调控FABP6基因的两个MICRORNA及其应用.pdf

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1、(10)申请公布号 CN 104293782 A (43)申请公布日 2015.01.21 CN 104293782 A (21)申请号 201410480221.3 (22)申请日 2014.09.19 C12N 15/11(2006.01) C12Q 1/68(2006.01) (71)申请人 中国农业科学院北京畜牧兽医研究 所 地址 100193 北京市海淀区圆明园西路 2 号 (72)发明人 苗向阳 (54) 发明名称 调控 FABP6 基因的两个 microRNA 及其应用 (57) 摘要 本发明涉及与绵羊脂肪相关的分子标记 的筛选及应用， 具体涉及调控 FABP6 基因的两 个 m。

2、icroRNA 及其应用。发明通过高通量测序 和物信息学分析， 筛选到调控 FABP6 基因的两 个 microRNA， 所述的 microRNA 为 miR-29692 和 ssc-miR-28-3p。进一步进行了分子生物学验 证， 结果显示 miR-29692 和 ssc-miR-28-3p 能有 效抑制 FABP6 基因的表达。本发明公开的两个 microRNA 可以作为绵羊脂肪相关的分子标记， 在 遗传辅助育种中具有重要的实际应用价值。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 12 页 序列表 4 页 附图 1 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请。

3、 权利要求书1页 说明书12页 序列表4页 附图1页 (10)申请公布号 CN 104293782 A CN 104293782 A 1/1 页 2 1. 一种绵羊育种分子标记 miRNA， 其特征在于， 所述 miRNA 的靶标基因是 FABP6。 2.根据权利要求1所述的miRNA， 其特征在于， 所述miRNA为miR-29692， 序列为SEQ ID NO 1。 3.根据权利要求1所述的miRNA， 其特征在于， 所述miRNA为ssc-miR-28-3p， 所述分子 标记序列为 SEQ ID NO 8。 4. 根据权利要求 1-3 任意一项所述的 miRNA， 其特征在于， 所述 m。

4、iRNA 在优良肉用绵羊 品种的脂肪组织中低表达。 5. 一种通过检测权利要求 1-4 任意一项所述的分子标记 miRNA 检测绵羊肌肉品质的 方法， 其特征在于， 采用下列检测方法中的一种或几种 ： 基于核苷酸杂交基础上的方法， 如 RNA 印迹技术、 原位杂交技术、 基于微球的流式细胞术和微阵列技术 ； 夹板连接法 ； 基于 PCR 基础上的方法， 如加尾法、 小靶点定量 PCR 和茎环法。 6.根据权利要求5所述的检测方法， 其特征在于， 采用加尾法和/或茎环法检测绵羊脂 肪组织中 miRNA 的表达。 7. 根据权利要求 5 或 6 任意一项所述的检测方法， 其特征在于， 所述加尾法检。

5、测 miRNA 表达水平的步骤 ： (1) 提取绵羊肌肉组织中的小 RNA ； (2) 通过 poly(A) 聚合酶和反转录酶 进行miRNA加尾和反转录 ； (3)采用适用于加尾法的荧光定量PCR试剂盒进行miR-29692和 / 或 ssc-miR-28-3p 的扩增 ； 所述茎环法检测 miRNA 表达水平的步骤 ： (1) 提取绵羊肌肉组 织中的总 RNA ； (2) 通过反转录引物在反转录酶的作用下进行 miRNA 反转录 ； (3) 采用适用 于茎环法的荧光定量 PCR 试剂盒进行 miR-29692 和 / 或 ssc-miR-28-3p 的扩增。 8. 一种检测绵羊脂肪组织中 。

6、miR-29692 和 / 或 ssc-miR-28-3p 表达水平的荧光定量 PCR 试剂盒。 9.权利要求1-4任意一项所述的分子标记和/或权利要求8所述试剂盒在遗传标记辅 助育种、 改善肉用绵羊肌肉品质中的应用。 10.权利要求3和4所述的miRNA的组合在遗传标记辅助育种、 改善肉用绵羊肌肉品质 中的应用。 权 利 要 求 书 CN 104293782 A 2 1/12 页 3 调控 FABP6 基因的两个 microRNA 及其应用 技术领域 0001 本发明属于家畜分子标记制备技术领域， 具体涉及一种与绵羊脂肪酸相关的分子 标记的筛选及应用。 背景技术 0002 绵羊育种中， 伴随。

