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1、(10)申请公布号 CN 104293845 A (43)申请公布日 2015.01.21 CN 104293845 A (21)申请号 201410478758.6 (22)申请日 2009.08.21 PCT/EP2008/061005 2008.08.22 EP 12/370,422 2009.02.12 US 200980141950.3 2009.08.21 C12P 13/12(2006.01) C12N 1/20(2006.01) C12N 1/21(2006.01) C12R 1/19(2006.01) (71)申请人 代谢探索者公司 地址 法国圣搏齐尔 (72)发明人 格维内。
2、尔 . 贝斯特尔 - 科雷 菲利普 . 索凯尔 雷纳 . 菲格 (74)专利代理机构 北京坤瑞律师事务所 11494 代理人 封新琴 (54) 发明名称 产生甲硫氨酸而不产生 N- 酰基甲硫氨酸 (57) 摘要 本发明涉及通过在包含碳源和硫源的适当培 养基中培养微生物产生甲硫氨酸或其衍生物的方 法。所述微生物和 / 或所述培养基和 / 或所述工 艺参数经修饰使得副产品N-酰基甲硫氨酸(NAM) 的累积减少。还要求保护从发酵培养基分离甲硫 氨酸或其衍生物。 (30)优先权数据 (62)分案原申请数据 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 21 页 序列表 6 页 (19)中华人民共。
3、和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书21页 序列表6页 (10)申请公布号 CN 104293845 A CN 104293845 A 1/1 页 2 1. 一种在发酵方法中产生甲硫氨酸或其前体的方法， 包括下述步骤 ： - 在包含碳源、 硫源和氮源的适当培养基中培养修饰的大肠杆菌菌株， 和 - 从培养基回收甲硫氨酸和 / 或其衍生物， 其中通过减弱所述微生物中由基因 yncA 编码的甲硫氨酸转酰基酶的表达， 使得 N- 乙 酰甲硫氨酸和 N- 丙酰甲硫氨酸的累积相对于未经修饰的大肠杆菌菌株减少。 2. 权利要求 1 的方法， 其中由选自下组的基因编码的其他甲硫氨酸。
4、转酰基酶的表达被 减弱 ： argA、 yjdJ、 yfaP、 yedL、 yjhQ 及其组合。 3. 权利要求 1 的方法， 其中 N- 乙酰甲硫氨酸和 N- 丙酰甲硫氨酸的产生还通过将选自 下组的至少一种天然或异源的 N- 酰基 -L- 氨基酸酰胺水解酶在大肠杆菌菌株中表达来减 少 ： a. 曲霉属 (Aspergillus)N- 酰基氨基酸酰基酶 b. 猪 N- 酰基氨基酸酰基酶 c. 由 argE 基因编码的乙酰鸟氨酸脱乙酰酶。 4. 权利要求 1 的方法， 其中 N- 乙酰甲硫氨酸和 N- 丙酰甲硫氨酸的产生还通过调适选 自下组的培养条件来减少 ： pH， 加氧和/或温度， 或通过将。
5、N-酰基氨基酸酰基酶添加入培养 基来减少。 5. 权利要求 1 的方法， 其中 N- 乙酰甲硫氨酸和 N- 丙酰甲硫氨酸的产生通过下述来减 少 ： a) 减弱编码甲硫氨酸 N- 酰基转移酶的基因 yncA 的表达， 和 b) 表达至少一种天然或异源的 N- 酰基甲硫氨酸脱酰基酶， 选自 ： a. 曲霉属 N- 酰基氨基酸酰基酶 b. 猪 N- 酰基氨基酸酰基酶 c. 由 argE 基因编码的乙酰鸟氨酸脱乙酰酶。 6.权利要求1的方法， 其中N-乙酰甲硫氨酸和N-丙酰甲硫氨酸产生通过如下来减少 ： 减弱编码甲硫氨酸N-酰基转移酶的基因yncA的表达， 并且调适选自pH， 加氧和/或温度的 工艺条。
6、件， 或将氨基酸酰基酶添加入培养基。 7.权利要求1的方法， 其中N-乙酰甲硫氨酸和N-丙酰甲硫氨酸产生通过如下来减少 ： - 减弱编码甲硫氨酸 N- 酰基转移酶的基因 yncA 的表达， 和 - 表达至少一种天然或异源的 N- 酰基甲硫氨酸酰基酶， 选自 ： a. 曲霉属 N- 酰基氨基酸酰基酶 b. 猪 N- 酰基氨基酸酰基酶 c. 由 argE 基因编码的乙酰鸟氨酸脱乙酰酶， 和 - 调适选自 pH， 加氧和 / 或温度的培养条件， 或将氨基酸酰基酶添加入培养基。 8. 权利要求 1 的方法， 其中使所述大肠杆菌菌株对于磷酸盐和 / 或钾受限制或饥饿。 9.一种大肠杆菌菌株， 包含权利要。
