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1、(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201410626423.4 (22)申请日 2014.11.07 A61K 31/4748(2006.01) A61P 35/02(2006.01) (71)申请人 东南大学 地址 210096 江苏省南京市四牌楼 2 号 (72)发明人 陈宝安 王飞 程坚 李静 (74)专利代理机构 江苏永衡昭辉律师事务所 32250 代理人 王斌 (54) 发明名称 汉防己甲素作为制备白血病多药耐药逆转剂 的应用 (57) 摘要 本发明涉及汉防己甲素作为制备白血病多药 耐药逆转剂的应用。本发明将汉防己甲素配合蒽 环类化疗药物治疗耐药白血病， 汉防己。
2、甲素在低 浓度 （0.5mg/L-2.0mg/L）范围内， 可以增加柔红 霉素对耐药细胞的抑制作用， 而对敏感细胞抑制 作用变化不大， 其机制涉及汉防己甲素抑制多药 耐药基因 mdr-1 的扩增， 从而抑制细胞表面多药 耐药蛋白P-糖蛋白合成有关。 小剂量汉防己甲素 通过增强蒽环类化疗药物对耐药白血病的抑制作 用， 避免单用化疗药物所导致的严重毒副作用， 扩 大汉防己甲素的应用范围。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书4页 序列表3页 附图2页 (10)申请公布号 CN 104398515 A (43)申请公布日 2015。
3、.03.11 CN 104398515 A 1/1 页 2 1. 一种汉防己甲素作为制备白血病多药耐药逆转剂的应用。 2. 根据权利要求 1 所述一种汉防己甲素作为制备白血病耐药逆转剂的应用， 其特征在 于， 所述白血病治疗药物为蒽环类化疗药物。 3. 根据权利要求 1 所述汉防己甲素作为制备白血病多药耐药逆转剂的应用， 其特征在 于， 所述汉防己甲素的工作浓度为 0.5mg/L 至 2.0mg/L 之间。 权 利 要 求 书 CN 104398515 A 2 1/4 页 3 汉防己甲素作为制备白血病多药耐药逆转剂的应用 技术领域 0001 本发明属于生物医药技术领域， 涉及汉防己甲素作为白血。
4、病耐药逆转剂的应用。 背景技术 0002 近年来， 急性白血病的诱导缓解率日益提高， 但仍有20%40%的患者不能达到完 全缓解， 而多数缓解的患者又相继出现了复发， 多药耐药的发生是白血病患者复发的主要 原因。因而对临床多药耐药发生的预防与逆转已成为癌症治疗需要迫切解决的问题， 也是 人们研究的热点与难点领域。 0003 多药耐药性(multidrug resistance, MDR)是指抗某细胞毒药物的耐药细胞系接 触了一种或几种药物后， 不但对此药产生耐药性， 而且对许多结构上无关的和作用机制不 同的其它抗癌药物产生交叉耐药性。目前认为 MDR 是肿瘤细胞对化疗药物毒性损伤的最重 要的自。
5、我保护防御机制， 是肿瘤细胞耐药的常见形式， 也是白血病化疗失败和复发的主要 原因。MDR 作用机制多样并互相影响， 越来越多的证据表明， 过表达肿瘤细胞膜表面 ATP 依赖的药物外排泵 P- 糖蛋白 （P-glycoprotein, P-gp） 是多药耐药产生的主要机制之一。 很多化疗药物， 如蒽环类抗生素、 紫杉醇等都能够通过过度表达多药耐药基因 1 （multidrug resistance 1, mdr1） /P-gp 途径诱导肿瘤细胞耐药。因而， 有效的 Pgp 抑制剂可以抑制 Pgp 对肿瘤药物的外排作用， 逆转肿瘤多药耐药， 提高化疗效果。 0004 Pgp 抑制剂的研究发展迅速。