7、产肉效率的提高， 肉产品的食用品质受到影响， 降低了消费者对 肉品质的满意度。 嫩度及风味是主要的肉质性状， 与肌肉的脂肪酸含量和组成有关， 由微效 多基因控制， 遗传机理复杂 ； 因性状之间的关联性， 以传统的表型选择难以改善肌肉脂肪酸 特性， 而利用与绵羊肌肉脂肪酸相关的分子标记， 进行分子标记辅助选择是有效改善肉质 的育种方法。参与脂肪酸代谢的基因常用于肉质性状标记的候选基因。 0003 脂肪酸结合蛋白 (fatty acid binding protein， FABPs) 参与胞内脂肪酸运输， 将脂肪酸从细胞膜上运送至脂肪酸氧化和甘油三醋， 磷脂的合成位点。按基因所表达的组 织或细胞划。

8、分， FABPs 至少有 9 种不同的类型， 大部分已经成为绵羊肉质性状的主要候选基 因。 0004 miRNA 是一类大小约 21-23 个核苷酸的 RNA 分子， 一般来源于染色体的非编码区 域， 由大约 70nt 大小的可形成发夹结构的前体加工而来， 其作用是在转录后水平上对基因 表达产生抑制性作用。 通过不断探索， 人们逐渐揭示了miRNA的生物功能 ： 调节生物体内与 机体生长、 发育、 疾病发生过程有关的基因的表达。随着新一代测序技术的发展， 人类对于 miRNA在各种生理病理过程中的功能和调控将会有进一步的认识。 然而到目前为止， 通过各 种不同的实验方法和生物信息学分析方法发现。

9、并证实的 miRNA 和靶标远远没有达到饱和 程度。因此还有很多潜在的 miRNA 有待我们去发现验证， 并揭示作用的靶标， 从而弄清这些 非编码 RNA 的生物功能。 0005 绵羊对农业方面以及生物学研究来说极其重要， 目前对肉用绵羊的遗传育种研究 还略显滞后， 寻找与绵羊肌肉脂肪酸品质相关的 miRNA 分子标记对于遗传标记辅助育种、 改善肉用绵羊的品质具有重要作用。小尾寒羊 (HanSheep) 是冀、 鲁、 预、 苏、 皖交界地区的 一个优良绵羊品种， 是当地劳动人民长期选育的地方良种， 具有适应性强， 耐粗饲料， 肌肉 不发达， 生长较缓慢， 肌内脂肪含量高等特点。道赛特羊 (Do。

10、rset) 是在澳大利亚和新西兰 的肉用型羊， 具有生长发育快、 瘦肉率高、 肌内脂肪含量低等特点， 但肉质欠佳。 0006 本发明通过对上述两种绵羊的脂肪组织进行高通量 miRNA 测序， 筛选与绵羊肌肉 脂肪酸相关的分子标记， 经过生物信息学差异基因表达分析初步选定了调控 FABP6 基因的 两个microRNA， 命名为miR-29692和ssc-miR-28-3p。 进一步进行了分子生物学实验验证结 果显示本发明所述的两个 microRNA 可以作为绵羊肌肉脂肪酸相关的 microRNA 分子标记。 本发明还公开了用于检测所述分子标记的检测试剂盒， 具有重要的实际应用价值。 发明内容 。

11、0007 本发明的目的是提供一种绵羊育种分子标记 miRNA， 所述 miRNA 的靶标基因是 说 明 书 CN 104293782 A 3 2/12 页 4 FABP6。 0008 进一步， 所述 miRNA 在优良肉用绵羊品种的脂肪组织中低表达 ； 在普通肉用绵羊 品种的脂肪组织中高表达调控靶基因 FABP6 低表达。 0009 本发明的目的是提供一种与绵羊肌肉品质相关的 microRNA 标志物。所述 microRNA 为绵羊 miR-29692。 0010 本发明的目的是提供绵羊 miR-29692 序列 SEQ IDNO 1 ： 0011 UGGACCUGGGGCUCUGC。 001。