7、求1中所述的由基因yncA编码的甲硫氨酸转酰基酶 的表达的减弱。 10. 一种大肠杆菌菌株， 包含由基因 yncA 编码的甲硫氨酸转酰基酶的表达的减弱和至 少一种甲硫氨酸特异性氨基酰基酶的表达的增强。 权 利 要 求 书 CN 104293845 A 2 1/21 页 3 产生甲硫氨酸而不产生 N- 酰基甲硫氨酸 0001 本申请是基于申请日为 2009 年 8 月 21 日， 优先权日为 2008 年 8 月 22 日， 申请号 为200980141950.3(PCT/EP2009/060811)， 发明名称为 ：“产生甲硫氨酸而不产生N-酰基甲 硫氨酸” 的专利申请的分案申请。 技术领域 。
8、0002 本发明涉及通过在包含碳源和硫源的适当培养基中培养微生物产生甲硫氨酸或 其衍生物的方法。所述微生物和 / 或所述培养基和 / 或所述工艺参数经修饰使得副产物 N- 酰基甲硫氨酸 (NAM) 的积累减少。还要求保护从发酵培养基分离甲硫氨酸或其衍生物。 背景技术 0003 含硫化合物如半胱氨酸、 高半胱氨酸、 甲硫氨酸或 S- 腺苷甲硫氨酸对于细胞代谢 是至关重要的， 且其在工业上被产生用作食物或饲料添加剂和药物。 具体而言， 不能由动物 合成的甲硫氨酸 ( 一种必需氨基酸 ) 在许多人体机能中起重要作用。目前， D,L- 甲硫氨酸 是通过化学合成从丙烯醛、 甲硫醇和氰化氢产生的。石油衍生。
9、前体丙烯醛和甲硫醇的价格 增加连同甲硫氨酸的需求增加使得甲硫氨酸的微生物产生有吸引力。 0004 在许多微生物中的 L- 甲硫氨酸合成途径是公知的 ( 综述于 Figge RM(2006),ed Wendisch VF,Microbiol Monogr(5)Amino acid biosynthesis p164-185)。 大 肠 杆 菌 (E.coli) 和谷氨酸棒杆菌 (C.glutamicum) 甲硫氨酸生产株已描述于专利申请 WO2005/111202、 WO2007/077041、 WO2007/012078 和 WO2007/135188。 0005 通过发酵产生的甲硫氨酸需要从。
10、发酵液纯化。 甲硫氨酸的划算的纯化依赖于使发 酵液中的副产物的量最小化的生产株和生产方法。 “副产物” 来源于甲硫氨酸转化和 / 或降 解途径。具体而言， 这些产物是 S- 腺苷甲硫氨酸 (SAM)、 硫代甲基核糖和 N- 酰基甲硫氨酸 (NAM) 如 N- 乙酰甲硫氨酸和 N- 丙酰甲硫氨酸。如在专利申请 PCT/EP2007/060433 中所示， 大肠杆菌甲硫氨酸生产株产生 N- 乙酰甲硫氨酸。大肠杆菌还产生 N- 丙酰甲硫氨酸。 0006 NAM 的产生是不理想的， 因为其减少甲硫氨酸产量并使得甲硫氨酸纯化更加困难。 可通过在发酵运行最后添加 NAM 酰基酶将 NAM 转化为甲硫氨酸和。
11、乙酸， 但这极大地增加了 产物的成品。因此， 必需减少或消除 NAM 在发酵运行过程中的累积。这需要对导致 NAM 累 积的反应的良好理解。 0007 甲硫氨酸的 N 端乙酰化作为共翻译过程是真核生物中最常见的蛋白质修饰 之一。尽管如此， N 端乙酰化酶产生 N- 乙酰甲硫氨酸的可能性不大 ( 对于综述， 参见 Polevoda&Sherman 2000 JBC 275,47,pp 36479-36482)， 因为甲硫氨酸在甲硫氨酸产生细 菌中表现为作为游离氨基酸而乙酰化， 而在原核生物中作为共翻译过程的甲硫氨酸乙酰化 是罕见的 (Driessen 等 1985,CRC Crit.Rev.Bi。
12、ochem.18,281-325)。N- 乙酰甲硫氨酸最 可能是通过乙酰化游离 L- 甲硫氨酸获得的。已描述了可能能够乙酰化甲硫氨酸的 N- 乙 酰化酶。例如， ArgA 在大肠杆菌中编码 N- 乙酰谷氨酸合成酶 (Marvil & Leisinger 1977 JBC252,10pp.3295-3303)。 说 明 书 CN 104293845 A 3 2/21 页 4 0008 迄今为止， 尚未知有能够催化 N- 乙酰甲硫氨酸、 N- 丙酰甲硫氨酸或其它具有更长 酰基链的甲硫氨酸衍生物的生物合成产生的酶。因此， 主要的甲硫氨酸 -N- 酰基转移酶活 性的鉴定及其在甲硫氨酸产生微生物中的减弱。