6、， 第一代 MDR 逆转剂主要包括钙离子通道阻滞剂、 蛋 白激酶 C 抑制剂、 免疫抑制药物及表面活化剂等， 它们在体外试验中， 可以部分甚至完全逆 转 MDR。但是， 它们无特异性作用靶点， 而且主要是通过竞争性作用来抑制细胞毒药物的泵 出， 这样就必然要增加这些逆转剂的药物浓度， 而这些剂量往往是已经超出了其在体内产 生毒性作用的最小剂量。第二代逆转剂主要包括右旋维拉帕米 (dexverapamil)、 右旋尼 古地平 （dexniguldipine） 、 环孢菌素类似物伐司朴达 （valspodar, PSC833） 和比立考达 （biricodar, VX2710） 等， 较第一代具有。
7、较低的毒副作用， 而逆转MDR的活性却明显增强， 但 它们对化疗药物药代动力学的影响成为临床应用的一个主要障碍。对部分病人来说， 化疗 药物的量可能是不足的， 但对另外一部分病人来说， 就可能已超过了最大耐受量。 到目前为 止， MDR 逆转剂经历了第一、 二代， 目前已发展到第三代。其中环孢菌素 D 衍生物 （PSC-833） 由瑞士诺华公司研制， 是迄今为止国际上第一个进入到临床随机试验的 P-gp 抑制剂， 但由 于 PSC-833 临床试验未见明显耐药逆转作用， 目前其上市进程已被全面叫停， 意味着目前 临床上 MDR 面临着无药可用的境地。因此， 继续寻找新型低毒高效的 MDR 逆转。
8、剂依然是目 前研发相关药物的主要方向。 0005 从传统中药中开发耐药逆转剂是我们的一大优势， 由于其低毒且源自天然植物 的特性， 逐渐成为 MDR 抑制剂的研发重点。但目前发现的大多数中药逆转剂疗效均较弱。 本课题组前期已进行大量实验对多种多药耐药逆转剂的不断筛选， 我们认为汉防己甲素 (tetrandrine, 简写 Tet, 分子式 C38H42N2O6， 分子量 622.75， CAS 号 518-34-3) 具有广阔的 实际应用前景。它是从千金藤属防己科植物粉防己的根中的提取的一种生物碱， 属双苄基 说 明 书 CN 104398515 A 3 2/4 页 4 异喹啉类化合物， 能有。
9、效逆转 Pgp 介导的多药耐药， 且 Tet 属于低毒类药物， 它们既无异 搏定等药的严重心血管毒性反应， 也无环孢霉素的严重毒性、 免疫抑制及过敏反应， 与抗肿 瘤药物合用也不影响它们的药代动力学， 因此是非常具有开发前景的第三代 MDR 逆转剂。 发明内容 0006 本发明所解决的技术问题是 ： 提供了汉防己甲素在逆转多药耐药白血病细胞上的 应用， 通过抑制肿瘤细胞膜表面 ATP 依赖的药物外排泵 P- 糖蛋白以及多药耐药基因 1 mdr1 的表达， 抑制 Pgp 对肿瘤药物的外排作用， 逆转肿瘤多药耐药， 提高化疗效果。 0007 为了解决上述技术问题， 本发明所采用的技术方案是 ： 提。
10、供一种汉防己甲素作为制备白血病多药耐药逆转剂的应用， 所述白血病治疗药物为 蒽环类化疗药物， 其中汉防己甲素的工作浓度为 0.5mg/L 至 2.0mg/L 之间。 0008 本发明的有益效果是 ： 与现有技术相比， 本发明的优点如下 ： 采用中药汉防己甲 素作为白血病耐药逆转剂， 利用汉防己甲素在逆转多药耐药白血病细胞上的应用， 汉防己 甲素在低浓度 （0.5mg/L-2.0mg/L） 范围内， 可以增加蒽环类化疗药物对耐药细胞的抑制作 用， 而对敏感细胞抑制作用变化不大， 其机制涉及汉防己甲素抑制多药耐药基因 mdr-1 的 扩增， 从而抑制细胞表面多药耐药蛋白 P- 糖蛋白合成， 最终有。
