3h12a的促炎症基因的表达在受试者中是增加的。在 一些实施方案中，对受试者施用如本文所述的至少一种化合物或其 药学上可接受的盐使得至少一个选自Ccl20、Ccl3、Ccl4、Cxcl1、 Cxcl10、Cxcl2、Cxcl3、Cxcl6、IL1a、II1b、Tnf、Ifit3、Nfkbia、 Nfkbiz、Tnfaip2和Zc3h12a的基因的表达受到抑制。
本文还公开神经保护基因的某些实例，即Gsta2、Gsta3、Gclc、 Ggt1、Txnrd1、Srxn1、Sqstm1和Nqo1。在一些实施方案中，对受 试者施用如本文所述的至少一种化合物或其药学上可接受的盐使 得至少一个选自Gsta2、Gsta3、Gclc、Ggt1、Txnrd1、Srxn1、Sqstm1 和Nqo1的基因上调。
术语“治疗有效量”是指预防或延迟受试者的以神经变性或 神经炎症为特征的病状的至少一个症状的发作或缓解其症状或达 到所需生物结果(诸如星形胶质化减轻)的化合物或其药学上可接 受的盐的量
在一些实施方案中，至少一个选自Ccl20、Ccl3、Ccl4、Cxcl1、 Cxcl10、Cxcl2、Cxcl3、Cxcl6、IL1a、II1b、Tnf、Ifit3、Nfkbia、 Nfkbiz、Tnfaip2、Zc3h12a、Gsta2、Gsta3、Gclc、Ggt1、Txnrd1、 Srxn1、Sqstm1和Nqo1的基因的表达水平在受试者中测量。在一些 实施方案中，基因的表达通过测定这一基因的mRNA的表达水平来 测量。在一些实施方案中，基因的表达通过测定这一基因所编码的 蛋白质产物的表达水平来测量。在一些实施方案中，所述蛋白质产 物是在受试者的脑脊髓液中测量。在一些实施方案中，表达水平在 至少一个选自治疗开始之前、治疗期间和治疗之后的时间点测量。
术语“治疗”是指以在统计上显著的程度或所属领域的技术 人员可检测的程度上有效预防或延迟受试者的以神经变性或神经 炎症为特征的病状的至少一个症状的发作或缓解其症状的量、方式 和/或模式来施用疗法。有效量、方式或模式可视受试者而不同且可 根据受试者进行调整。关于本文提及的神经病症，本发明方法提供 的治疗旨在改善病症的病状(或减轻不利影响)，且未必完全消除或 治愈病症。
除非另有说明，否则术语“MMF”是指呈酸形式的富马酸单 甲酯(富马酸甲基氢酯(methyl hydrogen fumarate)，又名“MHF”) 以及它相应的盐。
在一些实施方案中，本发明方法包括对患有所述病状的受试 者施用治疗有效量的至少一种式I化合物：

其中R1和R2独立地选自OH、O-和(C1-6)烷氧基，或其药学上可接 受的盐。(C1-6)烷氧基可选自例如(C1-5)烷氧基、(C1-4)烷氧基、(C1-3) 烷氧基、乙氧基、甲氧基、(C2-3)烷氧基、(C2-4)烷氧基、(C2-5)烷氧 基和(C1-6)烷氧基。在式I化合物的一些实施方案中，药学上可接受 的盐是金属(M)阳离子的盐，其中M可为碱金属、碱土金属或过 渡金属，诸如Li、Na、K、Ca、Zn、Sr、Mg、Fe或Mn。在非限 制性说明性实施方案中，式I化合物是富马酸二甲酯(R1是CH3且 R2是CH3)或富马酸单甲酯(R1是CH3且R2是O-或OH，例如富 马酸单甲酯的药学上可接受的盐，例如特别是Ca-MMF)。
在某些实施方案中，本发明方法使受试者的神经变性和/或神 经炎症减轻。这些神经保护作用未必消除所有损害或变性，而宁可 说是延迟或甚至阻止变性进展或预防变性过程的开始或改善病症 的病理状况。本发明方法可向神经系统的任何部分提供神经保护， 所述神经系统诸如中枢神经系统，例如海马、小脑、脊髓、皮质(例 如运动原或躯体感觉皮质)、纹状体、基底前脑(胆碱能神经元)、 腹中脑(黑质细胞)和蓝斑(中枢神经系统的神经肾上腺素细胞)。