13、对于减少 NAM 产生至关重要。 0009 NAM 累积还可通过将累积的 NAM 脱乙酰获得甲硫氨酸来减少。来自氨基酸的 N- 酰基基团的脱乙酰化已在细菌中得到阐明。例如， ArgE 编码的 N- 乙酰鸟氨酸脱乙 酰酶具有广谱底物， 并有效地将 N- 乙酰甲硫氨酸脱乙酰基 (Javid-Majd & Blanchard 2000 Biochemistry 39,1285-93)。因此， argE 或其它氨基酸脱乙酰酶如大鼠肾酰基酶 I(Giardina 等 2000 Eur.J.Biochem.267,6249-55)， 来自黑曲霉 (Aspergillus niger) 或 猪肾的氨基酸酰基。
14、酶 (Gentzen 等 .1980 Z.Naturforsch 35 c,544-50) 的过表达可减少 NAM 的累积。 0010 因为 NAM 输出至细胞外空间， 将 NAM 酰基酶输出至周质或细胞外空间可能是有利 的。 在大肠杆菌中已知几种输出系统允许输出至周质， 例如系统TAT和Sec(综述于Manting & Driessen 2000 Mol Microbiol 37,226-38,Choi & Lee 2004 Appl.Microbiol. Biotechnol.64,625-635)。通过 TAT 或 Sec 途径的输出需要特定信号肽的存在。如果有 利于输出至细胞外空间， 。
15、可将目标蛋白融合于通常输出至培养基的载体蛋白， 如 OmpF 或溶 血素 (Choi & Lee 2004 Appl.Microbiol.Biotechnol.64,625-635)。还可通过将所述蛋 白融合于自转运蛋白 (autotransporter protein) 的输出所需的蛋白域如来自淋病奈瑟 氏球菌 (N.gonorrhoeae) 的 IgA1 或来自大肠杆菌的 AIDA-I 来将其输出至培养基或展示 于细胞表面。还可将蛋白通过双伴侣途径 (two-partner pathway) 或噬菌体展示来输出 (Jacob-Dubuisson 等 2004 Biochim et Biop。
16、hys Act 1694 235-257,Jos & Meyer 2007 Microbiol and Molecul Biol Rev 71,600-19)。也显示工艺设计影响某些蛋白的输出 (Shokri 等 2003 Appl Microbiol Biotechnol 60,654-64)。 发明内容 0011 本申请人解决了减少甲硫氨酸产生菌株中副产物 N- 酰基甲硫氨酸 (NAM) 累积的 问题。 0012 本发明人鉴定出大肠杆菌中基因 yncA 编码主要的甲硫氨酸 N- 酰基转移酶活性 (MNAT)， 其催化甲硫氨酸至 NAM 的转化。 0013 本文中公开了修饰的微生物， 其呈现。
17、基因 yncA 的表达的减弱， 因此减少了 NAM 的 产生。 0014 本发明人还显示脱酰基酶如米曲霉 (Aspergillus oryzae) 氨基酸酰基酶或猪肾 氨基酸酰基酶 ( 其将 NAM 转化为甲硫氨酸 ) 的过表达导致 NAM 量的减少。优选地， 将所述 脱酰基酶输出至周质或进入细胞外空间。 0015 在另一个方面， 将培养条件适应于获得 NAM 产生和 / 或累积的减少。 0016 这三种减少 NAM 累积的手段可单独施用或组合施用来减少 NAM 的累积。 0017 葡萄糖用作模式底物， 而重组大肠杆菌作为模式生物， 但本发明并不限于这些特 征。 0018 因此， 本发明的目标。
18、是提供微生物， 其中主要 MNAT( 甲硫氨酸 N- 酰基转移酶 ) 编 码基因的表达已减弱， 优选相应的基因缺失和/或过表达同源或异源NAM脱酰基酶， 以减少 说 明 书 CN 104293845 A 4 3/21 页 5 NAM 的累积。 0019 该具有减少的 NAM 产生和 / 或累积的微生物显示甲硫氨酸产生 / 碳源得率的改 进。 0020 发明详述 0021 本发明涉及在发酵方法中产生甲硫氨酸、 其衍生物或前体的方法， 包括下述步 骤 ： 0022 - 在包含碳源、 硫源和氮源的适当培养基中培养修饰的微生物， 和 0023 - 从所述培养基回收甲硫氨酸和 / 或其衍生物， 0024。