11、效的逆转肿瘤多药耐药， 提 高化疗效果。 附图说明 0009 图 1 左为不同浓度汉防己甲素联合柔红霉素在体外作用 K562 白血病细胞 48 小时 后细胞增殖情况变化， 右为不同浓度汉防己甲素联合柔红霉素在体外作用 K562/A02 白血 病耐药细胞 48 小时后细胞增殖情况变化。 0010 图 2 为汉防己甲素在体外作用白血病耐药细胞 48 小时后细胞表面 P- 糖蛋白 （P-gp） 表达变化。 0011 图 3 为汉防己甲素在体外作用白血病细胞与耐药细胞 48 小时后细胞 P-gp 编码基 因 mdr1 变化。 具体实施方式 0012 下面将结合说明书附图， 对本发明作进一步的说明。 0。
12、013 实施例 1:Tet 联合柔红霉素 （DNR） 体外对人慢性粒细胞白血病急性红白血病变细 胞株 K562 及其耐药株 K562/A02 增殖影响。 0014 所用汉防己甲素为商品化纯品 （纯度 98%） 。 0015 取对数生长期细胞， 接种于96孔板， 每孔含2104个细胞悬液160uL， 每张板加入 不同浓度汉防己甲素 （0mg/L、 0.5mg/L、 1.0mg/L、 2.0mg/L） 作用 l 小时， 再按所设梯度加入 不同浓度柔红霉素 ( 终浓度 50mg/L、 25mg/L、 12.5mg/L、 6.25mg/L、 3.125mg/L、 1.5625mg/L 和 0.7812。
13、5mg/L)， 每个柔红霉素浓度设 5 个复孔。另设不加逆转剂、 不加柔红霉素、 不加细 胞的对照组， 调整每孔体积均为 200uL。置于 37、 5的 C02培养箱孵育 48 小时后取出， 加 5mg/ml 的四甲基偶氮唑盐 （methyl thiazolyl tetrazolium， MTT） 20ul， 继续培养 4 小 说 明 书 CN 104398515 A 4 3/4 页 5 时时后， 于平板离心机上离心 10 分钟， 弃上清， 每孔加 100uL 二甲基亚砜溶解， 微量振荡器 混匀， 酶标仪上测定 570nm 处吸光度 (A)（图 1） 。 0016 计算细胞的生长抑制率 : 生。
14、长抑制率 ( )=(1- 试验孔 A/ 对照孔 A)100。根 据回归方程求出 IC50(DNR 的半数抑制量 )， 并计算逆转倍数 ： 逆转倍数 = 不加逆转剂时的 IC50/ 加逆转剂后的 IC50。 0017 结果显示， 汉防己甲素 （0mg/L、 0.5mg/L、 1.0mg/L、 2.0mg/L） 联合柔红霉素对 K562 细胞无明显的增效作用， 对 K562/A02 细胞有明显的逆转耐药作用， 且这种作用具有浓度依 赖性。不同浓度汉防己甲素对白血病细胞 K562 和耐药细胞 K562/A02 处理， 低浓度汉防己 甲素 （ 2mg/L） 可增强蒽环类化疗药物对白血病耐药细胞的抑制作。
15、用 ； 而单用化疗药物， 若要达到相同抑制作用， 则需要很高药物浓度， 这样会增加毒副作用。 0018 实 施 例 2 流 式 细 胞 术 检 测 白 血 病 耐 药 细 胞 K562/A02 表 面 P- 糖 蛋 白 （P-glycoprotein,P-gp） 表达 细胞分组加入所设浓度汉防己甲素 （0mg/L、 0.5mg/L、 1.0mg/L、 2.0mg/L） , 于 37、 5%CO2培养箱孵育 48 小时， 收集细胞。离心浓缩各实验组细胞 ( 每组细胞数为 1106个 )， 冷 PBS 液洗 3 次， 1500 转 / 分钟离心 5 分钟， 弃上清， 加入 P-gp 单抗 5l （。