在一些实施方案中，所述至少一种化合物或其药学上可接受 的盐以足以在所述受试者中减轻神经变性和神经炎症中的至少一 者的量和时间段施用。在一些实施方案中，所述至少一种化合物以 足以在所述受试者中减轻星形胶质化的量和时间段施用。在一些实 施方案中，所述至少一种化合物或其药学上可接受的盐以足以向受 试者提供神经保护的量和时间段施用。
本发明方法可包含用治疗有效量的至少一种选自DMF和 MMF的化合物治疗受试者。关于DMF或MMF，治疗有效量可在 约1mg/kg至约50mg/kg(例如约2.5mg/kg至约20mg/kg或约2.5 mg/kg至约15mg/kg)的范围内。如所属领域的技术人员所知，有 效剂量还将视施用途径、赋形剂用量和与其它疗法性治疗(包含使 用其它治疗剂)共同使用的可能性而不同。举例来说，待对受试者 施用的DMF或MMF的有效剂量，例如经口施用，可为每天约0.1 g至约1g，例如每天约200mg至约800mg(例如每天约240mg 至约720mg，或每天约480mg至约720mg，或每天约720mg)。 举例来说，每天720mg可以2、3、4或6次等剂量的分开施用来 施用。
在所述方法的一些实施方案中，药物制剂中存在120mg富马 酸二甲酯。在所述方法的一些实施方案中，药物制剂每天三次(TID) 对患者施用。在所述方法的一些实施方案中，药物制剂每天两次 (BID)对患者施用。
在所述方法的一些实施方案中，药物制剂中存在240mg富马 酸二甲酯。在所述方法的一些实施方案中，药物制剂每天三次(TID) 对患者施用。在所述方法的一些实施方案中，药物制剂每天两次 (BID)对患者施用。
在所述方法的一些实施方案中，药物制剂在患者消耗食物之 前或之后至少一小时才施用。
在所述方法的一些实施方案中，施用药物制剂更包括对患者 施用第一剂量的药物制剂持续第一投用时期；和对患者施用第二剂 量的药物制剂持续第二投用时期。在所述方法的一些实施方案中， 第一投用时期为至少一周。在所述方法的一些实施方案中，第一剂 量的药物制剂包括120mg富马酸二甲酯，且药物制剂每天三次 (TID)对患者施用，持续第一投用时期。在所述方法的一些实施 方案中，第二剂量的第一药物制剂包括240mg富马酸二甲酯，且 所述第一药物制剂每天三次(TID)对患者施用，持续第二投用时 期。在所述方法的一些实施方案中，第二剂量的第一药物制剂包括 240mg富马酸二甲酯，且所述第一药物制剂每天两次(BID)对患 者施用，持续第二投用时期。在所述方法的一些实施方案中，如果 在第二投用时期期间，患者经历潮红或胃肠紊乱，那么对患者施用 包括120mg富马酸二甲酯的剂量的第一药物制剂，每天三次 (TID)，持续1周至1个月的时期。
治疗性化合物(例如DMF或MMF)可由允许传递治疗神经 病症的化合物的任何方法施用。举例来说，治疗性化合物可经由药 丸、片剂、微片剂、丸剂、微丸剂、胶囊(例如含有微片剂)、栓 剂、经口施用的液体制剂和呈饮食增补剂形式施用。药学上可接受 的组合物可包含众所周知的药学上可接受的赋形剂，例如如果组合 物是含有活性剂的水溶液，那么它可为等渗盐水、5％葡萄糖或其它 类似物。可使用诸如环糊精的增溶剂或熟悉此领域者所熟知的其它 增溶剂作为传递治疗性化合物的药用赋形剂。关于一些含有DMF 和/或MMF的制剂，参见例如美国专利第6,509,376号和第6,436,992 号。至于施用途径，组合物可经口、鼻内、经皮、皮下、皮内、经 阴道、耳内、眼内、肌肉内、经颊、直肠、经粘膜或经由吸入或静 脉内施用来施用。DMF或MMF优选经口施用。