19、 其中与未经修饰的微生物或方法相比， 所述微生物或方法经修饰而减少副产物 N- 酰基甲硫氨酸的累积。 0025 在本发明的一个具体方面， 其累积减少的 N- 酰基甲硫氨酸选自下组 ： N- 乙酰甲硫 氨酸、 N- 丙酰甲硫氨酸、 N- 丁酰甲硫氨酸及其组合。 0026 副产物 N- 酰基甲硫氨酸的累积可通过下述修饰至少之一获得 ： 0027 - 在微生物中减弱至少一种甲硫氨酸 N- 酰基转移酶 ( 即， 转酰基酶 ) 的表达， 和 / 或 0028 -在微生物中表达至少一种甲硫氨酸特异性氨基酰基酶(或增强其表达) ； 和/或 0029 - 变化培养条件如 pH、 加氧温度和 / 或将 NAM 。
20、酰基酶添加入培养基， 0030 及其组合。 0031 根据本发明术语 “培养” 、“发酵” 或 “发酵方法” 可互换使用， 表示细菌在含有简单 碳源的适当生长培养基上的生长。 0032 “适当培养基” 是适于微生物培养和生长的培养基。上述培养基在微生物发酵领域 是公知的， 取决于待培养的微生物。 0033 短语 “从培养基回收甲硫氨酸和 / 或其衍生物” 指回收甲硫氨酸以及可能的话 SAM 和 NAM 以及所有其它可能有用的衍生物的行为。 0034 术语 “微生物”指细菌、 酵母或真菌。优选地， 所述微生物选自肠杆菌科 (Enterobacteriaceae)、 芽孢杆菌科 (Bacillac。
21、eae)、 链霉菌科 (Streptomycetaceae) 和 棒杆菌科 (Corynebacteriaceae)。更优选地， 所述微生物是埃希氏菌属 (Escherichia)、 克雷伯氏菌属 (Klebsiella)、 泛菌属 (Pantoea)、 沙门氏菌属 (Salmonella) 或棒杆菌属 (Corynebacterium) 的菌种。甚至更优选地， 所述微生物是菌种大肠杆菌 (Escherichia coli) 或谷氨酸棒杆菌 (Corynebacterium glutamicum)。 0035 术语 “经修饰的微生物” 表示经遗传修饰的微生物， 修饰的目标是减少发酵液中 NAM。
22、 的累积。本领域技术人员知道如何调节具体基因的表达。通常的修饰包括用遗传元件 (genetic element) 转化微生物， 包括基因缺失、 基因替换、 启动子修饰和引入载体以供表 达异源基因。 0036 本发明人显示了NAM是通过甲硫氨酸的酰基化形成的， 并鉴定出基因yncA作为主 要的NAM产生酶。 也称作大肠杆菌基因b1448的yncA已在专利申请WO2001070776中提及。 其为由调节子 Mar 诱导的一组基因的一部分， 涉及多药抗性。 0037 氨基酸酰基酶 (EC 3.5.1.14)， 也称作脱乙酰酶， 催化酰基氨基酸的水解裂解以产 生游离氨基酸和对应于酰基剩余物的羧酸 (c。
23、arbonic acid)。更具体而言， N- 酰基甲硫氨 说 明 书 CN 104293845 A 5 4/21 页 6 酸酰基酶催化 NAM 至甲硫氨酸及其相应羧酸的反应。 0038 术语 “N- 酰基甲硫氨酸” 指 N- 甲酰甲硫氨酸、 N- 乙酰甲硫氨酸、 N- 丙酰甲硫氨酸、 N- 丁酰甲硫氨酸以及一般而言， 任何包含衍生自任何缺少羟基官能的羧酸的官能团的甲硫 氨酸衍生物。 0039 为了测量 N- 乙酰甲硫氨酸的累积， 在发酵液中使用折射分析 HPLC 使用 N- 乙酰甲 硫氨酸 (Sigma， Ref01310) 作为标准来确定 N- 乙酰甲硫氨酸的量。在发酵液中通过 GC-MS。
24、 使用 N- 乙酰甲硫氨酸作为标准来确定 N- 丙酰甲硫氨酸。 0040 NAM 累积应减少至少 20， 优选 50， 更优选 80且甚至更优选 95的在使用未 修饰的生物或在未修饰的方法中积累的量。 0041 根据本发明术语 “碳源” 表示任何本领域技术人员可用于支持微生物正常生长的 碳源， 其可为己糖 ( 如葡萄糖、 半乳糖或乳糖 )、 戊糖、 单糖、 二糖 ( 如蔗糖、 纤维二糖或麦芽 糖)、 寡糖、 糖蜜、 淀粉或其衍生物、 半纤维素、 甘油及其组合。 特别优选的碳源是葡萄糖。 另 一个优选的碳源是蔗糖。 0042 在本发明的一个具体实施方案中， 碳源来自可再生原料。可再生原料定义为某。
25、些 工业方法所需的原材料， 其可在短的间隔内以足够量再生以允许其转化为所需产物。 0043 术语氮源对应于铵盐或氨气。氮源以铵盐或氨 (ammoniac) 的形式供应。 0044 用于发酵产生 L- 甲硫氨酸、 其前体或自其衍生的化合物的硫源可为下述任 何硫源 ： 硫酸盐 (sulfate)、 硫代硫酸盐 (thiosulfate)、 硫化氢 (hydrogen sulfi de)、 连二硫酸盐 (dithionate)、 连二亚硫酸盐 (dithionite)、 亚硫酸盐 (sulfi te)、 甲硫醇 (methylmercaptan)、 二甲基二硫化物 (dimethyldisulfi 。
