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1、(10)申请公布号 CN 104293699 A (43)申请公布日 2015.01.21 CN 104293699 A (21)申请号 201410480097.0 (22)申请日 2014.09.17 CGMCC No.9781 2014.08.29 C12N 1/20(2006.01) A23C 9/12(2006.01) C12R 1/46(2006.01) (71)申请人 山东大学 地址 250100 山东省济南市历城区山大南路 27 号 (72)发明人 孔健 郭婷婷 王婷 高晓彤 (74)专利代理机构 济南圣达知识产权代理有限 公司 37221 代理人 李健康 (54) 发明名称 。
2、一株具有 - 氨基丁酸和谷胱甘肽合成能力 的嗜热链球菌及其应用 (57) 摘要 本发明公开了一株具有 - 氨基丁酸和谷胱 甘肽合成能力的嗜热链球菌， 该菌株命名为嗜热 链球菌(Streptococcus thermophilus)ST1， 已于 2014 年 8 月 29 日保藏于 “中国微生物菌种保藏管 理委员会普通微生物中心” ， 其保藏编号为 CGMCC No.9781。 本发明还公开了所述的嗜热链球菌在发 酵生产功能性乳制品中的应用。 (83)生物保藏信息 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 5 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书。
3、1页 说明书5页 (10)申请公布号 CN 104293699 A CN 104293699 A 1/1 页 2 1. 一株具有 - 氨基丁酸和谷胱甘肽合成能力的嗜热链球菌， 其特征在于 ： 所述菌株 命名为嗜热链球菌 (Streptococcus thermophilus)ST1， 已于 2014 年 8 月 29 日保藏于 “中 国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心” ， 其保藏编号为 CGMCC No.9781。 2.权利要求1所述具有-氨基丁酸和谷胱甘肽合成能力的嗜热链球菌在发酵生产功 能性乳制品中的应用。 权 利 要 求 书 CN 104293699 A 2 1/5 页 3 一株。
4、具有 - 氨基丁酸和谷胱甘肽合成能力的嗜热链球菌 及其应用 技术领域 0001 本发明属于生物技术领域， 涉及一株具有 - 氨基丁酸和谷胱甘肽合成能力的嗜 热链球菌及其应用。 背景技术 0002 嗜热链球菌是重要的发酵剂菌株， 与德氏乳杆菌保加利亚亚种或瑞士乳杆菌混合 发酵生产酸奶、 硬奶酪等发酵乳制品。嗜热链球菌通过产生乳酸、 胞外多糖、 香味物质等赋 予产品特殊的风味和质地， 是公认的安全级食品微生物。 全世界嗜热链球菌年消费量达1021 菌体细胞。 目前选育的嗜热链球菌发酵剂菌株， 在保证快速产酸、 产黏及产生浓郁香味的传 统优良特性的基础上， 对增强菌株的益生特性方面给予极大关注。 0。
5、003 -氨基丁酸(gama-amino butyric acid， GABA)一种天然存在的非蛋白组成氨基 酸， 广泛存在于动植物体内， 参与多种代谢活动， 具有镇静神经、 抗焦虑、 提高脑活力和改善 睡眠等生理功能， 是一种抑制性神经递质。 随着研究的深入， GABA已经成为一种新型功能性 因子， 逐渐应用于医药和食品加工业。GABA 的制备方法包括化学合成法和生物合成法。化 学合成的 GABA， 成本高且使用有毒溶剂提取， 产品缺乏安全性， 不宜用于食品添加 ； 而生物 合成法安全性高， 产物可以达到食品级标准。生物合成法主要是利用微生物的谷氨酸脱羧 酶 (Glutamate decar。