在一些实施方案中，根据本发明的方法包括经口施用含有主 要由60-240mg(例如120mg)富马酸二甲酯组成的呈肠溶衣微片 剂形式的药物制剂的胶囊。在一些实施方案中，所述微片剂的平均 直径是1-5mm，例如1-3mm或2mm。
治疗性化合物可呈持续释放或控制释放药物制剂形式施用。 所述制剂可由所属领域的技术人员利用各种技术制备。举例来说， 制剂可含有治疗性化合物、速率控制聚合物(也就是控制治疗性化 合物从剂型中释放的速率的物质)和任选其它赋形剂。速率控制聚 合物的一些实例是羟基烷基纤维素、羟丙基烷基纤维素(例如羟丙 基甲基纤维素、羟丙基乙基纤维素、羟丙基异丙基纤维素、羟丙基 丁基纤维素和羟丙基己基纤维素)、聚(亚乙基)氧化物、烷基纤维素 (例如乙基纤维素和甲基纤维素)、羧甲基纤维素、亲水性纤维素 衍生物和聚乙二醇，以及如WO 2006/037342、WO 2007/042034、 WO 2007/042035、WO 2007/006308、WO 2007/006307和WO 2006/050730中所述的组合物。
在富马酸二甲酯对患者施用的一些实施方案中，DMF在含有 肠溶衣微片剂的胶囊中配制。这种制剂在本文中称为“BG-12”或 “BG00012”。片剂的包衣由不同层构成。第一层是甲基丙烯酸-甲 基丙烯酸甲酯共聚物/异丙醇溶液，其隔离片剂核心以防被后续施用 的水混悬液潜在水解。随后由水性甲基丙烯酸-丙烯酸乙酯共聚物混 悬液给予片剂的肠溶衣。胶囊的全部组分和定量组成列于表1中。
表1


所述制造过程和过程控制包含以下：
A)称量活性和非活性成分且用适当的标签鉴别各起始物质(名称、 批号、量)。
B)掺合：制备含有活性成分富马酸二甲酯和核心微片剂的所有赋形 剂的粉末混合物。
C)制片：旋转压力机安装有多个冲压工具、一个除尘器，且粉末混 合物根据给定的规格来制片。
D)薄膜包覆：根据常用的薄膜包覆方法，通过使用薄膜包覆设备喷 洒隔离溶液来隔离微片剂核心。在薄膜包覆盘中用肠溶衣混悬液喷洒隔离 的核心。控制微片剂的耐胃性(gastro-resistance)和活性成分含量。
E)胶囊装填：以微片剂活性成分计，给胶囊装填对应于每胶囊120mg 活性成分的量。控制胶囊装填重量和胶囊长度。
F)包装：在起泡机上将胶囊包装于热成形PVC/PE/PVdC-铝泡罩中。
合成和配制DMF和MMF的其它方法提供于例如美国专利第 7,320,999号的5-7栏处的实施例以及WO 2006/037342、WO 2007/042034、WO 2007/042035、WO 2007/006308、WO 2007/006307 和WO 2006/050730中。
本发明将在以下实施例中进一步描述，这些实施例不限制权 利要求书中所述的本发明范围。
方法
大鼠EAE：
在第0天，用含MOG 1-125(100微克/大鼠)的IFA在尾巴 根部对雌性Brown Norway大鼠(Charles River Laboratories)进行 皮内免疫。第3天，每天经口传递呈于0.8％HPMC中的混悬液形 式的DMF(BG00012)，5、25、50、100、200mg/kg。N＝6/组。得 分0＝无疾病，1＝尾巴麻痹，2＝后肢无力，3＝后肢麻痹，4＝后肢 麻痹且前肢无力，5＝垂死或死亡。根据机构动物委员会(Institutional  Animal Committee)指南进行实验性体内手术。
初级星形胶质细胞培养物：
如制造商方案所述培养来自皮质、海马和纹状体(Lonza  clontech)的大鼠星形胶质细胞。向培养物中添加DMF于DMSO 中的限制稀释液，持续6小时或24小时，且用大肠杆菌(E.Coli) LPS(Sigma)刺激。使用QIAgen Rneasy方法制备RNA。