26、de) 或其组合。 0045 在本发明的一个优选实施方案中， 所述硫源是硫酸盐和 / 或硫代硫酸盐。 0046 发酵通常在具有适应于所用微生物的适当培养基的发酵罐中进行， 所述培养基含 有至少一种简单碳源， 若需要， 还含有用于产生代谢物的共底物。 0047 本领域技术人员能够限定用于本发明微生物的培养条件。具体而言， 细菌在 20 至55的温度， 优选在25至40的温度， 且最优选对于谷氨酸棒杆菌约30而对于大肠 杆菌约 37的温度进行发酵。 0048 作 为 用 于 大 肠 杆 菌 的 已 知 培 养 基 的 实 例， 所 述 培 养 基 可 与 M9 培 养 基 (Anderson,19。
27、46,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 32:120-128)、 M63 培 养 基 (Miller,1992 ； A Short Course in Bacterial Genetics:A Laboratory Manual and Handbook for Escherichia coli and Related Bacteria,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York)或如Schaefer等(1999)限定的培养基具有相同或相似的组成。 0049 作为用于谷氨酸棒杆菌的已知培养基的实例，。
28、 所述培养基可与 BMCG 培养基 (Liebl 等 ,1989,Appl.Microbiol.Biotechnol.32:205-210) 或如 Riedel 等 (2001,J.Mol. Microbiol.Biotechnol.3:573-583) 所述的培养基具有相同或相似的组成。 0050 在本发明的一个具体实施方案中， N- 酰基甲硫氨酸的产生通过减弱至少一种甲硫 氨酸转酰基酶来减少。甲硫氨酸转酰基酶也称为甲硫氨酸 N- 酰基转移酶 (MNAT)。argA 编 码具有推定的甲硫氨酸转乙酰酶活性的酶。本发明人已从具有 argA 缺失的大肠杆菌菌株 纯化了 MNAT 活性， 对该纯化蛋。
29、白进行了测序并显示所述纯化蛋白 YncA 具有 MNAT 活性 ( 专 利申请 PCT/EP2008/060999)。基因 yncA 的表达的减弱消除了大量的残留 MNAT 活性， 导致 说 明 书 CN 104293845 A 6 5/21 页 7 NAM 特别是化合物 N- 乙酰甲硫氨酸和 N- 丙酰甲硫氨酸的产生的极大减少。在本发明一个 优选实施方案中， YncA 完全从大肠杆菌基因组缺失。 0051 已鉴定了其它具有较低活性的 N- 酰基转移酶， 其使得当其减弱时能够获得减少 的 NAM 产生 ； 这些酶由下述基因编码 ： yjdJ、 yfaP、 yedL、 yjhQ。任何这些描述的甲。
30、硫氨酸 N- 酰基转移酶可单独或与其它组合减弱。 0052 根据本发明， 术语 “减弱基因” 或 “基因表达的减弱” 表示基因表达的部分或完全 抑制， 然后可称其为 “减弱的” 。该表达抑制可为基因表达的抑制， 基因表达所需的启动子 区域的插入或全部或部分缺失， 或由较弱的天然或人工启动子替换野生型启动子。优选 地， 基因减弱基本上是该基因的完全缺失， 其可由便于鉴定、 分离和纯化本发明的菌株的选 择性标记基因所替代。基因优选通过同源重组技术来失活 (Datsenko,K.A.& Wanner,B. L.(2000)“One-step inactivation of chromosomal g。
31、enes in Escherichia coli K-12 using PCR products” .Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97:6640-6645)。 0053 在本发明的另一个具体实施方案中， N- 酰基甲硫氨酸的累积可通过在微生物中表 达同源或异源甲硫氨酸特异性氨基酰基酶来减少， 如 ： 0054 曲霉属 (Aspergillus)N- 酰基氨基酸酰基酶 0055 猪 N- 酰基氨基酸酰基酶 0056 编码乙酰鸟氨酸脱乙酰酶的大肠杆菌 argE、 其也作用于 N- 乙酰甲硫氨酸。 0057 甲硫氨酸特异性氨基酰基酶的增加表达增加了 NAM 至甲硫氨酸的转化率， 同。
