具有部分加倍或完全加倍的基因组的栽培高粱植物及其应用.pdf

具有部分加倍或完全加倍的基因组的栽培高粱植物，当在相同的条件下生长时，至少与和所述基因组加倍的高粱植物同基因的二倍体高粱植物可育性相同。也提供产生和使用其的方法以及由其产生的产品。

权利要求书
1.  一种具有部分加倍或完全加倍的基因组的栽培高粱植物，当在相同的条件下生长时，至少与和所述基因组加倍的高粱植物同基因的二倍体高粱植物可育性相同。

2.  一种具有权利要求1所述的植物作为亲本祖先的杂种植物。

3.  一种具有部分加倍或完全加倍的基因组的杂种高粱植物。

4.  权利要求1、2或3所述的植物，是双色高粱(Sorghum bicolor)。

5.  一种包括权利要求1、2、3或4所述的植物的种植田地。

6.  一种包括权利要求1、2、3或4所述的植物的种子的播种田地。

7.  权利要求1、2、3或4所述的植物，是非转基因的。

8.  根据权利要求1或2所述的植物，其中，至少在所述具有部分加倍或完全加倍的基因组的所述栽培高粱植物的第三世代上表现所述可育性。

9.  根据权利要求1所述的植物，在相同的发育阶段和生长条件下，具有比所述二倍体高粱植物更厚的叶片。

10.  根据权利要求1所述的植物，在相同的发育阶段和生长条件下，具有比所述二倍体高粱植物更暗的叶片。

11.  根据权利要求1所述的植物，在相同的发育阶段和生长条件下，具有至少类似于所述二倍体高粱植物的每植物总谷粒数比率。

12.  根据权利要求1所述的植物，在相同的发育阶段和生长条件下，具有至少类似于所述二倍体高粱植物的平均粒重。

13.  根据权利要求1所述的植物，在相同的发育阶段和生长条件下，具有与所述二倍体高粱植物类似的或较低的植物总长度。

14.  根据权利要求1所述的植物，在相同的发育阶段和生长条件下，具有至少类似于所述二倍体高粱植物的每穗谷粒数。

15.  根据权利要求1所述的植物，在相同的发育阶段和生长条件下，具有至少类似于所述二倍体高粱植物的穗长度。

16.  根据权利要求1所述的植物，在相同的发育阶段和生长条件下，具有至少类似于所述二倍体高粱植物的穗宽度。

17.  根据权利要求1所述的植物，在相同的发育阶段和生长条件下，具有至少类似于所述二倍体高粱植物的茎宽度。

18.  根据权利要求1所述的植物，在相同的发育阶段和生长条件下，具有至少类似于所述二倍体高粱植物的旗叶长度。

19.  根据权利要求1所述的植物，在相同的发育阶段和生长条件下，具有至少类似于所述二倍体高粱植物的旗叶宽度。

20.  根据权利要求1所述的植物，在相同的发育阶段和生长条件下，具有至少类似于所述二倍体高粱植物的叶脉宽度。

21.  根据权利要求1所述的植物，在相同的发育阶段和生长条件下，具有类似于所述二倍体高粱植物的单位面积谷物产量。

22.  根据权利要求1所述的植物，在相同的发育阶段和生长条件下，具有至少类似于所述二倍体高粱植物的谷粒尺寸。

23.  根据权利要求1所述的植物，在相同的发育阶段和生长条件下，具有至少类似于所述二倍体高粱植物的谷物蛋白质含量。

24.  根据权利要求1所述的植物，在相同的发育阶段和生长条件下，具有至少类似于所述二倍体高粱植物的干物质重量。

25.  根据权利要求1所述的植物，在相同的发育阶段和生长条件下，具有至少类似于所述二倍体高粱植物的花粉粒尺寸。

26.  根据权利要求1所述的植物，其中，通过以下中的至少一项确定所述可育性：
每植物种子数；
配子可育性实验；和
乙酸胭脂红花粉染色。

27.  根据权利要求1所述的植物，是四倍体。

28.  根据权利要求1所述的植物，是六倍体。

29.  根据权利要求1所述的植物，能够与四倍体高粱杂交育种。

30.  一种权利要求1-29中任一项所述的高粱植物的植物部分。

31.  一种权利要求1-29中任一项所述的植物或植物部分的加工产品。

32.  根据权利要求31所述的加工产品，选自由食品、饲料、建筑材料和生物燃料组成的组。

33.  根据权利要求32所述的加工产品，其中，所述食品或饲料选自由面包、饼干、曲奇、蛋糕、甜点、小吃、早餐谷物食品、面粉、粥、糖浆、甜的调味品、汤、爆米花、蒸粗麦粉和酒精饮料组成的组。

34.  一种从权利要求1-29中任一项所述的植物或植物部分产生的膳食。

35.  权利要求30所述的植物部分，是种子。

36.  一种权利要求1-29中任一项所述的高粱植物的分离的可再生细胞。

37.  根据权利要求35所述的细胞，在培养中表现至少3次传代的基因组稳定性。

38.  根据权利要求36所述的细胞，来自分生组织、花粉、叶、根、根尖、花药、雌蕊、花、种子或茎。

39.  一种包括权利要求36或38所述的可再生细胞的组织培养物。

40.  一种生产高粱植物种子的方法，包括使权利要求1-29中任一项所述的植物自交或杂交。

41.  一种使用植物育种技术开发杂种植物的方法，所述方法包括使用权利要求1-29所述的植物作为用于自交育种和/或杂交育种的育种材料的来源。

42.  一种生产高粱植物膳食的方法，所述方法包括：
(a)收获权利要求1-29中任一项所述的高粱植物或植物部分的谷粒；和
(b)加工所述谷粒以生产所述高粱膳食。

43.  一种产生具有部分加倍或完全加倍的基因组的高粱植物种子的方法，所述方法包括在瞬时施加的磁场下使所述高粱植物种子与G2/M细胞周期抑制剂接触，从而产生所述具有部分加倍或完全加倍的基因组的高粱植物种子。

44.  根据权利要求43所述的方法，其中，所述G2/M细胞周期抑制剂包括微管聚合抑制剂。

45.  根据权利要求44所述的方法，其中，所述微管聚合抑制剂选自由秋水仙碱、诺考达唑、二苯基胺、氟乐灵和长春花碱硫酸盐组成的组。

46.  根据权利要求43所述的方法，进一步包括在与所述G2/M细胞周期抑制剂的所述接触之前，使所述种子经受引发步骤。

47.  根据权利要求43所述的方法，其中，所述引发步骤包括超声处理所述种子。

48.  一种具有部分加倍或完全加倍的基因组的栽培高粱植物的代表性的种子的样品，当在相同的条件下生长时，至少与和所述基因组加倍的高粱植物同基因的二倍体高粱植物可育性相同，其中所述样品在布达佩斯条约下以NCIMB42052(J-EP-D4)保藏于NCIMB。

49.  一种具有部分加倍或完全加倍的基因组的栽培高粱植物的代表性的种子的样品，当在相同的条件下生长时，至少与和所述基因组加倍的高粱植物同基因的二倍体高粱植物可育性相同，其中具有所述部分加倍或完全加倍的基因组的所述栽培高粱植物的所述样品在布达佩斯条约下以NCIMB42052(J-EP-D4)保藏于NCIMB。