12、2 本发明的目的是提供绵羊 miR-29692 的靶标基因， 所述靶标基因为 FABP6。 0013 本发明的目的是提供 miR-29692 标志物的引物。 0014 进一步， 使用茎环法检测miR-29692标志物时， 所用的反转录引物(RT primer)的 序列为序列表中SEQ ID NO 2 ； 上游引物(Forward primer)为序列表中SEQ ID NO 3 ； 下游 引物 (Reverse primer) 为序列表中 SEQ ID NO 4。 0015 进一步， 使用茎环法检测 miR-29692 标志物时， 可以采用探针法或染料法。 0016 进一步， 使用加尾法检测 m。

13、iR-29692 标志物时， 所用的上游引物 (Forward primer) 为序列表中 SEQ ID NO 5。 0017 本发明制备的一种检测 miR-29692 表达水平的荧光定量 PCR 试剂盒组分包括 ： 反 转录试剂、 反转录引物、 特异性引物、 内参引物、 荧光定量 PCR 反应液。优选的还包括特异性 探针。其中所述的反转录引物序列为 SEQ ID NO 2 ； 特异性引物包括上游引物和下游引物， 上游引物序列为 SEQ ID NO 3， 下游引物序列为 SEQ ID NO 4。 0018 本发明制备的一种检测 miR-29692 表达水平的荧光定量 PCR 试剂盒组分包括 ：。

14、 反 转录试剂、 反转录引物、 特异性上游引物、 通用下游引物、 内参引物、 荧光定量 PCR 反应液。 其中所述的特异性上游引物序列为 SEQ ID NO 5。 0019 上述的试剂盒应用于绵羊肌肉组织中 miR-29692 的定量检测。 0020 本发明的另一个目的是提供一种与绵羊肌肉品质相关的 microRNA 标志物。所述 microRNA 为绵羊 ssc-miR-28-3p。 0021 本发明的目的是提供绵羊 ssc-miR-28-3p 序列 SEQ ID NO 8 ： 0022 CCUUGUGAGCUCUAUGCAAGGG。 0023 本发明的目的是提供绵羊 ssc-miR-28-。

15、3p 的靶标基因， 所述靶标基因为 FABP6。 0024 本发明的目的是提供 ssc-miR-28-3p 标志物的引物。 0025 进一步， 使用茎环法检测 ssc-miR-28-3p 标志物时， 所用的反转录引物 (RT primer) 的序列为序列表中 SEQ ID NO 9 ； 上游引物 (Forward primer) 为序列表中 SEQ ID NO 10 ； 下游引物 (Reverse primer) 为序列表中 SEQ ID NO 11。 0026 进一步， 使用茎环法检测 ssc-miR-28-3p 标志物时， 可以采用探针法或染料法。 0027 进一步， 使用加尾法检测 ss。

16、c-miR-28-3p 标志物时， 所用的上游引物 (Forward primer) 为序列表中 SEQ ID NO 12。 0028 本发明的目的是提供 ssc-miR-28-3p 标志物或其引物的应用。 0029 为实现上述目的， 本发明首先选取 Dorset 及 HanSheep 绵羊腹脂各 5 例， 送往测序 公司进行高通量转录组测序， 并对测序结果结合国际公认算法 EBSeq 进行差异基因表达分 析， 通过分析挑选出表达差异明显的 miR-29692 和 ssc-miR-28-3p， 序列为 SEQ ID NO 1 和 说 明 书 CN 104293782 A 4 3/12 页 5 。

17、SEQ ID NO 8， 进一步以 miR-29692 和 ssc-miR-28-3p 为研究对象， 通过搜索 RNAhybrid 数 据库， 预测出 miR-29692 和 ssc-miR-28-3p 调控的靶基因FABP6。 0030 根据上述的 miRNA 的序列和 FABP6 的序列设计引物序列。 0031 进一步采用 RT-PCR 方法检测 45 例 Dorset 绵羊、 45 例 HanSheep 绵羊脂肪组织 中 miR-29692、 ssc-miR-28-3p 及 FABP6 的表达情况， 结果显示 Dorset 绵羊脂肪组织中 miR-29692、 ssc-miR-28-3p。