32、时产 生一分子的相应的羧酸如乙酸、 丙酸或丁酸。通过过表达基因 acs、 pta-ackA 或编码乙醛酸 支路的基因而利于消耗乙酸也是本发明的一部分。 0058 在该上下文中， 术语 “增强的” 或 “过表达的” 描述了由相应 DNA 编码的酶活性的 胞内活性的增加， 例如通过增加基因的拷贝数， 使用更强的启动子或使用具有增加活性的 等位基因， 以及可能地组合这些方法来进行。 0059 术语 “增加的表达” 、“增强的表达” 或 “过表达” 在本文中可互换使用， 并具有类似 含意。 0060 为了增加基因表达， 其在染色体上或染色体外编码。 在染色体上， 可具有通过本领 域专家已知的重组方法可。
33、引入基因组的一个或几个拷贝。 染色体外基因可由不同类型的质 粒携带， 其由于它们的复制起点不同因而其细胞中的拷贝数不同。其可作为 1-5 个拷贝， 约 20 个或多至 500 个拷贝存在， 对应于具有严格复制的低拷贝数质粒 (pSC101、 RK2)， 低拷贝 数质粒 (pACYC、 pRSF1010) 或高拷贝数质粒 (pSK bluescript II)。 0061 在本发明的一个优选实施方案中， 基因可使用具有不同强度的启动子表达， 其可 为诱导型的。 这些启动子可为同源的或异源的。 本领域技术人员知道何种启动子最为方便， 例如， 启动子 Ptrc、 Ptac、 Plac 或 启动子 c。
34、I 广为使用。 0062 酶 的 表 达 可 通 过 稳 定 化 或 脱 稳 定 化 其 相 应 的 信 使 RNA(Carrier 和 Keasling(1998)Biotechnol.Prog.15,58-64) 或蛋白 ( 例如 GST 标记， Amersham Biosciences) 的元件增强或减少。 0063 本发明还涉及含有根据本发明待增强的基因的一个或多个等位基因的微生物。 0064 所有用于转化微生物的技术， 以及用于增强本发明蛋白质产生的调节元件在本领 域是公知的， 并可从参考文献中获得， 包括申请人自己关于在多种微生物中生物合成途径 说 明 书 CN 104293845。
35、 A 7 6/21 页 8 修饰的专利申请， 包括 WO2008/052973、 WO2008/052595、 WO2008/040387、 WO2007/144346、 WO2007/141316、 WO2007/077041、 WO2007/017710、 WO2006/082254、 WO2006/082252、 WO2005/111202、 WO2005/073364、 WO2005/047498、 WO2004/076659， 其内容通过提述并入本 文。 0065 N- 酰基甲硫氨酸酰基酶在胞内空间 (intracellular space) 中表达， 并可留在胞 内空间内或输出至周。
36、质或输出至细胞外空间。 本领域专家能够鉴定出将所述蛋白靶向周质 的手段。输出还可基于将所述 N- 乙酰甲硫氨酸酰基酶融合于像 OmpF 的蛋白， 通过噬菌体 展示或通过蛋白输出系统如双伴侣途径或自主转运 (autotransport) 进行。在本发明的一 个优选实施方案中， 将NAM酰基酶输出至周质或胞外区室(excellular compartment)以避 免 NAM 和甲硫氨酸之间的无效循环。 0066 在本发明的另一个实施方案中， 发明人调适 (adapt) 发酵工艺的参数 ( 即培养条 件 ) 以减少 NAM 的产生。这是通过改变发酵液的 pH、 修饰加氧 (oxygenation)。
37、 或底物补料 参数来实现的。另一个选项是将 NAM 特异性酰基酶添加入培养基。 0067 在一个实施方案中， 发酵参数的改变并不包括使微生物对无机底物如磷酸盐、 钾、 镁饥饿。 0068 这三种调节 NAM 累积的手段可单独或与其它一种或两种手段组合使用。 0069 相应地， MNAT 活性的减弱是通过减弱下述基因的表达来获得的 ： yncA 和 / 或 argA 和 / 或 yjdJ、 yfaP、 yedL、 yjhQ， 这些基因编码具有甲硫氨酸 -N- 酰基转移酶活性的酶。该 减弱可与 N- 酰基 - 甲硫氨酸脱酰基酶如曲霉属 N- 氨基酸酰基酶、 猪 N- 氨基酸酰基酶或由 argE 基。