说明书具有部分加倍或完全加倍的基因组的栽培高粱植物及其应用
技术领域
本发明在它的某些实施方式中，涉及具有部分加倍(倍增，multiplied)或完全加倍的基因组的栽培高粱植物及其应用。
背景技术
高粱是众多禾本种物种的属。该植物栽培在世界各地较暖的气候中。这些物种原产于除了西南太平洋和澳大利亚之外的所有大陆的热带和亚热带地区。高粱处于黍亚科(Panicoideae)及蜀黍族(tribe Andropogoneae)(大须芒草和甘蔗的族)。
一个物种，双色高粱(Sorghum bicolor)[Mutegi ET AL.2010"Ecogeographical distribution of wild,weedy and cultivated Sorghum bicolor (L.)Moench in Kenya:implications for conservation and crop-to-wild gene flow".Genetic Resources and Crop Evolution57(2):243–253]是重要的世界性农作物，用于食物(作为谷物和用于高粱糖浆或“高粱饴”)、饲料、生产酒精饮料，以及生物燃料。大部分种类耐旱并耐热，且是干旱区域特别重要的，在那些地方，谷物是贫穷者和乡村人的主食或主食之一。在很多热带地区，它们组成牧草的重要成分。高粱是美国种植的第二最重要的谷类-饲料谷物。由于高粱耐旱和耐热的能力，对在边缘降雨区域(marginal rainfall areas)运转的农场来说是经济上重要的。畜牧业和生物能源工业利用高粱作为能量基质从而使得它成为全能型农作物。
在世界各地，高粱是第五主要的谷类粮食。因为它耐旱并耐热，因此它无疑地是撒哈拉以南非洲(sub-Sahelian Africa)的半干旱地区和印度的干旱中部半岛地区最广泛地种植的粮食。同样地，高粱用于世界的最干燥地区的人类消耗，从而使得它成为这些地点的关键性的重要粮食作物。
高粱是用于燃料乙醇生产的玉米的极好的替换物，因为它更便宜且包含几乎一样的淀粉量。可以在其中不能栽种玉米的较干燥和较苛刻的土地中植物高粱。高粱在生物炼制(biorefineries)中的应用的缺点是与玉米相比较低的产量和它的相对较高的淀粉凝胶化温度以及降低的蛋白质和淀粉消化吸收率。
因此，植物育种家的持续目标是开发农学上有利的稳定高产的高粱杂交种。这个目标的原因是使在使用的土地上生产的谷物的量和为动物和人供应食物最大化。
直到最近，通过传统的植物育种方法和改进的栽培管理实践进行了针对高粱的关于农学和质量特性的遗传改良。组织培养和转化技术的进展使得产生包括高粱在内的所有主要谷类的转基因植物。迄今为止，这种转化的关键是用于将DNA递送进入细胞的显微粒子轰击装置(基因枪，microprojectile bombardment devices)的发展。显微粒子轰击包括谷类转化的两个主要的约束条件。这些约束条件是缺乏可用的天然载体如根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)和当将原生质体用于转化时再生植物的困难。显微粒子轰击可以靶向具有高形态发生潜能的组织或器官内的细胞。然而，使用显微粒子轰击作为转化载体具有其缺点。具体地，借助于轰击，经常将几个拷贝的待转化的基因整合到靶向基因组内。这些整合的拷贝经常被重排并突变。此外，由于插入点或方式仍然不是有效的过程，转化事件可能是不稳定的(Casas et al.(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:11212-11216)。
谷物高粱是二倍体，从野青茅(Arundinacea)的野生的非洲禾草高粱开发而来(Doggett and Majisu1968Disruptive selection in crop development.Heredity(23:1).)。野生的四倍体高粱如约翰逊草(Halepensia)中的约翰逊草(Johnson grass)的成功，以及野生种x栽培种杂交的哥伦布草(黑高粱，S.almum)的成功表明可以开发有用的四倍体栽培谷物高粱。
另外的背景技术包括：
美国专利号：US 7,745,602、US 6,750,376、US 5,811,636、US7,135,615、US 7,541,514、US 7,638,680。
Doggett and Majisu Euphytica1972:86-89；
Doggett1964Fertility improvement in autotetraploid sorghum:I cultivated autotetraploids,Heredity19:403；
Doggett1964Fertility improvement in autotetraploid sorghum:II.Sorghum almum derivatives Heredity19:543；
Tsvetova et al.1996ISMN37:66-67。
发明内容
根据本发明的某些实施方式的方面，提供了具有部分加倍或完全加倍的基因组的栽培高粱植物，当在相同的条件下生长时，至少与和所述基因组加倍的高粱植物同基因的二倍体高粱植物可育性相同(as fertile as)。
根据本发明的某些实施方式的一个方面，提供了具有部分加倍或完全加倍的基因组的高粱植物作为亲本祖先的杂种植物。
根据本发明的某些实施方式的一个方面，提供了具有部分加倍或完全加倍的基因组的杂种高粱植物。
根据本发明的某些实施方式，具有部分加倍或完全加倍的基因组的高粱植物是双色高粱(sorghum bicolor)。
根据本发明的某些实施方式的一个方面，提供了包括具有部分加倍或完全加倍的基因组的高粱植物的种植田地。
根据本发明的某些实施方式的一个方面，提供了包括具有部分加倍或完全加倍的基因组的高粱植物的种子的播种田地。
根据本发明的某些实施方式，具有部分加倍或完全加倍的基因组的高粱植物是非转基因的。
根据本发明的某些实施方式，至少在具有所述部分加倍或完全加倍的基因组的所述栽培高粱植物的第三世代上表现所述可育性(fertility)。
根据本发明的某些实施方式，在相同的发育阶段和生长条件下，具有部分加倍或完全加倍的基因组的高粱植物具有比所述二倍体高粱植物更厚(thicker)的叶片。
根据本发明的某些实施方式，在相同的发育阶段和生长条件下，具有部分加倍或完全加倍的基因组的高粱植物具有比所述二倍体高粱植物更暗的叶片。
根据本发明的某些实施方式，在相同的发育阶段和生长条件下，具有部分加倍或完全加倍的基因组的高粱植物具有至少类似于所述二倍体高粱植物的每植物总谷粒数比率(总谷粒数/植物比率，total grain number per plant ratio)。
根据本发明的某些实施方式，在相同的发育阶段和生长条件下，具有部分加倍或完全加倍的基因组的高粱植物具有至少类似于所述二倍体高粱植物的平均粒重(grain weight)。
根据本发明的某些实施方式，在相同的发育阶段和生长条件下，具有部分加倍或完全加倍的基因组的高粱植物具有与所述二倍体高粱植物类似的或较低的植物总长度(total plant length)。
根据本发明的某些实施方式，在相同的发育阶段和生长条件下，具有部分加倍或完全加倍的基因组的高粱植物具有至少类似于二倍体高粱植物的每穗谷粒数(a grain per panicle number)。
根据本发明的某些实施方式，在相同的发育阶段和生长条件下，具有部分加倍或完全加倍的基因组的高粱植物具有至少类似于二倍体高粱植物的穗长度(panicle length)。
根据本发明的某些实施方式，在相同的发育阶段和生长条件下，具有部分加倍或完全加倍的基因组的高粱植物具有至少类似于二倍体高粱植物的穗宽度(panicle width)。
根据本发明的某些实施方式，在相同的发育阶段和生长条件下，具有部分加倍或完全加倍的基因组的高粱植物具有至少类似于二倍体高粱植物的茎宽度(stem width)。
根据本发明的某些实施方式，在相同的发育阶段和生长条件下，具有部分加倍或完全加倍的基因组的高粱植物具有至少类似于二倍体高粱植物的旗叶长度(flag leaf length)。
根据本发明的某些实施方式，在相同的发育阶段和生长条件下，具有部分加倍或完全加倍的基因组的高粱植物具有至少类似于二倍体高粱植物的旗叶宽度(flag leaf width)。
根据本发明的某些实施方式，在相同的发育阶段和生长条件下，具有部分加倍或完全加倍的基因组的高粱植物具有至少类似于二倍体高粱植物的叶脉宽度(leaf vein width)。
根据本发明的某些实施方式，在相同的发育阶段和生长条件下，具有部分加倍或完全加倍的基因组的高粱植物具有类似于二倍体高粱植物的单位面积谷物产量(单位面积谷粒产量，grain yield per area)。
根据本发明的某些实施方式，在相同的发育阶段和生长条件下，具有部分加倍或完全加倍的基因组的高粱植物具有至少类似于二倍体高粱植物的谷粒尺寸(grain size)。
根据本发明的某些实施方式，在相同的发育阶段和生长条件下，具有部分加倍或完全加倍的基因组的高粱植物具有至少类似于二倍体高粱植物的谷物蛋白质含量(谷粒蛋白质含量，grain protein content)。
根据本发明的某些实施方式，在相同的发育阶段和生长条件下，具有部分加倍或完全加倍的基因组的高粱植物具有至少类似于二倍体高粱植物的干物质重量(dry matter weight)。
根据本发明的某些实施方式，在相同的发育阶段和生长条件下，具有部分加倍或完全加倍的基因组的高粱植物具有至少类似于二倍体高粱植物的花粉粒尺寸(pollen grain size)。
根据本发明的某些实施方式，通过下列中的至少一个确定所述可育性：
每植物种子数；
配子可育性试验；和
乙酸胭脂红花粉染色。
根据本发明的某些实施方式，植物是四倍体。
根据本发明的某些实施方式，植物是六倍体。
根据本发明的某些实施方式，植物能够与四倍体高粱杂交(cross-breeding)。
根据本发明的某些实施方式的方面，提供了具有部分加倍或完全加倍的基因组的高粱植物的植物部分。
根据本发明的某些实施方式的方面，提供了具有部分加倍或完全加倍的基因组的高粱植物或它的植物部分的加工产品。
根据本发明的某些实施方式，加工产品选自由食物、饲料、建筑材料和生物燃料组成的组。