组织学和形态测定：
腰椎脊髓切面制备成FFPE切面以用于免疫组织化学分析且 在DAKO自动染色机上使用GFAP抗体(DAKO)、IBA-1(Wako)、 CD3(DAKO)来处理。使用Aperio Spectrum Color Deconvolution 软件进行形态测定分析。
表达分析：
总RNA使用Qiagen RNeasy方法从快速冷冻腰椎脊髓切面制 备。使用Applied Biosciences TaqMan探针扩增特异性转录产物且使 用GAPDH辅助探针归一化。
实施例1：
BG00012，也就是一种可经口利用的富马酸二甲酯(DMF) 制剂，正处于复发缓解型多发性硬化(RRMS)的III期测试中。在 IIb期测试中，BG-12显著减少钆增强的脑病变且减少T1低信号黑 洞。BG00012的活性组分富马酸二甲酯(DMF)在大鼠EAE模型 中测试。如图1A所示，用各种剂量的DMF处理患实验上诱发的 EAE的大鼠以剂量依赖性方式减轻EAE症状。用200mg/kg DMF 处理完全消除疾病。(图1A)。
图1B显示用媒介物或BG00012处理的大鼠的脊髓的横截面。 图a-f的处理和染色如下：
a.Luxol Fast Blue/媒介物
b.Luxol Fast Blue/BG00012
c.GFAP/媒介物
d.GFAP/BG00012
e.IBA1/媒介物
f.IBA1/BG00012
如图1B所示，用BG00012处理的脊髓中的活化的星形胶质 细胞和小胶质细胞明显减少，且髓鞘被保存下来。
实施例2
这一实施例显示，BG00012体内减少星形胶质细胞活化。具 体地说，DMF处理的大鼠的脊髓的灰质中的活化星形胶质细胞比 仅接受媒介物的大鼠的脊髓中少。图3A显示，用GFAP抗体染色 以鉴别活化星形胶质细胞的脊髓的横截面。图(a)和(b)来自仅用媒介 物处理的大鼠，分别放大5倍和20倍，而图(c)和(d)来自用100mg/kg DMF处理的大鼠，分别以放大5倍和20倍显示。
图3B显示使用Apeiro颜色反褶积的形态定量。
图3C显示大鼠脊髓横截面，其中指明腹灰质和白质区。这 些区被选出用于形态测定。图3D显示腹灰质和白质中阳性GFAP 染色的形态定量。
实施例3
这一实验显示，BG00012减少初级培养的星形胶质细胞的活 化。图4A显示在指示浓度的DMF刺激6小时和24小时之后，GFAP 表达的定量PCR分析。如图所示，DMF以浓度依赖性方式抑制 GFAP表达。
图4B显示在收集前4小时添加0、10和30ng/ml LPS的情 况下，在指示浓度的DMF刺激24小时之后，TNF表达的定量PCR 分析。如图所示，LPS以剂量依赖性方式诱导TNF表达，且所诱导 的TNF表达以剂量依赖性方式受DMF抑制。
图4C显示在指示浓度的DMF刺激6小时和24小时之后， NQO1表达的定量PCR分析。如图所示，DMF以浓度依赖性方式 诱导Nqo1表达。从所述数据还显而易见，与通过6小时暴露来诱 导相比，Nqo1通过暴露于DMF 24小时以更高水平来诱导。
最终，图4D显示，BG00012(DMF)或媒介物(DMSO) 处理星形胶质细胞24小时后，MTT测定的结果。所述数据表明， 星形胶质细胞活力不受BG00012处理损害。
实施例4