18、的表达明显高于HanSheep绵羊脂肪组织， 前者是后者的近3.23 和 3.58 倍。 0032 更进一步的 miRNA 对 FABP6 基因表达的抑制实验结果显示， 单独的 miR-29692、 ssc-miR-28-3p 就能很好的负调控基因 FABP6， 二者联合能更好的负调控基因 FABP6。表明 miR-29692、 ssc-miR-28-3p 可单独也可联合作为标志物应用于绵羊肌肉品质相关的遗传育 种中。 0033 本发明的目的是提供用于检测上述 microRNA 标志物和 / 或检测上述靶标基因 FABP6 的检测试剂盒。该 PCR 试剂盒适合于目前存在市场上的所有类型荧光定量。

19、基因扩增 仪， 灵敏度高， 定量快速准确、 稳定性好， 具有良好的应用前景。 0034 本发明还公开了 miR-29692 检测方法。 0035 miR-29692 检测可采用包括基于核苷酸杂交基础上的方法 ( 如 RNA 印迹技术、 原 位杂交技术、 基于微球的流式细胞术和微阵列技术 )、 夹板连接法和基于 PCR 基础上的方法 (RNA 加尾法、 小靶点定量 PCR 和茎环法 ) 等多种检测方法进行检测。 0036 RNA 印迹技术 (Northern blot) 一般是先用聚丙烯酰胺电泳 (PAGE) 分离出总 RNA 中长度约 200bp 以内的小 RNA， 然后转移至印迹膜上与标记的。

20、寡核苷酸探针杂交， 经洗膜显 影后对条带进行分析。 为了提高杂交反应的亲合性和检测灵敏度， 锁核酸(locked nucleic acid， LNA) 探针被应用于 microRNA 的分析研究。实验表明， 在寡核苷酸探针中每引入 1 个 LNA修饰碱基， 其与相应的DNA杂交时， 解链温度会提高1-8， 而在与RNA杂交时解链温 度会提高 2 -10， 从而提高 LNA 探针与 microRNAs 分子的杂交特异性和灵敏度。 0037 miRNAs 原位杂交分析是用比色或荧光试剂等标记的核酸探针与细胞或组织 中的 microRNAs 进行杂交， 通过显色或荧光成像检测 microRNAs 的。

21、表达， 可直观地展现 microRNAs的时空表达模式。 原位杂交技术能够显示miRNA表达的位置， 甚至达到细胞定位 的水平， 尤其适用于石蜡包埋或福尔马林固定后的标本。 0038 基于微球的流式细胞术 (bead-based flow-cytometry)， 即液相芯片技术， 这种技 术将流式细胞检测与芯片技术有机地结合在一起， 使生物芯片反应体系由液相固相反 应改变为接近生物系统内部环境的完全液相反应体系。 此法利用聚苯乙烯微球作为反应载 体， 不同的微球由不同的荧光编码所标记， 可被相应检测系统所识别。微球上可连接核苷 酸探针或者蛋白质， 检测 miRNA 时连接的是长约 10-12n。

22、t 的 miRNA 捕获探针， 此探针与靶 miRNA 的 3端互补配对， 再加入 8-10nt 的报告探针与 miRNA 的 5 端反应。反应结束后， 在检测系统中通过两束激光逐一通过检测流场的微球探针上的分类荧光和报告探针上的 标一记荧光进行检测， 从而实现对靶 miRNA 的定性和定量检测。 0039 微阵列技术 (microarray) 也称生物芯片、 DNA 芯片或者基因芯片技术。一般 是在玻璃片等固体支持物上固定高密度已知序列的 DNA 探针， 利用杂交原理， 使多种 microRNAs 目标分子与微阵列杂交， 通过检测杂交信号强度及数据处理， 获得不同标本中特 说 明 书 CN 。