根据本发明的某些实施方式，所述食物或饲料选自由面包、饼干、曲奇、蛋糕、甜点、小吃、早餐谷物食品、面粉、粥、糖浆、甜的调味品、汤、爆米花(popped kernels)、蒸粗麦粉和酒精饮料组成的组。
根据本发明的某些实施方式的方面，提供了从具有部分加倍或完全加倍的基因组的高粱植物的植物或植物部分产生的膳食(粉，meal)。
根据本发明的某些实施方式，植物部分是种子。
根据本发明的某些实施方式的方面，提供了具有部分加倍或完全加倍的基因组的高粱植物的分离的可再生的细胞。
根据本发明的某些实施方式，在培养中，细胞表现至少3次传代的基因组稳定性。
根据本发明的某些实施方式，细胞来自分生组织(meristem)、花粉、叶、根、根尖、花药、雌蕊、花、种子或茎。
根据本发明的某些实施方式的方面，提供了包括可再生的细胞的组织培养物。
根据本发明的某些实施方式的方面，提供了产生高粱植物种子的方法，包括使具有部分加倍或完全加倍的基因组的高粱植物自交或杂交。
根据本发明的某些实施方式的方面，提供了使用植物育种技术开发杂种植物的方法，方法包括使用具有部分加倍或完全加倍的基因组的高粱植物作为用于自交和/或杂交的育种材料的来源。
根据本发明的某些实施方式的一个方面，提供了产生高粱植物膳食(粉，meal)的方法，方法包括：
(a)收获具有部分加倍或完全加倍的基因组的高粱植物的谷物或植物部分；和
(b)加工所述谷物以产生高粱膳食(高粱粉)。
根据本发明的某些实施方式的一个方面，提供了产生具有部分加倍或完全加倍的基因组的高粱植物种子的方法，方法包括在瞬时施加的磁场下使高粱植物种子与G2/M细胞周期抑制剂接触，从而产生具有部分加倍或完全加倍的基因组的高粱植物种子。
根据本发明的某些实施方式，所述G2/M细胞周期抑制剂包括微管聚合抑制剂。
根据本发明的某些实施方式，所述微管聚合抑制剂选自由秋水仙碱、诺考达唑、黄草消(二苯基胺，oryzaline)、氟乐灵(trifluraline)和长春花碱硫酸盐组成的组。
根据本发明的某些实施方式，方法进一步包括在与所述G2/M细胞周期抑制剂的所述接触之前，使种子经受引发步骤(预激步骤，priming step)。
根据本发明的某些实施方式，所述引发步骤包括超声处理所述种子。
根据本发明的某些实施方式的方面，提供了具有部分加倍或完全加倍的基因组的栽培高粱植物的代表性的种子的样品，当在相同的条件下生长时，至少与和基因组加倍的高粱植物同基因的二倍高粱植物可育性相同，其中在布达佩斯条约下以NCIMB42052(J-EP-D4)将样品保藏于NCIMB。
根据本发明的某些实施方式的方面，提供了具有部分加倍或完全加倍的基因组的栽培高粱植物的代表性的种子的样品，当在相同的条件下生长时，至少与和基因组加倍的高粱植物同基因的二倍高粱植物可育性相同，其中在布达佩斯条约下以NCIMB42052(J-EP-D4)将具有部分加倍或完全加倍的基因组的栽培高粱植物的样品保藏于NCIMB。
除非另外限定，此处使用的所有的技术的和/或科学的术语具有与本发明从属的本领域的技术人员通常理解的相同的意义。尽管类似于或等同于此处描述的那些的方法和材料可用于本发明的实施方式的实践或测试， 但是下面描述典型的方法和/或材料。在冲突的情况下，以专利说明书(包括定义)为准。此外，材料、方法和实例仅是说明性的且不意在是必须为限制性的。
附图说明
此处参考附图，仅通过实例描述本发明的某些实施方式。现在详细地具体参考附图，强调的是显示的细节是通过实例的方式并且用于说明性的讨论本发明的实施方式的目的。关于这点，用附图进行的描述使得如何实践本发明的实施方式对本领域的技术人员可以是显而易见的。
在图中：
图1是示出与同基因的二倍体对照“AD”系相比的第三代(世代，generation)(D3)四倍体高粱种子“Ad(26)6D3”的照片。1000粒种子重量(种子千粒重，1000seeds weight)高于同基因的二倍体对照87.5％。
图2是示出与同基因的二倍体对照“AD”系相比的第三代(D3，记为“A、e、h和j”)四倍体高粱植物的照片。
图3是示出二倍体高粱“Ad”系的FACS分析的图。PI-A的左侧峰值是75(每一个刻度标记15个单元)。右侧峰代表细胞周期。
图4是示出四倍体高粱种子“A”系的FACS分析结果的图。PI-A峰的值是150，其证实DNA的量是对照的两倍(每一个刻度标记15个单位)。由于它的高值，细胞周期的峰缺失，其偏出了刻度。
图5是为了测试对照系和基因组加倍的(genomically multiplied)系的DNA含量而进行的FACS的图形表示。
图6A-图6B是示出RM系对照相对于(versus)根据本发明的某些实施方式另外产生的同基因的四倍体系的谷粒尺寸的照片。
图7A-图7B是示出SSR系对照相对于根据本发明的某些实施方式另外产生的同基因的四倍体系的谷粒尺寸的照片。
图8A-图8B是来自二倍体系、ER对照(图8A)和诱导的基因组加倍的系ER6(EPTM系，图8B)的花粉粒的显微镜图像。
具体实施方式
本发明在其某些实施方式中涉及具有部分加倍或完全加倍的基因组的栽培高粱植物和其应用。
在详细地解释本发明的至少一个实施方式之前，应该明白，在它的应用中，本发明不一定限于下面描述中阐明的或通过实施例例证的细节。本发明能够以不同的方式实践或实施其他实施方式。
植物育种家的持续目标是开发农学上有利的稳定高产的高粱杂交种。这个目标的原因是使在所使用的土地上生产的谷物的量和为动物和人类供应食物最大化。
以往数十年已经将表明诱导型多倍体用于增加高粱产量。然而，迄今为止，仅为少数表现出差的可育性的高粱物种成功实现诱导型多倍体。
现在，本发明人设计了用于在高粱中诱导的基因组加倍的新的步骤，产生基因上稳定的和可育(至少与和同基因的二倍体植物相同(祖先植物))的植物。诱导型多倍体植物没有不期望的基因组突变，并且特征是较暗、较厚的叶片和较大的种子。此外，多倍体植物示出在每植物产量、活力、可育性和生物量方面的增加。为此，本发明的某些实施方式的高粱植物被认为是比具有二倍体基因组的同基因的祖先植物更高的活力和产量的植物(参考下面的表2-表4)。这些新的性状可有助于较好的气候适应性和对生物和非生物逆境较高的耐受性。此外，由于杂种优势表达，具有本发明的诱导型多倍体植物的杂交高粱种子作为祖先亲本可以增加全球性高粱产量。此外，与基因组加倍之后来自早期世代(例如，第一、第二、第三或第四代)的同基因四倍体祖先植物相比，本发明的某些实施方式的诱导型多倍体植物表现出相似的或较好的可育性，消除对进一步育种以改善可育性的需要。
因此，根据本发明的一个方面，提供了具有部分加倍或完全加倍的基因组的栽培高粱植物，当在相同的条件下生长时，至少与和所述基因组加倍的高粱植物同基因的二倍高粱植物可育性相同。
如此处使用的，术语“高粱”是指属于禾本科家族的蜀黍族的高粱属。这些禾本种的特征是以穗的形式的花序和谷粒，成对生长(borne in pairs)的小穗和广泛地侧根。
如此处使用的，术语“同基因的(等基因的，isogenic)”是指具有基本上完全相同的基因型(例如，在个体之间不超过1个基因是不同的)的两个个体植物(或它们的部分，例如，种子，细胞)。
根据具体的实施方式，本发明的高粱物种(Sorghum sp.)是栽培高粱。如此处使用的，术语“栽培”是指由人类人工选择的驯化的高粱物种。本发明的某些实施方式的高粱物种(用于基因组加倍的遗传来源)本质上是二倍体的(n＝10)并且主要是自花授粉的。
根据本发明可使用下列高粱物种。
黑高粱(Sorghum almum)
阔叶高粱(Sorghum amplum)
狭叶高粱(Sorghum angustum)
芦苇状高粱(Sorghum arundinaceum)
短柄高粱(Sorghum brachypodum)
球茎高粱(Sorghum bulbosum)
缅甸高粱(Sorghum burmahicum)
Sorghum ecarinatum
Sorghum exstans
Sorghum grande
中间高粱(Sorghum interjectum)
Sorghum intrans
疏花高粱(Sorghum laxiflorum)
Sorghum leiocladum
Sorghum macrospermum
Sorghum matarankense
光高粱(Sorghum nitidum)
羽高粱(Sorghum plumosum)
拟高粱(Sorghum propinquum)
紫色高粱(Sorghum purpureosericeum)
Sorghum stipoideum
Sorghum timorense
糙毛高粱(Sorghum trichocladum)
多色高粱(Sorghum versicolor)
Sorghum verticiliflorum
扫帚高粱(Sorghum vulgare var.technicum)-帚高粱(Broomcorn)
根据具体的实施方式，栽培高粱是双色高粱(Sorghum bicolor)，也称为，双色高粱(L.)属，买罗高梁(milo)或买罗高梁蜀黍(milo-maize)、dura、大稷(great millet)、几内亚蜀黍(guinea corn)、卡菲尔蜀黍(kafir corn)、mtama，和蜀黍(jowar)，用于这个物种的其他参考包括栽培高粱，经常单独地称为高粱。根据具体的实施方式，双色高粱的类型是甜型(sweet-type)高粱(如以AD系举例说明)、谷物型(grain-type)高粱(如以RM和ER系举例说明)或青贮型(silage-type)(如以AT系举例说明)。
双色高粱是主要的栽培高粱物种。这些物种起源于北部非洲并且可以在旱境土壤中生长并且耐受持续的干旱。尽管已经开发了较矮并且较容易收获的品种(变异体，variety)，丛生的双色高粱以可达到超过四米高。谷粒(果仁(kernel)或种子)小，直径达到约3-4mm。典型地，种子是球形的，但是可以是不同的形状和大小；颜色从白色至红和褐色变化，并且包括淡黄色至深紫-褐色(FAO1995a,Sorghum and millets in human nutrition:Chapter1:Introduction.，其整体通过引用结合于此)。认识到高粱的不同类型包括红高粱、甜高粱、禾草高粱和帚高粱，根据本教导预期所有这些。根据具体的实施方式，高粱是红高粱或甜高粱。
在下文列出某些非限制性的商业品种的实例。
“Saccaline”