图5显示，BG00012抑制炎症细胞因子和由初级星形胶质细 胞的LPS刺激所诱导的促炎症信号发送。初级星形胶质细胞用如所 指示的0、10和100ng/ml的LPS处理，而且用如所指示的0、3、 10或30μM DMF处理。各基因在各条件下的表达的量值在0到1 的范围内，以致以颜色表示的差异表示各基因的表达随条件改变的 变化。最深的绿色表示无可检测到的表达(0)，而最鲜的红色表示 所述基因可测量到的最高表达(1)。一般来说，数据显示这些基因 的表达因LPS处理而增加，其中所有标志物均显示由100ng/ml LPS 处理诱导。许多标志物的诱导的表达受到DMF处理抑制。具体来 说，Ccl20、Ccl3、Ccl4、Cxcl1、Cxcl10、Cxcl2、Cxcl3、Cxcl6、 IL1a、II1b、Tnf、Ifit3、Nfkbia、Nfkbiz、Tnfaip2和Zc3h12a诱导 受到大幅抑制。
实施例5
这一实施例提供的数据表明DMF(BG00012)可抑制大鼠中 与慢性复发型EAE(crEAE)相关的星形胶质化和小胶质细胞活化。
crEAE通过皮内MOG/IFA免疫在Brown Norway大鼠中诱 发。BG00012在免疫后的头三天每日经口施用。BG00012在所有处 理组中降低疾病的平均临床得分。对于100mg/kg处理组，第28 天的平均疾病得分是0.71(n＝6，SD＝1.17)，而媒介物组是2.29(n＝6， SD＝1.29)。腰椎脊髓切面的免疫组织化学显示GFAP(用于活化的 星形胶质细胞的标志物)和IBA-1(用于活化的小胶质细胞的标志 物)的染色减少。
脊髓的mRNA的定量PCR揭示，与媒介物处理组相比， BG00012处理组的IBA-1和GFAP mRNA分别减少52％和54％。
BG00012对特异性星形胶质细胞和小胶质细胞的直接效应使 用初级大鼠星形胶质细胞和RAW264.7巨噬细胞细胞进行体外测 试。在BG00012存在的情况下的LPS刺激使得星形胶质细胞和巨 噬细胞中的TNF-a mRNA分别减少77％和59％。LPS刺激细胞的 全面基因表达概况显示，BG00012在两种细胞类型中均可抑制许多 促炎症基因产物。
这些研究结果表明，反应性胶质增生的抑制和巨噬细胞功能 的抑制可作为BG00012的双重消炎和CNS神经保护作用机制的一 部分对它的治疗性作用有贡献。
本文所报导的数据表明，BG00012抑制复发大鼠EAE中的疾 病。组织学分析已显示，BG00012处理的脊髓中的星形胶质细胞活 化标志物的水平降低。体外数据显示，BG00012可直接抑制星形胶 质细胞的活化。最终，促炎症基因表达在LPS刺激的初级星形胶质 细胞中在BG00012处理后减少。这些研究结果指出，BG00012在 抑制反应性胶质增生和双重消炎和CNS神经保护作用机制中的作 用。
实施例6
这一实施例分析MMF对培养的星形胶质细胞的作用。具体 地说，结果显示，MMF处理上调细胞还原电势，减少H2O2诱导的 Ca++运动，且减少H2O2诱导的细胞死亡。
人类脊髓星形胶质细胞的初级培养物通过滴定MMF或 DMSO作为稀释对照而处理24小时。与化合物一起培育24小时后， 用生长培养基洗涤细胞1次，且与细胞渗入型底物单氯二胺 (monochlorobimane)一起培育。当结合于谷胱甘肽时，这一底物 增强荧光。用MMF处理之后，观察到细胞谷胱甘肽水平有明显的 浓度依赖性增加。图6A。类似的MMF处理的细胞还与细胞渗入型 底物刃天青(resazurin)一起培育，其在经由细胞氧化还原机理还 原成试卤灵(resorufin)之后增强荧光，且用作细胞代谢活性的量 度(CellTiter-Blue测定)。这一测定证明与图6A中类似的结果：处 理的细胞还原所述底物的能力呈明显的MMF浓度依赖性增加。图 6B。为确保谷胱甘肽和代谢活性的增加不简单地归因于应答MMF 处理的细胞增殖，将平行的细胞器皿与钙黄绿素AM(calcein AM) 一起培育。细胞酯酶裂解这一分子以产生荧光代谢物，此提供细胞 活力的量度和相对的总细胞数目。未观察到实质的浓度依赖性变 化。图6C。综上所述，这些数据表明MMF处理上调培养的人类脊 髓星形胶质细胞的抗氧化剂反应，此可在氧化激发之后提供神经保 护益处。