23、104293782 A 5 4/12 页 6 异 microRNAs 的表达谱， 从而全面比较不同物种的不同器官或组织以及正常和患病组织中 microRNAs表达水平的差异。 它的优点是高通量， 可以一次分析人的整个基因组， 在10分钟 内定量获得 3 万多个基因的表达。 0040 夹板连接法需先设计一段与目标 miRNA 互补的脱氧核苷酸 ( 桥连片段 )， 此片段 除了与目的 miRNA 互补段 (3 端 ) 外， 其 5 端还有一段 14nt 的外延片段。同时设计一段 与 14m 外延片段互补的脱氧核普酸 ( 连接片段 )， 在其 5 端用 32P进行标记。退火时 miRNA 与连接片段。

24、同时与桥连片段互补配对， 就产生了一个杂化双链， 其中一链中间有个缺口， 即 miRNA 与连接片段的交界处。用 T4DNA 连接酶将此缺口连上， 就相当于用 32P对 miRNA 进行 了标记。用磷酸酶除去游离的 32P标记的连接片段， 再进行聚丙烯酰胺凝胶电泳， 对放射信 号的强弱进行检测， 即可得到对应的 miRNA 量的信息。据称此方法比 Northem blot 简便、 快速， 也更敏感， 可用来进行大量标本的检测。 0041 加尾法。 miRNA的长度仅为22nt左右， 几乎只相当于一个引物的长度， 因此不能用 传统的 RT-PCR 方法进行检测。可用 RNA 加尾和引物延伸 RT。

25、-PCR 法进行 miRNA 检测。首先 提取总 RNA， 继提取小 RNA， 在小 RNA3 末端由 poly A 聚合酶加上一段 poly A 尾巴， 然后用 一个 3 末端含有一段 poly T 的长引物将 miRNA 逆转录成 cDNA， 所得到的 cDNA 的长度比较 适合进行荧光定量 PCR。 0042 小靶点定量聚合酶链反应包括三个反应步骤 ： 逆转录、 DNA 模板连接和连接产物 的 PCR 扩增， 每个反应都被热失活所隔开。在逆转录反应时， miRNA 被特异引物逆转录生成 cDNA， 因各个 miRNA 之间至少可达到一个碱基的差别， 而差别处大多位于 miRNA 的 3 。

26、端， 因 此引物的末端应尽量位于 miRNA 的 3 端高变区或附近， 引物长度应尽量缩短。在第二步反 应中， cDNA 与两个寡核苷酸互补配对， 互补配对后， 两个寡核苷酸之间的缺口可达到 7 个核 苷酸的长度。每个寡核苷酸都部分与 cDNA 配对， 其余超出 cDNA 长度的部分露出在外， 称为 M13+。缺口由 T4DNA 连接酶所填补， 连接反应对缺口两端的碱基错配非常敏感， 尤其是 3 端， 所以应尽可能将缺口的 3 端设置于 miRNA 高变区之外。在第三步反应中， 以连接产物 作为模板， 以 M13+ 的正、 反向引物作为 PCR 通用引物， 与特异的 TaqMan 探针一起， 。

27、进行 PCR 扩增。由于逆转录和连接反应都以 miRNA 的中心和 3末端即区分 miRNA 成员的主要区域 作为特异的靶标， 且 T4DNA 连接酶能够对碱基错配进行辨别， 因而这种方法具有较高的特 异性， 交叉反应率低， 可作为定量检测短核苷酸的敏感的检测方法。 0043 茎环法的特征是应用了一个单一的茎环状的引物， 避免对目的 miRNA 进行加尾。 反应过程分两步。首先， 茎环状引物与目的 miRNA 分子的 3 端结合， 引物 3 端与 miRNA3 端有 6 个互补配对的核苷酸， 然后用逆转录酶将之逆转录成 cDNA 第一链。其次是 PCR 反 应。cDNA 第一链的茎环状结构打开。

28、后链的长度增加了， 以其为模板即可进行传统的荧光定 量 PCR。茎环状引物的茎部为双链结构， 防止引物与 pre-miRNA 或其他长链 RNA 的杂交 ； 茎 部的碱基堆积增强了miRNA和DNA异质双链的亲合力， 提高了逆转录的效率 ； 且茎环状结构 展开后增加了 miRNA 的长度， 为随后进行的 PCR 反应提供了合适的模板。 0044 优选的， 本发明公开了一种通过荧光定量检测 miR-29692 和 / 或 ssc-miR-28-3p 表达水平的方法。 0045 优选的， 本发明公开了一种通过RT-PCR中的加尾法检测miR-29692表达水平的方 法。 说 明 书 CN 1042。