很可能从美国引入澳大利亚，但是认为起源于纳塔尔(Natal)。每株植物具有五至六个茎的、高的、直立的一年生植物；髓质实心(pith solid)，多汁并且甘甜。种子红褐色，椭圆形，约39 000粒/kg。叶片茂盛但是相当早期即枯萎，并且与cv.Sugar drip或cv.White African相比，该作物表现出稍微多梗(stemmy)外观。晚熟，在澳大利亚，在纬度27-30°S处80天开花而在纬度23-24°S处65天开花。其产生巨大的草料产量(50 000-70000kg/ha绿色物质)，成熟美味的；它成为极好的青贮饲料。
“Sumac”
从美国引入澳大利亚，其反过来从非洲获得它。比“Saccaline”稍矮，具有矮的、紧凑的穗和丰满的红褐色种子。它的成熟期约与cv.'Saccaline'相同。因为它的高度较低，它是比'Saccaline'稍微更容易收获的青贮饲料。
“Sugardrip”
从美国引入澳大利亚。类似于“Saccaline”，但是比其多叶。茎是多汁的并且非常甜。种子是棕色的并且小，顶部圆形的而底部尖形的(而不是椭圆形的，如“Saccaline”)。它是晚熟的，开花在“Saccaline”之后五至七天。它直立良好并且不像“Saccaline”和“Sumac”那样易倒伏。
“White African”
从美国引入澳大利亚，但是源自纳塔尔。比“Saccaline”更厚、更高且具有较强壮的茎，它分蘖较少，并且它的叶片间隔更宽。种子白色，约40 000粒/kg。萌发趋向低。晚熟，抗倒伏，比其他栽培品种更耐叶片疾病。它很好的进入冬季，但是它的汁不是那么甜。用于青贮饲料非常好。
“Early Orange”
由格拉夫顿农业研究站(Grafton Agricultural Research Station)从来自美国的称为“Kansas Orange”的品种开发。类似于cv.Saccaline，具有稍微更强壮的茎(但是不如“White African”或“Tracy”强壮)。穗中等紧凑；种子黄褐色，椭圆体，约40 000粒/kg。早熟型，适于晚播。在它的汁中具有比“Saccaline”更高的糖含量。
“Tracy”
在美国密西西比州开发用于制糖；引入新南威尔士州和昆士兰。在外表上，类似于“Saccaline”，但是与它的高度相比，叶片生长相当稀疏。穗小、直立、并且为圆柱形。种子黑红棕色并且比“Saccaline”的种子更暗；约40 000粒/kg。它是晚熟的，开花在“Saccaline”之后两周(约与“White African”同时)。它耐倒伏。茎是美味和多汁的，具有高的糖含量；它们保留它们的多汁性进入冬季。耐叶片疾病。
“植物”是指完整植物或其部分(例如，种子、茎、果实、叶片、花、组织等等)，加工的或未加工的[例如，种子、膳食、干组织、块(cake)等]、可再生的组织培养或由其分离的细胞。
根据某些实施方式，此处使用的术语植物也指作为至少一个它的祖先的具有一个诱导型多倍体植物的杂种，如下文进一步定义和解释的。
如此处使用的，“部分加倍或完全加倍的基因组”是指至少增加一个染色体(2n＝或大于21)，或至少一个完整的染色体组(n＝10)其产生三倍体植物(3n＝30)，或基因组的完全加倍，其产生四倍体植物(4N)或更多倍体。
此处也将本发明的基因组加倍的植物称为“诱导型多倍体”植物。
根据具体的实施方式，诱导型多倍体植物是3N。
根据具体的实施方式，诱导型多倍体植物是4N。
根据具体的实施方式，诱导型多倍体植物是5N。
根据具体的实施方式，诱导型多倍体植物是6N。
根据具体的实施方式，诱导型多倍体植物是7N。
根据具体的实施方式，诱导型多倍体植物是8N。
根据具体的实施方式，诱导型多倍体植物是9N。
根据具体的实施方式，诱导型多倍体植物是10N。
根据具体的实施方式，诱导型多倍体植物是11N。
根据具体的实施方式，诱导型多倍体植物是12N。
根据具体的实施方式，诱导型多倍体植物不是基因组加倍的单倍体植物。
如提到的，当在相同的(完全相同的)条件下生长并且在相同的(完全相同的)发育阶段时，诱导型多倍体至少是与和基因组加倍的高粱同基因的二倍体高粱祖先植物可育性相同的(例如，90％或更高)。根据具体的实施方式，已经在基因组加倍后3世代之后获得了这样的可育性水平，但是也可能已经在过程中表现，如在基因组加倍后的第一或第二世代上。这与现有技术同源四倍体高粱形成鲜明对比，其中只在轮回选择(recurrent selection)之后观察到更高的可育性水平(参考，例如，Doggett and Majisu 1972Euphytica21:86-89)。
如此处使用的，术语“可育性(可育，fertile)”是指有性繁殖的能力。可用本领域熟知的方法分析可育性。可替代地，将可育性定义为结籽的能力。可分析下列参数以确定可育性：种子(谷粒)的数量；可通过如在蔗糖基质上花粉萌发确定的配子可育性；以及可替代地或另外地通过乙酸胭脂红染色，从而将可育的花粉染色。
如此处使用的，术语“稳定的”或“基因组稳定性”是指经过几个世代(例如，3，5或10)，染色体或染色体拷贝的数目保持稳定，同时植物在至少下列参数方面不表现实质性下降：产量(例如，总种子重量/每植物或总的种子重量/面积单位)、可育性、生物量、活力。
根据具体的实施方式，将稳定性定义为产生纯种的后代，保持品种强壮并始终如一。
根据本发明的实施方式，基因组加倍的植物与来源植物(即，二倍体栽培高粱植物)是同基因的。基因组加倍的植物在性质上(in quality)而不在数量上与二倍体植物具有基本上相同的基因组组成。
根据具体的实施方式，在完整植物的培养或在完整植物的世代中表现至少2、3、5、10或更多次传代的基因组稳定性。
根据本发明的某些实施方式，成熟的基因组加倍的植物具有与在相同的条件下生长的它的同基因的二倍体祖先至少约相同的种子数(+/-10％)；可替代地或另外地，基因组加倍的植物具有通过乙酸胭脂红染色的至少90％可育的花粉；并且可替代地或另外，至少90％的种子在蔗糖上 萌发。根据本教导产生的四倍体植物具有比同基因的祖先植物高至少5％、10％、15％、20％或25％的总产量/植物。例如，在相同的条件下并且在相同的发育阶段，比同基因的二倍体植物高5-10％、1-10％、10-20％、10-100％或50-150％的产量。典型的实施方式是，比在相同的条件下生长的并且在相同的发育阶段的同基因的二倍体植物高10-50％的产量。根据具体的实施方式，用下列公式测量产量：
每植物产量＝总谷粒数/植物×粒重
典型地，当两者都是在相同的发育阶段和两者在相同的生长条件下生长时，与它的同基因祖先相比(在下文中，“二倍体祖先高粱植物”例如，“AD系”)进行用于表征本发明的基因组加倍的植物的特性(性状，trait)(例如，可育性、产量、生物量和活力)完成的比较分析。
根据具体的实施方式，基因组加倍的植物的特征是至少类似于相同发育阶段并且在相同的生长条件下生长的二倍体高粱同基因的祖先植物的穗数。根据具体的实施方式，穗数为高出(higher by)2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％或甚至超过15％或20％(例如，2-20％或10-20％)。根据具体的实施方式，基因组加倍的植物的特征是至少类似于相同的发育阶段并且在相同的生长条件下生长的二倍体高粱同基因祖先植物的穗长度。根据具体的实施方式，穗长度为高出2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％或甚至超过15％或20％(例如，2-20％或10-30％，参见表7)。
根据具体的实施方式，基因组加倍的植物的特征是至少类似于相同的发育阶段并且在相同的生长条件下生长的二倍体高粱同基因祖先植物的穗宽度。根据具体的实施方式，穗宽度为高出2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％或甚至超过15％或20％(例如，2-20％或10-30％，参见表8)。
根据具体的实施方式，基因组加倍的植物的特征是至少类似于相同的发育阶段并且在相同的生长条件下生长的二倍体高粱同基因祖先植物的茎宽度。根据具体的实施方式，茎宽度为高出2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或甚至100％(例如，10-70％、10-50％，参见表9)。
根据具体的实施方式，基因组加倍的植物的特征是至少类似于相同的发育阶段并且在相同的生长条件下生长的二倍体高粱同基因祖先植物的旗叶长度。根据具体的实施方式，旗叶长度为高出5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或甚至100％(例如，10-50％、10-20％，参见表10)。
根据具体的实施方式，基因组加倍的植物的特征是至少类似于相同的发育阶段并且在相同的生长条件下生长的二倍体高粱同基因祖先植物的旗叶宽度。根据具体的实施方式，旗叶宽度为高出5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或甚至100％(例如，10-60％、10-20％，参见表11)。
根据具体的实施方式，基因组加倍的植物的特征是至少类似于相同的发育阶段并且在相同的生长条件下生长的二倍体高粱同基因祖先植物的叶脉宽度。根据具体的实施方式，叶脉宽度高出2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或甚至100％(例如，10-70％、10-50％，参见表12)。
根据具体的实施方式，基因组加倍的植物的特征是至少类似于相同的发育阶段并且在相同的生长条件下生长的二倍体高粱同基因祖先植物的花粉粒尺寸(花粉粒大小、花粉粒粒径)。根据具体的实施方式，花粉粒尺寸为高出2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或甚至100％(例如，10-70％、10-50％，参见图8A-图8B)。
根据具体的实施方式，基因组加倍的植物的特征是至少类似于相同的发育阶段并且在相同的生长条件下生长的二倍体高粱同基因祖先植物的每植物总粒重(参见表3)。根据具体的实施方式，每植物总粒重高出(higherby)至少1.45倍、1.4-2倍或1.5-1.75倍。