38、因编码的乙酰鸟氨酸脱乙酰酶的增加表达组合。 0070 类似地， 如上所述至少一种MNAT酶的减弱可与调适工艺参数如pH、 加氧、 温度和/ 或通过向发酵液添加 NAM 酰基酶相组合， 一起使得 NAM 累积减少。 0071 类似地， NAM 酰基酶的表达可与工艺的调适组合。两种手段的细节已如上所述。 0072 最后， 可组合所有三种手段 ： MNAT 活性的减弱， NAM 酰基酶的表达增加和调适工艺 条件。 0073 在本发明的说明书中， 使用大肠杆菌中对应基因的命名来识别基因和蛋白。 然而， 且除非另行指明， 根据本发明这些命名的使用具有更加一般的含意， 并涵盖其它生物更具 体而言其它微生物。
39、中所有的相应基因和蛋白。 0074 PFAM(比对和隐藏Markov模型的蛋白质家族数据库(protein families database of alignments and hidden Markov models) ； http:/www.sanger.ac.uk/Software/ Pfam/) 代表蛋白序列比对的大集合。每个 PFAM 使得能够显现多重比对、 发现蛋白质域、 评 价生物间的分布、 访问其它数据库并显现已知的蛋白结构。 0075 COG(蛋白质直向同源组的簇(clusters of orthologous groups of proteins) ； http:/www。
40、.ncbi.nlm.nih.gov/COG/) 是通过将来自代表主要系统发生系的完全测序的基 因组的蛋白序列相比较而获得的。每个 COG 根据至少三个系来限定， 其使得能够鉴定之前 保守的域。 0076 鉴定同源序列及其同源性百分比的手段对于本领域技术人员是公知的， 并包括 特别是 BLAST 程序， 其可从网站 http:/www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/ 用该网站所示 的缺省参数来使用。可使用例如程序 CLUSTALW(http:/www.ebi.ac.uk/clustalw/) 或 说 明 书 CN 104293845 A 8 7/21 页 9 MULTALIN(h。
41、ttp:/bioinfo.genotoul.fr/multalin/multalin.html) 用这些网站所示的缺 省参数来发掘 (exploit)( 例如比对 ) 获得的序列。 0077 使用 GenBank 给出的用于已知基因的参照， 本领域技术人员能够确定其它生物、 细菌菌株、 酵母、 真菌、 哺乳动物、 植物等中的等同基因。 该常规工作是使用通过与来源于其 它微生物的基因进行序列比对， 并涉及简并探针克隆另一种生物中相应基因而确定的共同 序列来有利地进行的。这些分子生物学常规方法对于本领域技术人员是公知的， 并记载于 例如Sambrook等(1989 Molecular Clonin。
42、g:a Laboratory Manual.第2版.Cold Spring Harbor Lab.,Cold Spring Harbor,New York.)。 0078 本发明还涉及如上所述的微生物。具有 N- 酰基甲硫氨酸的累积和 / 或产生减少 的微生物对于高产量地产生甲硫氨酸是特别有用的。优选地， 本发明的微生物在用于本发 明的方法之前已经是甲硫氨酸的高生产者 (high-producer)。 0079 甲硫氨酸的有效产生需要优化甲硫氨酸特异性途径和几种提供前体的途径。 甲硫 氨酸生产株已描述于专利申请 WO 2005/111202、 WO2007/077041 和 PCT/EP200。
43、7/060433， 并 通过提述并入本文。 0080 过表达对其抑制剂 SAM 和甲硫氨酸具有减少的反馈敏感度的高丝氨酸琥珀酰转 移酶等位基因的甲硫氨酸生产株描述于专利申请 WO 2005/111202。该申请还描述了这些 等位基因与甲硫氨酸阻抑物 MetJ(GenBank 1790373) 的缺失的组合， MetJ 如专利申请 JP 2000/157267 中所示负责甲硫氨酸调节子的下调。此外， 两种修饰与过表达天冬氨酸激酶 / 高丝氨酸脱氢酶的组合描述于专利申请 WO 2005/111202。 0081 WO 2007/077041 中表明了基因 cysE、 metH 和 metF 的过表。