6、boxylase,GAD) 催化 L- 谷氨酸发生脱羧反应转化为 GABA。许多微生 物都编码有谷氨酸脱羧酶， 目前利用大肠杆菌固定化细胞转化谷氨酸为 GABA 的效率高达 85。但是大肠杆菌菌株本身存在极大安全隐患， 因而利用食品安全级菌株生产 GABA 在食 品工业中有巨大的应用潜力。 0004 谷胱甘肽 (GSH) 是另一种广泛存在于动植物体内由谷氨酸、 半胱氨酸和甘氨酸组 成的功能性三肽化合物。由于 GSH 分子中含有一个还原性的巯基， 可通过氧化脱氢作用将 活性氧还原， 从而消除细胞内的自由基， 因此 GSH 在保护细胞抵抗氧化胁迫中具有重要的 作用。此外， GSH 的巯基能够螯合重。
7、金属、 氟化物等起到解毒的功能。鉴于 GSH 重要的生理 功能， 不仅作为药物应用于临床， 还可以广泛应用于延缓衰老、 增强免疫力、 抗肿瘤等功能 性食品中。 利用微生物合成GSH包括两个步骤， 首先L-谷氨酸和L-半胱氨酸在-谷氨酰 半胱氨酸合成酶催化下生成 - 谷氨酰半胱氨酸， 然后在谷胱甘肽合成酶的催化下 - 谷 氨酰半胱氨酸与甘氨酸缩合形成GSH。 目前比较基因组分析发现， 嗜热链球菌细胞内催化上 述两种反应的酶融合成为由一种酶即谷胱甘肽合成酶直接催化合成谷胱甘肽的反应， 使得 嗜热链球菌产生谷胱甘肽， 由此提高了嗜热链球菌发酵乳制品的益生性。 鉴于此， 开发或筛 选具有-氨基丁酸和谷。
8、胱甘肽合成能力的嗜热链球菌能够同时产生-氨基丁酸和谷胱 甘肽以极大的满足人们对发酵乳制品的功能性要求有重要的意义。 发明内容 0005 针对传统发酵乳制品菌株益生特性不足， 本发明要解决的问题是提供一株具有 说 明 书 CN 104293699 A 3 2/5 页 4 - 氨基丁酸 (GABA) 和谷胱甘肽 (GSH) 合成能力的嗜热链球菌及其应用。 0006 本发明所述的具有 - 氨基丁酸和谷胱甘肽合成能力的嗜热链球菌， 其特征在 于 ： 该菌株命名为嗜热链球菌 (Streptococcus thermophilus)ST1， 已于 2014 年 8 月 29 日 保藏于 “中国微生物菌种保。
9、藏管理委员会普通微生物中心” ， 其保藏编号为 CGMCC No.9781。 0007 上述嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)CGMCC No.9781分离自新疆传统 发酵酸奶中， 是一株能够转化谷氨酸产生 GABA 并利用谷氨酸、 半胱氨酸和甘氨酸合成 GSH 的嗜热链球菌， 具有嗜热链球菌的典型特征 ： 革兰氏阳性、 兼性厌氧， 无芽孢， 不运动 ； 菌落 较小且大小均一， 边缘整齐 ； 细胞呈椭球形， 液体培养时以链状出现 ； 其生理生化特征是 ： 过氧化氢酶阴性， V-P 反应阴性， 吲哚反应阴性， 详见表 1。 0008 表 1 ： 嗜热链球菌 CGM。
10、CC No.9781 的生理生化特征 0009 0010 说 明 书 CN 104293699 A 4 3/5 页 5 0011 上述嗜热链球菌 (Streptococcus thermophilus)CGMCC No.9781 生长温度为 37-42， 最适生长温度为 42。 0012 上述嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)CGMCC No.9781在MRS培养基中 快速生长， 静置培养 12 小时后， pH 值 4.54， 乳酸产量为 3.6g/L。 0013 上述嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)CGMCC No.9781的。
11、16S rDNA基因 序列已提交GenBank， 其登录号GU344726。 通过在美国生物工程信息中心(National Center for Biotechnology Information， NCBI) 查阅国际相关的基因库， 与本发明的嗜热链球菌 (Streptococcus thermophilus)CGMCC No.9781有关菌株的16S rDNA基因序列虽有相似性 ( 如表 2 所示 )， 但却不完全相同， 说明本发明公开的菌株是首次分离鉴定， 具有原创性。 0014 表 2 ： 嗜热链球菌 (Streptococcus thermophilus)CGMCC No.9781 。