根据具体的实施方式，基因组加倍的植物的特征是至少类似于相同的发育阶段并且在相同的生长条件下生长的二倍体高粱同基因祖先植物的粒重(参见表2)。根据具体的实施方式，粒重高出2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％或甚至超过15％、20％或50％。
根据具体的实施方式，基因组加倍的植物的特征是至少类似于相同的发育阶段并且在相同的生长条件下生长的二倍体高粱同基因祖先植物的谷粒尺寸(体积)。根据具体的实施方式，谷粒尺寸高出2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％或甚至15％、20％或50％。
根据具体的实施方式，基因组加倍的植物的特征是至少类似于相同的发育阶段并且在相同的生长条件下生长的二倍体高粱同基因祖先植物的干物质重量。根据具体的实施方式，干物质重量高出2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％或甚至超过15％、20％或50％。
根据具体的实施方式，基因组加倍的植物的特征是至少类似于相同的发育阶段并且在相同的生长条件下生长的二倍体高粱同基因祖先植物的每植物总谷粒数(参见表3)。根据具体的实施方式，每植物总谷粒数高出10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％或甚至超过80％或90％。
根据具体的实施方式，基因组加倍的植物的特征是至少类似于相同的发育阶段并且在相同的生长条件下生长的二倍体高粱同基因祖先植物的每穗总谷粒数(参见表6)。根据具体的实施方式，每穗总谷粒数比相同的发育阶段并且在相同的生长条件下生长的同基因祖先的高出10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％或甚至超过80％或90％(10-50％或10-30％)。
根据具体的实施方式，基因组加倍的植物的特征是至少类似于相同的发育阶段并且在相同的生长条件下生长的二倍体高粱同基因祖先植物的谷物蛋白质含量。根据具体的实施方式，谷物蛋白质含量比相同的发育阶段并且在相同的生长条件下生长的同基因祖先的高出或低出约0-20％。
根据具体的实施方式，基因组加倍的植物的特征是至少类似于相同的发育阶段并且在相同的生长条件下生长的二倍体高粱同基因祖先植物的每生长面积谷物产量。根据具体的实施方式，每生长面积谷物产量高出10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％或甚至超过80％、90％、100％、200％、250％、300％、400％或500％。根据具体的实施方式，每生长面积谷物产量比相同的发育阶段并且在相同的生长条件下生长的同基因祖先植物的高出0.1-5、0.3-5、0.4-2.5、1-5、2-3或2-2.5倍。
根据具体的实施方式，基因组加倍的植物的特征是至少类似于相同的发育阶段并且在相同的生长条件下生长的二倍体高粱同基因祖先植物的每植物谷物产量。根据具体的实施方式，每植物谷物产量高出5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％或甚至超过80％、90％、100％、200％、250％、300％、400％或500％。根据具体的实施方式，每植物谷物产量比相同的发育阶段并且在相同的生长条件下生长的同基因祖先植物的高出0.1-5倍、0.3-5倍、0.4-2.5倍、1-5倍、2-3倍或2-2.5倍。
根据具体的实施方式，基因组加倍的植物的特征是至少类似于相同的发育阶段并且在相同的生长条件下生长的二倍体高粱同基因祖先植物的花粉可育性(参见表4)。根据具体的实施方式，花粉可育性与二倍体同基因祖先80％、90％、95％或甚至100％相同。
有趣地是，本发明的植物特征是与相同的发育阶段并且在相同的生长条件下生长的二倍体高粱同基因祖先植物的类似的或甚至更高的地面上植物长度。根据具体的实施方式，植物长度高出2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％或甚至20％。
本发明的植物的特征是比与其同基因的二倍体栽培高粱植物的生物量、产量、谷物产量、每生长面积谷物产量、谷物蛋白质含量、粒重、干草产量、种子成形、染色体数、基因组组成、百分比油、活力、耐虫性、抗药性、耐旱性和抗逆性中的至少一个、两个、三个、四个或所有的更高。
应该明白，尽管诱导型多倍体植物的某个特性相对于同基因的祖先可能是较差(inferior)的，但其他(多个特性)可能是较优(superior)的，从而提供整体上更优的表型。
例如，诱导型多倍体系或杂交种可具有相对于同基因的祖先较差的种子重量，但是具有相对于同基因的祖先较优的种子重量/植物或种子重量/生长面积。
同样地，诱导型多倍体系或杂交种可具有相对于同基因的祖先较差的种子重量，但是具有相对于同基因的祖先较优的蛋白质含量。
根据具体的实施方式，基因组加倍的植物的特征是比相同的发育阶段并且在相同的生长条件下生长的二倍体高粱同基因祖先植物更厚的叶片。
根据具体的实施方式，基因组加倍的植物的特征是比相同的发育阶段并且在相同的生长条件下生长的二倍体高粱同基因祖先植物更暗的叶片。
根据具体的实施方式，基因组加倍的植物的特征是比相同的发育阶段并且在相同的生长条件下生长的二倍体高粱同基因祖先植物更高的每穗种子数。
根据具体的实施方式，基因组加倍的植物的特征是比相同的发育阶段并且在相同的生长条件下生长的二倍体高粱同基因祖先植物更长的穗长度。
根据具体的实施方式，基因组加倍的植物的特征是比相同的发育阶段并且在相同的生长条件下生长的二倍体高粱同基因祖先植物更宽的穗宽度。
根据具体的实施方式，基因组加倍的植物的特征是比相同的发育阶段并且在相同的生长条件下生长的二倍体高粱同基因祖先植物更宽的茎宽度。
根据具体的实施方式，基因组加倍的植物的特征是比相同的发育阶段并且在相同的生长条件下生长的二倍体高粱同基因祖先植物更长的旗叶长度。
根据具体的实施方式，基因组加倍的植物的特征是比相同的发育阶段并且在相同的生长条件下生长的二倍体高粱同基因祖先植物更宽的旗叶宽度。
根据具体的实施方式，基因组加倍的植物的特征是比相同的发育阶段并且在相同的生长条件下生长的二倍体高粱同基因祖先植物更宽的叶脉宽度。
根据具体的实施方式，植物是非转基因的。
根据另一个实施方式，例如，通过表达赋予用于栽培的农学上有益的特性如抗虫性或形态特性的异源(heterologous)基因，植物是转基因的。例如，亲本植物或诱导型多倍体植物可以表达与改进的营养价值或疾病耐受性相关的转基因。例如，显示高粱中的几丁质酶和脱乙酰几丁质酶转基 因表达赋予对炭疽病的抵抗(Kosambo-Ayoo et al.2011Af.J.Biotechnology10:3659-3670)。
在高粱中表达外源多核苷酸的方法是本领域中熟知的。这些方法包括农杆菌介导的转化和显微粒子轰击法。根据具体的实施方式，通过基于农杆菌的转化进行高粱转化，具有范围为从2.1％-4.5％的高转化效率(Gao et al.,2005Plant Biotechnol J.2005Nov；3(6):591-9；和Zhao Methods Mol Biol.2006；343:233-44.)。Girijashankar等人(2005)Plant Cell Rep.24(9):513-22报道了通过显微粒子轰击法芽尖(shoot apices)并产生转基因植物成功恢复的转基因高粱植物，具有1.5％的转化频率。
如下面描述的，可用改进的秋水仙碱化(colchicination)的方法产生本发明的基因组加倍的植物种子。
因此，根据本发明的一个方面，提供了产生具有部分加倍或完全加倍的基因组的高粱植物或植物部分(例如，种子)的方法，该方法包括在瞬时施加的磁场下，使高粱植物或它的部分(例如，种子)与G2/M细胞周期抑制剂接触，从而产生具有部分加倍或完全加倍的基因组的高粱。典型地，在加倍之前的高粱植物或它的部分(例如，种子)是二倍体且不是单倍体或双-单倍体。
在处理之前，使种子在NaCl:KNO3的存在下经受引发步骤。典型地，这个步骤持续12-48小时。典型地，当根的长度达到1cm时终止处理。
为了改进种子与处理溶液的渗透性，在与G2/M周期抑制剂接触之前，使种子经受超声处理(例如，40-50KHz10至20min)。
潮湿的种子可较好响应处理并因此在处理的开始时，将种子浸在水溶液(例如，蒸馏水)中。
根据具体的实施方式，整个处理在黑暗中且在室温(约22℃)或较低的温度[例如，用于超声(US)阶段]下进行。
因此，根据具体的实施方式，使种子在室温下浸在水中并随后使其在蒸馏水中经受US处理。
一旦渗透，将种子放置在含有处理溶液的容器内，并且接通磁场。
典型地，G2/M周期抑制剂包括微管聚合抑制剂。
微管周期抑制剂的实例包括但不限于：秋水仙碱、秋水仙胺、氟乐灵、黄草消(oryzalin)、苯并咪唑氨基甲酸盐(酯)(例如，诺考达唑、思考达唑(oncodazole)、甲苯咪唑、R17934、MBC)、O-异丙基N-苯基氨基甲酸盐(酯)、氯异丙基N-苯基氨基甲酸盐(酯)、甲基胺草磷、紫杉酚、长春花碱(vinblastine)、灰黄霉素、咖啡因、二-ANS、美登素、长春碱(vinbalstine)、长春花碱硫酸盐和足叶草毒素。
G2/M抑制剂包括在处理溶液中，其可包含另外的活性成分如抗氧化剂。下面列出可按照本教导使用的处理溶液的具体实例。
值得注意的，可在处理溶液中使用下列范围的微管聚合抑制剂和抗氧化剂。
微管聚合抑制剂-0.1％长春花碱硫酸盐、0.1-0.5mg/ml秋水仙碱、0.5％诺考达唑、0.002-0.005％黄草消或0.002-0.005％氟乐灵。
抗氧化剂-25-100ug/ml花青色素3-O-b-吡喃葡萄糖苷、10-6-10-4M黄芩黄素、10-6-10-4M槲皮黄铜或5-10mM奎诺二甲基丙烯酸酯(Trolox)。
可将DNA保护剂如组蛋白加入到溶液中。
处理溶液可进一步包含DMSO和洗涤剂。
如提到的，在用包含G2/M周期抑制剂的处理溶液处理高粱时，使植物进一步经受至少1000高斯的磁场(例如，1550高斯)约2hr。将种子放置在磁场腔中，如在实例1中描述的。在指示的时间之后，从磁场移除种子。在处理期间，温度不超过24℃。