16、标有荧光素 PE） 。 避光、 常温保存 20 分钟后加生理盐水洗 1 次， 1500 转 / 分钟离心 5 分钟， 弃上清， 加 0.5ml 生理盐水， 上流式细胞仪检测。 0019 结果显示， 汉防己甲素 （0mg/L、 0.5mg/L、 1.0mg/L、 2.0mg/L） 作用白血病耐药细胞 株K562/A02后， 流式细胞仪分析结果显示随着汉防己甲素浓度增大， 细胞表面P-gp表达逐 渐下降， 表明汉防己甲素能够抑制耐药蛋白 P-gp 的表达。 0020 实施例 3 半定量逆转录聚合酶链反应 (reverse transcript polymase chain reaction， RT。
17、-PCR) 方法检测多药耐药基因 1（multidrug resistance 1, mdr1） mRNA 表达 水平 取 K562/A02 细胞 ( 终浓度 2104mL， 每组 4mL)， 分组加入所设终浓度汉防己甲素 （0mg/L、 0.5mg/L、 1.0mg/L、 2.0mg/L） , 于 37、 5% 的 CO2培养箱中培养， 48 小时后收集 细胞。采用 TRIzol（invitrogen）一步法提取总 RNA， 按 RT-PCR 试剂盒 ( 大连宝生物工 程有限公司 ) 说明书进行操作扩增 mdr1 基因片段 （436bp） 以及 -actin 基因片段 （270 bp） ， 。
18、mdr1 上游引物 （SEQ ID NO:1） 5 -TGGTTTGATGTGCACGATGTTGGG-3 ; mdr1 下游引物 （SEQ ID NO:2） 5 -AGATCAGCAGGAAAGCAGCACCTA-3 ； -actin 上游引物 （SEQ ID NO:3） 5 -ACACTGTGCCCATCTACGAGGGG-3 ； -actin 下游引物 （SEQ ID NO:4） 5 -ATGATGAGTTGAA GGTAGTTTCGTGGAT-3 ； 逆转录反应条件 : 42 30 分钟 , 99 5 分钟 , 5 5 分钟 ; PCR 反应条件为 ： 变性 95 秒， 退火 55 秒。
19、， 延伸 72 秒， 循环 35 次。取扩增产物进行琼脂糖凝胶电 泳 , 扫描定量， 用凝胶分析软件得出 mdr1/-actin 比值 （图 3） 。 0021 结果显示， 汉防己甲素 （0mg/L、 0.5mg/L、 1.0mg/L、 2.0mg/L） 作用白血病耐药细胞 株 K562/A02 后， RT-PCR 结果显示随着汉防己甲素浓度的增加， mdr1 基因表达逐渐下降。表 明汉防己甲素可以从基因水平抑制耐药基因 mdr1 的表达。 0022 以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点。 本行业的技术 人员应该了解， 本发明不受上述实施例的限制， 上述实施例和说明书中描述。
20、的只是说明本 发明的原理， 在不脱离本发明精神和范围的前提下， 本发明还会有各种变化和改进， 这些变 说 明 书 CN 104398515 A 5 4/4 页 6 化和改进都落入要求保护的本发明范围内。 本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其 等效物界定。 说 明 书 CN 104398515 A 6 1/3 页 7 0001 0002 序 列 表 CN 104398515 A 7 2/3 页 8 0003 序 列 表 CN 104398515 A 8 3/3 页 9 序 列 表 CN 104398515 A 9 1/2 页 10 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 104398515 A 10 2/2 页 11 图 3 说 明 书 附 图 CN 104398515 A 11 。