12、的 16S rDNA 序 列与 GenBank 提交菌株序列相似性比较 0015 名称同源性 ( ) Streptococcus thermophilus CGLBL20898 Streptococcus thermophilus KLDS3.060698 Streptococcus thermophilus FMA80897 Paenibacillus illinoisensis M497 0016 本发明所述具有 - 氨基丁酸和谷胱甘肽合成能力的嗜热链球菌在发酵生产功 能性乳制品中的应用。 0017 实验证实 ： 本发明的嗜热链球菌 (Streptococcus thermophilus)。
13、CGMCC No.9781 在添加 2谷氨酸钠的 MRS 培养基中 42静置培养 24 小时， - 氨基丁酸 (GABA) 产量为 3.24g/L。本发明的嗜热链球菌 (Streptococcus thermophilus)CGMCC No.9781 在化学合 成培养基 (chemical defi ned medium,CDM) 中 42静置培养 24 小时， 谷胱甘肽 (GSH) 产量 为 3.19mg/mg protein。其中， 所述化学合成培养基配方为 ： 乳糖 10g/L， 乙酸钠 1g/L， 柠檬 酸三铵 6g/L， 磷酸二氢钾 3g/L， 磷酸氢二钾 2.5g/L， 六水氯化镁。
14、 0.2g/L， 氯化钙 0.05g/L， 硫酸锰 0.028g/L， 氯化亚铁 0.005g/L， 硫酸锌 0.005g/L， 硫酸锌 0.0001g/L， 对氨基苯甲酸 0.01g/L， 生物素 0.01g/L， 吡哆醛 0.005g/L， 烟酸 0.001g/L， 泛酸 0.001g/L， 叶酸 0.001g/ L， 氰钴胺 0.001g/L， 核黄素 0.001g/L， 腺嘌呤 0.01g/L， 鸟嘌呤 0.01g/L， 尿嘧啶 0.01g/L， 黄嘌呤 0.01g/L， 天冬氨酸 0.46g/L， 谷氨酸 0.4g/L， 赖氨酸 0.44g/L， 精氨酸 0.13g/L， 组氨 酸 。
15、0.15g/L， 苯丙氨酸 0.28g/L， 脯氨酸 0.65g/L， 色氨酸 0.05g/L， 甲硫氨酸 0.13g/L， 丙氨 酸 0.24g/L， 缬氨酸 0.33g/L， 亮氨酸 0.48g/L， 异亮氨酸 0.22g/L， 甘氨酸 0.18g/L， 丝氨酸 0.34g/L， 半胱氨酸 0.25g/L， 酪氨酸 0.29g/L。 说 明 书 CN 104293699 A 5 4/5 页 6 0018 上述实验明确了本发明公开的嗜热链球菌 (Streptococcus thermophilus)CGMCC No.9781 可以转化谷氨酸生成 GABA， 并可以利用培养基的谷氨酸、 半胱氨。
16、酸和甘氨酸合成 GSH， 预示该菌株在发酵生产功能性乳制品 ( 如酸奶、 硬奶酪等 ) 中具有潜在的价值和广阔 的应用前景。 具体实施方式 0019 实施例 1 ： 嗜热链球菌 (Streptococcus thermophilus) 菌株的筛选及生理生化特 性鉴定 0020 将新疆传统发酵酸奶样品涂布在MRS培养基琼脂平板上， 倒置平板42培养24小 时， 挑取白色圆形且过氧化氢酶阴性的菌落， 镜检为链球菌， 反复划线确定纯菌落， 接种到 MRS 培养基， 显微观察个体形态及进行生化反应测定， 最终筛选得到一株嗜热链球菌， 该菌 株命名为嗜热链球菌 (Streptococcus thermo。
17、philus)ST1， 已于 2014 年 8 月 29 日保藏于 “中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心” ( 地址 ： 北京市朝阳区北辰西路 1 号院 3 号 )， 其保藏编号为 CGMCC No.9781。 0021 上述嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)CGMCC No.9781菌株为革兰氏阳 性菌， 兼性厌氧， 无芽孢， 不运动 ； 菌落较小且大小均一， 边缘整齐 ； 细胞呈椭球形， 液体培 养时以链状出现 ； 其生理生化特征是 ： 过氧化氢酶阴性。V-P 反应阴性。吲哚反应阴性。可 利用乳糖、 葡萄糖、 麦芽糖、 蔗糖， 不能利用木糖。 002。