一旦从磁场去除种子，用G2/M周期抑制剂使它们经受第二轮的处理。最后，仔细地洗涤种子以提高发芽率且在适当的生长床上播种。可选地，幼苗在AcadainTM(Acadian AgriTech)和Giberllon的存在下生长(当用长春花碱作为G2/M周期抑制剂处理时，使用后者)。
用上述教导，本发明人建立了基因组加倍的高粱植物。
一旦建立，可有性地或如可通过用组织培养技术无性地繁殖本发明的植物。
如此处使用的，短语“组织培养”是指由其可以产生高粱禾草的植物细胞或植物部分，包括植物原生质体、植物愈伤(plant cali)、植物块和植物中完整无缺的植物细胞，或植物的部分，如种子、叶片、茎、花粉、根、根尖、花药、胚珠、花瓣、花、胚、纤维和圆荚。
根据本发明的某些实施方式，在培养中，培养的细胞表现至少2、3、4、5、7、9或10代的基因组稳定性。
产生植物组织培养物和从组织培养再生植物的技术是本领域熟知的。例如，通过Vasil.,1984.Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants,Vol I,II,III,Laboratory Procedures and Their Applications,Academic Press,New York；Green et al.,1987.Plant Tissue and Cell Culture,Academic Press,New York；Weissbach and Weissbach.1989.Methods for Plant Molecular Biology,Academic Press；Gelvin et al.,1990,Plant Molecular Biology Manual,Kluwer Academic Publishers；Evans et al.,1983,Handbook of Plant Cell Culture,MacMillian Publishing Company,New York；和Klee et al.,1987.Ann.Rev.of Plant Phys.38:467 486阐明这样的技术。
可从选自由种子、叶片、茎、花粉、根、根尖、花药、胚珠、花瓣、花和胚组成的组的组织的细胞或原生质体产生组织培养物。
应该明白，本发明的植物也可以与其他高粱植物一起用于植物育种(即，自交育种和杂交育种)，如与栽培高粱或野生高粱一起以产生新的杂种植物或植物系，其表现本发明的高粱植物的至少某些特性。
从使这些中的任何一种与另外的植物杂交产生的植物可用于系谱育种(pedigree breeding)、转化和/或回交以产生另外的栽培品种，其表现本发明的基因组加倍的植物的特征和任何其他期望的特性。采用本领域熟知的分子或生物化学方案的筛选技术可用于确保，在每一个育种世代中保存寻求的重要的商业特征。
回交的目标是改变或替代轮回亲本系(recurrent parental line)中的单个特性或特征。为了完成这点，用来自非循环系的期望的基因取代或补充循环亲本系的单个基因，同时基本上保留所有剩余的期望的基因，和因此保留原始系的期望的生理学和形态学的组成。具体的非循环亲本的选择将取决于回交的目的。一个主要的目的是将某些商业上期望的、农学上重要 的特性加到植物中。精确的回交方案将取决于被改变的或添加的特征或特性，以确定适当的检测方案。尽管当被转移的特征是显性等位基因时回交方法被简化，但是也可转移隐性等位基因。在这种情况下，引入后代的检测以确定是否已经成功地转移期望的特征可能是必要的。同样地，可用本领域的技术人员熟知的多种建立的转化方法中中任一项将转基因引入到植物中，如上述描述的。
使用本教导，本发明人能够产生许多植物新品种，其是诱导型多倍体。已经于2012年9月14日在NCIMB42052之下，在布达佩斯条约之下将代表性的种子的样品保藏于NCIMB Ltd.(英国国家工业和海洋细菌保藏中心)。NCIMB42052相当于诱导型多倍体J-EP-D4(基因组加倍的AD系)。
应该明白，本发明的植物或杂交植物可以被遗传修饰，如，以引入感兴趣的特性，例如，对胁迫(例如，生物的或非生物的)增加的耐受。
因此，本发明提供新的基因组加倍的植物、杂交种、具有作为根据上述教导基因组加倍的高粱作为亲代祖先的杂交种和栽培品系(cultivars)，以及用于产生其的种子和组织培养物。
本发明的植物能够自交育种或与二倍体或四倍体高粱进行杂交育种。
因此，本发明进一步提供具有如此处描述的基因组加倍的植物作为亲本祖先的杂交植物。
例如，父本(male parent)可以是基因组加倍的植物而母本可以是二倍体高粱(4N×2N)。可替代地，可以杂交相同(例如，4N×4N，6N×6N)或不同(例如，6N×4N)倍性的两种诱导的基因组加倍的植物。
根据具体的实施方式，本发明提供了具有部分加倍或完全加倍的基因组的杂交高粱植物。
本发明进一步提供了包括至少10％、20％、50％或100％的本发明的植物或杂交植物的种子的种子袋。
本发明进一步提供包括本发明的任何植物(或种子)或杂交植物(或种子)的栽种或播种田地。
将本发明的谷物加工成用作食物或饲料(例如，家禽和家畜饲料)中的补充品的膳食。
因此，本发明进一步提供生产高粱膳食的方法，方法包括收获本发明的植物或杂交植物的谷物；和加工谷物以产生膳食。
在下文进一步描述根据本发明的某些实施方式预期的植物、它的部分和加工产品的具体的应用。
高粱谷物通常被用作用于牲畜饲料的玉米替换物，因为它们的营养价值非常相似。也种植禾草高粱用于牧草和干草。
已经开发了通常种植用于饲料的某些杂交植物以阻止鸟类，并且因此含有高浓度的鞣酸类和酚类化合物，其引起对另外的加工以使得谷物能够被牛消化的需要。这样的杂交植物可以是基因组加倍的受试者或可用于杂交种产生。
本发明的某些实施方式的高粱可用于产生食物如粥、面包、蒸粗麦粉、高粱面粉、糖浆、用于酿造的麦芽粉、饼干和蛋糕(FAO1995b；USGC2008)。脱壳的高粱提供大米的日渐增长的可替换物(FAO1995b)。
粑克日面包(Bhakri)，多种通常由高粱做成的未发酵面包，是印度的很多部分，如马哈拉施特拉邦和北部卡纳塔克邦的主食。
高粱膳食可以作为非常类似于半流质食物(pap)的硬的粥食用。在北部梭托族中被叫做马贝莱(mabele)而在英国被叫做褐粥(brown porridge)。可与maswi(酸奶)和merogo(煮沸的绿叶蔬菜的混合物，非常类似于羽衣甘蓝绿叶蔬菜或菠菜)一起供应粥。
可以生产高粱糖浆并且可用作甜味调味品，通常用于饼干、玉米面包、薄煎饼、热的谷类食品或烘豆。也可将其用作枫糖浆替代品。甜高粱糖浆可作为糖蜜类原料销售。
将未碾磨的谷物煮熟以制作蒸粗麦粉、粥、汤类和蛋糕。
本发明的某些实施方式的高粱可用于多种培养以产生酒精饮料。
在中国，高粱是用于生产蒸馏的酒水如茅台酒和高粱酒的最重要的原料。
在南部非洲，高粱被用于产生啤酒，包括吉尼斯黑啤酒(Guinness)的当地版本。酿造高粱啤酒的步骤是：麦芽制造、打浆、(可选地，酸处理)和酒精发酵。
高粱产品可作为“无谷(无麸质)蛋白”销售。
高粱也用作日用品和建筑材料。某些种类的高粱用于茅草屋顶、围墙、篮筐、刷子和扫帚，并且茎杆可用作燃料。高粱秸秆(茎杆纤维)也可做成用于房屋建筑的极好的壁纸(建筑用纸板，wall board)，以及生物可降解的包装。它不累积静电，因此，它可被用于用于灵敏性电子设备的包装材料。
本发明的某些实施方式的高粱也可用于产生生物燃料。应该明白，在某些情况下，以高粱汁液为基础的(sorghum-sap-based)乙醇具有以玉米为基础的乙醇4倍的能量产额；它与甘蔗在同等水平(on par with)。汁液可用于乙醇而谷物用于如上述描述的食物。
期望将在成熟自本申请的专利的存活期间开发很多相关的高粱品种、高粱产品和应用并且此处提供的术语的范畴意在先验地(a priori)包括所有的这些新技术。
如此处使用的，术语“约”指的是±10％。
术语“包含(comprises)”、“包含有(comprising)”、“包括(includes)”、“包括有(including)”、“具有(having)”和它们的变化意味着“包括但不限于”。
术语“由…组成”意味着“包括但限于”。
术语“基本上由…组成”意味着，组合物、方法或结构可包括另外的成分、步骤和/或部分，只要另外的成分、步骤和/或部分不实质地改变所要求的组合物、方法或结构的基本的和新的特征。
如此处使用的，单数形式“一个(a)”、“一种(an)”和“该(the)”包括复数指代，除非上下文另外明确地指出。例如，术语“化合物”或“至少一种化合物”可以包括多种化合物，包含其混合物。
遍及本申请，本发明的多个实施方式可存在于范围格式中。应该明白，范围格式的描述仅仅为了方便和简洁且不应该解释为对本发明的范围的 不可转变的限制。因此，范围的描述应该被认为具有具体地公开的所有可能的子范围，以及那个范围内的单个数值。例如，如从1至6的范围描述应该被认为具有具体地公开的子范围如从1至3、从1至4、从1至5、从2至4、从2至6、从3至6等，以及该范围内的单个数字，例如，1、2、3、4、5和6。该应用与范围的宽度无关。
每当此处指示数值范围时，它意味着，包括指示的范围内的任何引用的数字(分数或整数的)。此处可替代地使用短语“范围在第一指示数和第二指示数之间”和“范围为从第一指示数至第二指示数”且意味着包括第一指示数和第二指示数以及之间的所有的分数和整数。
如此处使用的，术语“方法”是指用于完成给定的任务的方式、手段、技术和方案，包括但不限于，由化学、药物学、生物学、生物化学和医学领域的从业者已知的，或容易地从已知的方式、手段、技术和方案发展来的那些方式、手段、技术和方案。
应该明白，也可在单一实施方式中组合地提供为了清楚起见而在单独的实施方式中描述的本发明的某些特征。相反地，也可分别地或以任何适当的亚组合或在本发明的任何其他描述的实施方式中适当的提供为了简洁起见而在单个的实施方式中描述的本发明的多个特征。在多个实施方式中描述的某些特征不应被认为是那些实施方式的必要特征，除非在没有那些要素的情况下该实施方式不起作用。
在下列实施例中发现上文描述的和下面权利要求中所要求保护的的本发明的多个实施方式和方面实验性支持。
实施例
现在参考下列实施例，连同上面的描述，其以非限制性方式说明本发明的一些实施方式。