29、93782 A 6 5/12 页 7 0046 进一步， 所述加尾法检测 miR-29692 表达水平的步骤 ： (1) 提取绵羊肌肉组织中的 小 RNA ； (2) 通过 poly(A) 聚合酶和反转录酶进行 miR-29692 加尾和反转录 ； (3) 采用 SEQ ID NO 5 及市售适用于加尾法的荧光定量 PCR 试剂盒进行 miR-29692 的扩增。 0047 优选的， 加尾法检测 miR-29692 表达水平的步骤 ： (1) 提取绵羊肌肉组织中的 小 RNA ； (2) 通 过 Qiagen 的 miScript II Reverse Transcription Kit( 货。

30、 号 218161) 进 行 miR-29692 加 尾 和 反 转 录 ； (3) 采 用 SEQ ID NO 5 及 Qiagen 的 miScript SYBR GreenPCRKit( 货号 218073) 进行 miR-29692 的扩增。 0048 进一步， 所述茎环法检测 miR-29692 表达水平的步骤 ： (1) 提取绵羊肌肉组织中的 总RNA ； (2)通过反转录引物SEQ ID NO 2在反转录酶的作用下进行miR-29692反转录 ； (3) 采用引物 SEQ ID NO 3 和 SEQ ID NO 4 及市售适用于茎环法的荧光定量 PCR 试剂盒进行 miR-296。

31、92 的扩增。 0049 优选的， 本发明公开了一种通过RT-PCR中的加尾法检测ssc-miR-28-3p表达水平 的方法。 0050 进一步， 所述加尾法检测 ssc-miR-28-3p 表达水平的步骤 ： (1) 提取绵羊肌肉组织 中的小 RNA ； (2) 通过 poly(A) 聚合酶和反转录酶进行 ssc-miR-28-3p 加尾和反转录 ； (3) 采用 SEQ ID NO 12 及市售适用于加尾法的荧光定量 PCR 试剂盒进行 ssc-miR-28-3p 的扩 增。 0051 优选的， 加尾法检测 ssc-miR-28-3p 表达水平的步骤 ： (1) 提取绵羊肌肉组织中的 小 。

32、RNA ； (2) 通过 Qiagen 的 miScript II Reverse Transcription Kit( 货号 218161) 进行 ssc-miR-28-3p 加尾和反转录 ； (3) 采用 SEQ ID NO 12 及 Qiagen 的 miScript SYBR Green PCR Kit( 货号 218073) 进行 ssc-miR-28-3p 的扩增。 0052 进一步， 所述茎环法检测 ssc-miR-28-3p 表达水平的步骤 ： (1) 提取绵羊肌肉组织 中的总RNA ； (2)通过反转录引物SEQ ID NO 9在反转录酶的作用下进行ssc-miR-28-3p。

33、反 转录 ； (3)采用引物SEQ ID NO 10和SEQ ID NO 11及市售适用于茎环法的荧光定量PCR试 剂盒进行 ssc-miR-28-3p 的扩增。 0053 本发明还提供了 miR-29692 和 / 或 ssc-miR-28-3p 作为分子标记在遗传标记辅助 育种、 改善肉用绵羊的品质中的应用。 0054 进一步， 所述 miR-29692 和 / 或 ssc-miR-28-3p 辅助育种、 改善肉用绵羊的品质中 的应用， 在目标肉用绵羊肌肉组织中 miR-29692 和 / 或 ssc-miR-28-3p 低表达， FABP6 高表 达。 0055 miRNA 及其前体定义。

34、 0056 本发明提供了一类涉及绵羊肉质相关的 miRNA。如本文所用， 所述的 “miRNA” 是一 类长度约 19 25 个核苷酸的非编码单链小分子 RNA， 广泛存在于植物、 线虫、 果蝇和哺乳 动物等生物中， 主要通过基本上互补的方式与编码蛋白 mRNA 的 3 -UTR 区结合引起靶 mRNA 的降解、 活性降低或翻译受抑， 从而在转录后水平对基因表达进行调控一类 RNA 分子。成熟 的 miRNA 通常具有 19 25 个核苷酸 (nt)( 更特别的约 19-22nt)， 也不排除具有其它数目 核苷酸的 miRNA 分子。 0057 miRNA 可从前体 miRNA(Precurs。