44、达。 0082 如专利申请 WO 2004/076659( 其通过提述并入本文 ) 所述， 甲硫氨酸的产生还可 通过使用优选或排他地使用 H2S 并因此从 O- 琥珀酰高丝氨酸脱氢酶产生高丝氨酸的改变 的 metB 等位基因来增加。 0083 甲硫氨酸产生的进一步增加还可如专利申请 PCT/EP2007/060433 中所述通过缺 失基因 pykA、 pykF 和 / 或 purU 来获得。该申请还描述了其中操纵子 cysPUWAM、 cysJIH 和 gcvTHP 以及基因 serA、 serB、 serC、 lpd 和 glyA 过表达的甲硫氨酸生产株。 0084 在大肠杆菌中， 可增加其。
45、它酶的活性以增加甲硫氨酸的产生 ( 之后为其登录号和 相应多肽的功能 ) ： 0085 可增加这些涉及硫同化的基因的表达 ： 0086 说 明 书 CN 104293845 A 9 8/21 页 10 0087 可通过表达下述来增强添补反应 (anaplerotic reaction) ： 0088 ppc 1790393 磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶 0089 pps 1787994 磷酸烯醇式丙酮酸合酶 0090 可通过过表达下述来增强乙酸消耗反应 ： 0091 acs 1790505 乙酰 CoA 合成酶 0092 此外， 可减弱降解甲硫氨酸途径 ( 参加下述列表 ) 中或从甲硫氨酸产生途径偏。
46、离 的基因的表达或将所述基因缺失。 0093 在该上下文中， 减弱描述了通过方法如减少其表达、 减少酶稳定性、 增加其降解和 / 或其它本领域专家已知的方案来减少酶的胞内活性。 0094 说 明 书 CN 104293845 A 10 9/21 页 11 0095 本发明还涉及用于产生 L- 甲硫氨酸、 其前体或其衍生化合物的方法， 包括发酵上 述产生甲硫氨酸的微生物， 浓缩甲硫氨酸、 其前体或衍生物以及分离发酵液中的所需产物。 说 明 书 CN 104293845 A 11 10/21 页 12 0096 本领域技术人员能够限定用于本发明的微生物的培养条件。 具体而言细菌在20 至55， 优。
47、选25至40， 特别是对于谷氨酸棒杆菌约30而对于大肠杆菌约37的温度 发酵。 0097 发酵通常是在发酵罐中用适应于所用细菌的已知限定组成的无机培养基已经进 行， 包含至少一种简单碳源， 以及若需要， 还包含产生代谢物所需的共底物。 0098 具体而言， 用于大肠杆菌的无机培养基可与 M9 培养基 (Anderson,1946,Proc. Natl.Acad.Sci.USA 32:120-128)、 M63 培养基 (Miller,1992 ； A Short Course in Bacterial Genetics:A Laboratory Manual and Handbook for 。
48、Escherichia coli and Related Bacteria,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York) 或如 Schaefer 等 (1999) 限定的培养基具有相同或相似的组成。 0099 类似地， 用于谷氨酸棒杆菌的无机培养基可与BMCG培养基(Liebl等,1989,Appl. Microbiol.Biotechnol.32:205-210) 或 如 Riedel 等 所 述 的 培 养 基 (2001,J.Mol. Microbiol.Biotechnol.3:573-583) 具有相。
49、同或相似的组成。可补充培养基以补偿由突变 引入的营养缺陷型 (auxotrophies)。 0100 在发酵之后， 回收并 ( 若需要的话 ) 纯化 L- 甲硫氨酸， 其前体或其来源的化合物。 在培养基中用于回收和纯化产生的化合物如甲硫氨酸的方法对于本领域技术人员而言是 公知的。 0101 任选地， 可在纯化发酵产物过程中消除0至100， 优选至少90， 更优选95， 甚 至更优选至少 99的生物质。 0102 在本发明的一个优选实施方案中， 用于产生甲硫氨酸的方法包括分离发酵液中所 需的氨基酸 / 组分和 / 或任选地以部分或总量 (0-100 ) 残留于终产物中的生物质的步骤。 0103 减少 NAM 量的手段可与对磷酸盐和 / 或钾的限制或饥饿组合。本领域专家能够确 定所选生物生长所需的磷酸盐或钾的量。。