通常，此处使用的命名法和本发明中用的实验室方案包括分子生物学、生物化学、微生物学的和重组DNA技术。在文献中充分地解释这样的技术。参见，例如，Molecular Cloning:A laboratory Manual"Sambrook et al.,(1989)；"Current Protocols in Molecular Biology"Volumes I-III Ausubel,R.M.,ed.(1994)；Ausubel et al.,"Current Protocols in Molecular Biology",John Wiley and Sons,Baltimore,Maryland(1989)；Perbal,"A Practical Guide to  Molecular Cloning",John Wiley&Sons,New York(1988)；Watson et al.,"Recombinant DNA",Scientific American Books,New York；Birren et al.(eds)"Genome Analysis:A Laboratory Manual Series",Vols.1-4,Cold Spring Harbor Laboratory Press,New York(1998)；如在美国专利号US 4,666,828；US 4,683,202；US 4,801,531；US 5,192,659和US 5,272,057中阐明的方法；"Cell Biology:A Laboratory Handbook",Volumes I-III Cellis,J.E.,ed.(1994)；"Current Protocols in Immunology"Volumes I-III Coligan J.E.,ed.(1994)；Stites et al.(eds),"Basic and Clinical Immunology"(8th Edition),Appleton&Lange,Norwalk,CT(1994)；Mishell and Shiigi(eds),"Selected Methods in Cellular Immunology",W.H.Freeman and Co.,New York(1980)；在专利和科学文献中全面地描述可用的免疫测定，参见，例如，美国专利号US 3,791,932；US 3,839,153；US 3,850,752；US 3,850,578；US 3,853,987；US 3,867,517；US 3,879,262；US 3,901,654；US 3,935,074；US 3,984,533；US 3,996,345；US 4,034,074；US 4,098,876；US 4,879,219；US 5,011,771和US 5,281,521；"Oligonucleotide Synthesis"Gait,M.J.,ed.(1984)；“Nucleic Acid Hybridization"Hames,B.D.,and Higgins S.J.,eds.(1985)；"Transcription and Translation"Hames,B.D.,and Higgins S.J.,Eds.(1984)；"Animal Cell Culture"Freshney,R.I.,ed.(1986)；"Immobilized Cells and Enzymes"IRL Press,(1986)；"A Practical Guide to Molecular Cloning"Perbal,B.,(1984)和"Methods in Enzymology"Vol.1-317,Academic Press；"PCR Protocols:A Guide To Methods And Applications",Academic Press,San Diego,CA(1990)；Marshak et al.,"Strategies for Protein Purification and Characterization-A Laboratory Course Manual"CSHL Press(1996)；其全部内容通过引用结合于此。遍及该文件提供其他一般引用。相信它们中的方案是本领域熟知的并且提供它们为了阅读者的方便。其中包括的所有的信息通过引用结合于此。
实施例1
多种遗传背景的多倍体高粱植物的产生和定性(GENERATION ANDQUALIFICATION)
材料和方法
高粱系
所检查的系是双色高粱(S.bicolor)的系。双色高粱是高粱的栽培品种，它的野生近缘种组成植物学属高粱。双色高粱通常被叫做高粱，并且也被称为durra、蜀黍(jowari)或买罗高粱(milo)，是为了它的谷物而栽培的禾本科物种，其用于动物和人类两者的食物(“ER”、“AD”、“RM”系)，和用于青贮饲料类型(此处被称为“SSR”系)。
基因组加倍方案
在基因组加倍之前，用打气的1:1NaCl:KNO3，8ds/m的溶液处理双色高粱(L)Moench的种子(此处称为“AD系”、“ER对照”、“RM对照”或“ST对照”)48小时。然后，用自来水洗涤种子并允许风干24小时。对于基因组加倍方案，使种子在22℃下在充满水的容器中浸泡2小时，转移到干净的网袋中且在22℃的温度下，插到蒸馏水充满的超声波浴中。其后，在低于24℃的温度下，进行超声处理15分钟。在22℃，将袋子放置到含有pH＝6的处理溶液的容器中，处理溶液包含0.5％DMSO、5滴/L TritonX100、微管聚合抑制剂、抗氧化剂、50μg/ml组蛋白。
值得注意的是下列范围的微管聚合抑制剂和抗氧化剂可用于处理溶液：
微管聚合抑制剂-0.1％长春花碱硫酸盐、0.1-0.5mg/ml秋水仙碱、0.002-0.005％氟乐灵。
抗氧化剂-25-50μg/ml花青色素3-O-b-吡喃葡萄糖苷，10-6-10-4M黄芩黄素、10-6-10-4M槲皮黄铜或5-10mM奎诺二甲基丙烯酸酯。
在磁场腔(参见，下文的“磁场腔”部分)内的容器的2小时孵育之后，从袋子中移除种子并且放置在塑料盘上的纸巾床的顶端，用第二层纸巾覆盖且在22℃下浸泡在处理溶液中另外的36小时(整个孵育期纸巾床保持潮湿)。收集种子且在干净的容器中用水(pH＝7)洗涤。所有的阶段均在黑暗中进行。
此后，将处理过的种子放置在含有补充有35ppm的20:20:20微量元素肥料(Micro Elements Fertilizer)的土壤的幼苗托盘中，并且用22-25℃的白天温度范围、12-14℃的夜晚范围和40％的最低湿度移到苗圃。当用长春花碱时，立即在播种之后应用1.5％GIBERLLON。在接下来的3周，包括用ACADIANTM每周两次的处理。
磁场腔(腔室)
磁场腔由彼此距离11cm的两个磁铁板组成。由两个磁铁产生的磁场是在它的中心溶液(central solution)中具有1550高斯的最小强度的圈形磁场(如在材料和方法中的“基因组加倍方案”下描述的)，且将浴盆插入到磁场腔中。
使用流式细胞术的倍性检查
由叶片制备用于流式细胞术的细胞核样品。在由9.15g MgCl2、8.8g柠檬酸钠、4.19g3-[吗啉代]丙烷磺酸、1ml Triton X-100、21.8g山梨醇/升组成的切片缓冲液中，用刀片切碎每个样品(1cm2)。通过23μm尼龙筛网过滤产生的浆体并且添加碘化丙啶(PI)至0.2mg/L的最终浓度。在冰上存储染色的样品并且通过流式细胞术分析。
流式细胞分析仪是FACSCalibur(BD Biosciences ltd.)。
育种者选择
基因组加倍方案(参见在材料和方法章节下的“基因组加倍方案”)应用在上述描述的遗传背景的双色高粱上。根据它们在田间的表型选择高倍性植物。包括多个参数的表型分析包括有叶片颜色、叶片厚度、种子颜色、种子大小。此后，FACS分析证实植物和它们的后代是稳定的高倍性的植物。植物如下自交；在小穗成熟之前(在柱头是可授性(receptive)的之前)，遮盖母本的花序。花序的遮盖确保了授粉是自花授粉。花是雌雄同体的(雄性和雌性)。自发地发生授粉。在成熟后收获种子。
可育性检验
从新开放的高粱花采集花粉。使花粉在含有20％蔗糖、3.9mM CaCl2和4.65mM硼酸的培养基中萌发。将花粉放置在显微镜载玻片上的萌发培养基中。在具有滤纸(mist filter paper)的有盖培养皿中孵育载玻片。使用显微镜记录萌发。从开始检测3小时和5小时的花粉萌发。
花粉粒尺寸分析
轻轻地研磨来自二倍体系、ER对照和诱导的四倍体EP-系(ER6)的高粱花粉粒并放置在玻璃载片上以检查花粉大小。在室温下用1％乙酸胭脂红的液滴染色花粉粒[Jahier et al.,1996Chevre,R.Delourme,F.Eber, A.M.Tanguy.1996.Techniques of plant cytogenetics.L.Anantharaman,Science Publishers,Lebanon,NH.；10g胭脂红1L乙酸水(45％乙酸)]。此后，将玻璃盖玻片轻轻地放置在玻璃载玻片上。乙酸胭脂红混合物均匀地展开。在复合显微镜下检查玻璃载玻片且×200放大。
结果
通过使雄性双色高粱的种子经受如上述描述的基因组加倍方案产生了四倍体高粱雄性植物。将加倍的种子称为D1。将种子放置在含有补充有肥料的土壤的幼苗托盘上并且使用上述指示的白天-夜晚温度范围和如上述描述的最小的湿度移到苗圃。
D1植物自交以产生稳定的四倍性D2植物。如下面表1，以及图3、图4和图5示出的，通过FACS分析证实多倍体植物的基因组稳定性。
分别地从植物收集花序。
播种D2的后代并通过FACS分析进行分析。所有的家族被证实为四倍体(表1以及图3和图4)。
通过D2植物的自交产生D3植物。通过FACS分析确定D3高粱种子的多倍性(表1和表5，图3、图4和图5)。
对AD-系证明的现有结果显示，与同基因的二倍体对照相比，多倍体高粱植物较暗，它们的叶片较厚并且它们的种子较大(图2)。与对照同基因的二倍体“AD”系相比，发现D3四倍体高粱种子在形状和大小上较大(图1)。
选择AD系的八个D3家族用于进一步的检查，包括收获产量和每植物花粉可育性(表1，表3-表5，图1-图4)。
与对照同基因二倍体植物相比，多倍体植物的作物产量(每植物总的种子重量)增加平均1.5倍(表4)。
本结果证明，多倍体植物具有与对照植物相等的花粉可育性(表5)。
表1：如由FACS分析证明的高粱种子的多倍性