18、2 将上述嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)CGMCC No.9781接种到MRS培 养基中， 42静置培养 12 小时， pH 值下降到 4.54， 乳酸产量为 3.61g/L。 0023 实施例 2 ： 嗜热链球菌 (Streptococcus thermophilus)CGMCC No.9781 转化谷氨 酸生成 GABA 0024 将嗜热链球菌 (Streptococcus thermophilus)CGMCC No.9781 转接到含有 2谷 氨酸的 MRS 培养基中， 42静置培养 24 小时。培养物经过 1000g 离心 5 分钟收集上清液， 经过。
19、 0.22m 微米滤膜过滤后得到无菌发酵液， 测定其中 GABA 含量为 3.24g/L。 0025 上述 GABA 检测方法 ： 取出 100L 无菌发酵液冰浴 10 分钟， 加入 200L 0.2mol/ L 硼酸缓冲液 (pH9.0)， 再加入 1ml 6的苯酚和 400L 次氯酸钠溶液， 充分震荡后在沸水 浴中反应10min后， 立刻冰浴冷却20min， 待溶液出现蓝绿色取出50L， 加入150L60乙 醇溶液， 在 630nm 波长下测定吸光度值。 0026 实施例 3 ： 应用嗜热链球菌 (Streptococcus thermophilus)CGMCC No.9781 转化 谷氨。
20、 酸、 半胱氨酸和甘氨酸生产谷胱甘肽 (GSH) 0027 将嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)CGMCC No.9781在MRS培养基中培 养至稳定期前期， 6000g 离心 3 分钟收集菌体， 加入无菌水洗涤菌体 2 次， 最后用等体积的 CDM 培养基重悬菌体， 按照 2的比例接种于化学合成 (chemical defi ned medium,CDM) 培 养基中 42静止培养 24 小时。 0028 其中 ： 上述化学合成培养基配方为 ： 乳糖10g/L， 乙酸钠1g/L， 柠檬酸三铵6g/L， 磷 酸二氢钾 3g/L， 磷酸氢二钾 2.5g/L， 六水。
21、氯化镁 0.2g/L， 氯化钙 0.05g/L， 硫酸锰 0.028g/ L， 氯化亚铁0.005g/L， 硫酸锌0.005g/L， 硫酸锌0.0001g/L， 对氨基苯甲酸0.01g/L， 生物素 0.01g/L， 吡哆醛 0.005g/L， 烟酸 0.001g/L， 泛酸 0.001g/L， 叶酸 0.001g/L， 氰钴胺 0.001g/ 说 明 书 CN 104293699 A 6 5/5 页 7 L， 核黄素 0.001g/L， 腺嘌呤 0.01g/L， 鸟嘌呤 0.01g/L， 尿嘧啶 0.01g/L， 黄嘌呤 0.01g/L， 天 冬氨酸 0.46g/L， 谷氨酸 0.4g/L，。
22、 赖氨酸 0.44g/L， 精氨酸 0.13g/L， 组氨酸 0.15g/L， 苯丙氨 酸 0.28g/L， 脯氨酸 0.65g/L， 色氨酸 0.05g/L， 甲硫氨酸 0.13g/L， 丙氨酸 0.24g/L， 缬氨酸 0.33g/L， 亮氨酸 0.48g/L， 异亮氨酸 0.22g/L， 甘氨酸 0.18g/L， 丝氨酸 0.34g/L， 半胱氨酸 0.25g/L， 酪氨酸 0.29g/L。 0029 培养结束后， 检测发酵产物中 GSH 的含量为 3.19mg/mg protein。 0030 上述谷胱甘肽含量的检测方法 ： 1mL 的反应体系包含 700L 0.3mM NADPH， 100L6mM 5,5 二巯基 (2- 对硝基苯甲酸 )， 180L 待测样品。反应体系混匀后加入 10L 50U/mL的谷胱甘肽还原酶开始反应， 在412nm下连续100秒检测吸光值的改变， 计算反应速 率。利用已知浓度的 GSH 标准品绘制标准曲线， 通过比较待测溶液的反应速率与标准曲线 比较计算出样品中的 GSH 含量。 说 明 书 CN 104293699 A 7 。