在另一实验中，人类脊髓星形胶质细胞的初级培养物通过滴 定MMF或DMSO作为稀释对照而处理24小时。与化合物一起培 育24小时后，用HBSS洗涤细胞1次，且与Calcium4(Molecular  Devices)负荷染料一起培育。这一染料渗入细胞中且在结合游离的 细胞内Ca++之后增强荧光。细胞随后用50mM H2O2激发且监测荧 光的变化。图7A显示细胞的原始荧光迹线，表明MMF以剂量依 赖性方式降低细胞内Ca++的运动。图7B显示，荧光强度超过基线 的变化的定量(DRFU)，证明相对于背景水平(与无H2O2对照相 比)，30mM MMF减少Ca++的累积，且针对H2O2激发的保护是剂 量依赖性的。用非线性回归拟合这组数据揭示EC50＝5.4mM。图 7C。这些数据表明，MMF能够抑制细胞内Ca++的释放，此举可通 过阻止下游细胞凋亡级联的开始提供神经保护益处。
在另一实验中，人类脊髓星形胶质细胞的初级培养物通过滴 定MMF或DMSO作为稀释对照而处理24小时。与化合物一起培 育24小时后，用HBSS洗涤细胞1X次且用500mM H2O2激发2 小时，随后在正常生长培养基中洗涤，接着再培育24小时。图8A 显示，使用与图6中相同的钙黄绿素AM技术监测细胞活力的结果， 短暂的500mM H2O2处理，继之以24小时恢复期，观察到显著的 降低。活力的这一损失由MMF以浓度依赖性方式衰减。图8B显 示，关于细胞代谢观察到类似效应，如由底物刃天青的细胞依赖性 降低所测量。图8C显示，通过检查细胞ATP水平观察到稍微更适 度的MMF依赖性保护效应，但观察到明确的浓度依赖性反应。有 趣的是，MMF的最高浓度似乎降低细胞ATP水平。综上所述，这 些数据表明，MMF在人类脊髓星形胶质细胞中触发针对氧化应力 的神经保护性反应。
实施例7
从如上所示受处理的星形胶质细胞培养物制备总细胞溶解产 物。利用蛋白质印迹(Western blotting)检测Nrf2。包含GAPDH 作为管家蛋白对照。图9中所示的结果显示，DMF和MMF增加初 级大鼠和人类星形胶质细胞中的Nrf2的水平。
实施例8
DMF处理的星形胶质细胞中基因表达的全面分析使用 Affymetrix GeneChip技术进行。受DMF影响的基因被鉴别为与未 处理的星形胶质细胞相比，在DMF处理的细胞中水平显著(p<107) 增加的转录产物。所得基因列表使用Ingenuity IPA数据库注解。如 图10所示，DMF活化Nrf2靶基因(包含已知调控谷胱甘肽代谢的 基因)的表达。如图11所示，DMF对全面基因表达的调节表明对 与神经系统发育、功能和疾病有关的星形胶质细胞功能有影响。细 胞保护和谷胱甘肽代谢所涉及且这一测定中所鉴别的特定基因包 含但不限于Gsta2、Gsta3、Gclc、Ggt1、Txnrd1、Srxn1、Sqstm1 和Nqo1。
实施例9
如图12所示，DMF处理减少大鼠脊髓在EAE期间的髓鞘损 失。用Aperio软件进行EAE脊髓的形态测定分析。组织学变化用 Aperio Image Scope软件v10.1定量。使用颜色反褶积算法选择棕色 DAB染色(GFAP和IBA-1免疫染色)或亮翠蓝染色(Luxol Fast  Blue)的强度阈值。阳性染色由各强度阈值的强阳性染色像素的百 分比确定。每只大鼠定量三个腰椎脊髓切面，且对于最终强度值， 求取强阳性像素百分比值的平均值。