Ad对照是用于基因组加倍的同基因二倍体系。每个植物家族是不同地成功地基因组加倍的花序(influence)的自交种子(self-seeds)。大部分家族来源于不同的成功地基因组加倍的植物。D2表示植物是在基因组加倍方案之后的第二世代。D3表示植物是在基因组加倍方案之后的第三世代。
表2：如由FACS分析证实的高粱种子的多倍性

ER对照是用于基因组加倍的同基因二倍体系。每个植物家族是不同地成功地基因组加倍的影响的自交种子。大部分家族来源于不同的成功地基因组加倍的植物。D2表示植物是基因组加倍方案之后的第二世代。
表3：与对照相比，多倍体高粱的种子粒重

表4：与对照植物相比，多倍体植物的作物产量


与同基因的二倍体对照植物相比，多倍体植物的作物产量增加平均1.5倍。
表5：多倍体植物和对照二倍体同基因系的花粉可育性

因此，本结果证明，诱导型多倍体AD-系具有与二倍体对照植物相等的花粉可育性。
在RM、ER和SSR系上进行进一步的分析。图6A-图6B和图7A-图7B分别示出双色高粱RM系和SSR系的谷粒尺寸，使用上述方案将其基因组加倍成四倍体。显然，在加倍的植物中，谷粒尺寸比在对照植物中大很多。
针对RM、ER和SSR加倍的系进行进一步的表型分析。在下面的表6-表12中示出结果。此处将多倍体系称为增强型多倍体(EPTM)系，同基因的二倍体系是对照。
表6：与对照相比，增强型多倍体(EPTM)高粱的每穗种子


表7：与对照相比，增强型多倍体(EPTM)高粱的穗长度

表8：与对照相比，增强型多倍体(EPTM)高粱的穗宽度

表9：与对照相比，增强型多倍体(EPTM)高粱的茎宽度

表10：与对照相比，增强型多倍体(EPTM)高粱的旗叶长度


表11：与对照相比，增强型多倍体(EPTM)高粱的旗叶宽度

表12：与对照相比，增强型多倍体(EPTM)高粱的叶脉宽度

因此，上述结果表明多倍体植物具有增加的每穗种子数以及更大的种子尺寸。也观察到更大的旗叶以及茎和穗尺寸。显著地，与二倍体对照植物相比增加的EPTM系的旗叶尺寸和叶脉宽度可以提示更高的光合作用潜能。
在图8A-图8B中示出通过复合显微镜的花粉大小分析，证明基因组加倍的系的花粉粒比同基因的祖先的那些更大。先前已经证明相对于它们的二倍体祖先，基因组加倍的直接的并且看起来似乎不变的表型结果是多倍体中较大的细胞大小(Stebbins,G.L et al.,1950Variation and evolution in plants.Columbia University Press,New York,New York,USA)。此外，增加的花粉粒尺寸例证了这个规律并且经常被用作对于多倍体的替代证据 (Nagel W.,1978Endopolyploidy and polyteny in differentiation and evolution:towards an understanding of quantitative and qualitative variation of nuclear DNA in ontogeny and phylogeny.North-Holland Publishing,New York,New York,USA)。本发现表明与对照系相比，增加的花粉细胞大小与EPTM系的更高的多倍性水平直接相关。
实施例2
使用本发明产生多倍体高粱的杂交系
使用上述开发和描述的4N系中的任一个与雌性Ad系、ER系、SSR系或RM系杂交产生奇数倍性(3N)F1杂种。为了增加杂种种子生产，改良4N雄性系以表达核可育性恢复子并且雌性包含细胞质雄性不育性。
结果
期望奇数倍性杂种在每单位面积总产量方面表现出数十个％增加的产量。
在下列方面中，与同基因2N杂种相比，期望杂种植物表现更宽的气候适应：
也期望在高或低的温度下较好的性能；在干旱条件下较好的性能；在高盐度土壤和咸水(brackish)下较好的性能；在奇数倍性杂种中增加的无融合生殖(apomixes)表达和因此在可能对授粉引起负作用的不利的气候条件下较好的产量稳定性。
尽管结合它的具体的实施方式描述了本发明，但是明显地，很多替代、修饰和变化对本领域技术人员而言将是显而易见的。因此，意在包括落入随附的权利要求的精神和宽的范围的所有这样的替代、修饰和变化。
在本说明书中提及的所有的出版物、专利和专利申请以它们的整体通过引用结合于，达到犹如每个单独的出版物、专利或专利申请特别地并且单独地指定为通过引用结合于此的程度。另外，对本申请中的任何参考文献的引用或识别不应该被解释为承认这样的参考文献可作为本发明的现有技术。就所使用标题来说，它们不应该被解释为必要地限制。


由受理局填写

由国际局填写