35、or miRNA， Pre-miRNA) 加工而来， 所述的前体 miRNA可折叠成一种稳定的茎环(发夹)结构， 所述的茎环结构长度一般在50-100bp之间。 说 明 书 CN 104293782 A 7 6/12 页 8 所述的前体 miRNA 可折叠成稳定的茎环结构， 茎环结构的茎部两侧包含基本上互补的两条 序列。所述的前体 miRNA 可以是天然的或是人工合成的。 0058 前体 miRNA 可被剪切生成 miRNA， 所述的 miRNA 可与编码基因的 mRNA 的至少一部 分序列基本上互补。如本文所用，“基本上互补” 是指核苷酸的序列是足够互补的， 可以以一 种可预见的方式发生相互。

36、作用， 如形成二级结构 ( 如茎环结构 )。通常， 两条 “基本上互补” 的核苷酸序列互相之间至少有 70的核苷酸是互补的 ； 优选的， 至少有 80的核苷酸是互 补的 ； 更优选的， 至少有 90的核苷酸是互补的 ； 进一步优选的， 至少有 95的核苷酸是互 补的 ； 如 98、 99或 100。一般地， 两条足够互补的分子之间可以具有最多 40 个不匹配 的核苷酸 ； 优选的， 具有最多 30 个不匹配的核苷酸 ； 更优选的， 具有最多 20 个不匹配的核 苷酸 ； 进一步优选的， 具有最多 10 个不匹配的核苷酸， 如具有 1、 2、 3、 4、 5、 8、 11 个不匹配的 核苷酸。 。

37、0059 如本文所用，“茎环” 结构也被称作 “发夹” 结构， 是指一种核苷酸分子， 其可形成一 种包括双链区域 ( 茎部 ) 的二级结构， 所述的双链区域由该核苷酸分子的两个区域 ( 位于 同一分子上 ) 形成， 两个区域分列双链部分的两侧 ； 其还包括至少一个 “环” 结构， 包括非互 补的核苷酸分子， 即单链区域。 即使该核苷酸分子的两个区域不是完全互补的， 核苷酸的双 链部分也可保持双链状态。例如， 插入、 缺失、 取代等可导致一个小区域的不互补或该小区 域自身形成茎环结构或其它形式的二级结构， 然而， 该两个区域仍可基本上互补， 并在可预 见的方式中发生相互作用， 形成茎环结构的双链。

38、区域。茎环结构是本领域技术人员所熟知 的， 通常在获得了一条具有一级结构的核苷酸序列的核酸后， 本领域技术人员能够确定该 核酸是否能形成茎环结构。 0060 小 RNA 测序 0061 小 RNA 是一类重要的体内调节分子， 主要包括 miRNA、 piRNA 和 siRNA。它的功能 主要是诱导基因沉默， 参与基因转录后调控， 从而调节细胞生长、 分化， 以及个体发育、 生殖 等重要生物学过程。小 RNA 测序技术采用胶分离技术， 收集样品中 18-30nt 的 RNA 片段， 利 用高通量测序技术， 一次性获得单碱基分辨率的数百万条小 RNA 序列信息， 依托强大的生 物信息分析平台， 鉴。

39、定已知小 RNA， 并预测新的小 RNA 及其靶标基因。 0062 本发明还包括miRNA变体和衍生物。 此外， 广义上的miRNA衍生物也可包括miRNA 变体。本领域的普通技术人员可以使用通用的方法对 miR-29692 进行修饰， 修饰方式包括 ( 但不限于 ) ： 甲基化修饰、 烃基修饰、 糖基化修饰 ( 如 2- 甲氧基 - 糖基修饰、 烃基 - 糖基 修饰、 糖环修饰等 )、 核酸化修饰、 肽段修饰、 脂类修饰、 卤素修饰、 核酸修饰 ( 如 “TT” 修饰 ) 等。 0063 多核苷酸构建物 0064 根据本发明所提供的 miRNA 序列， 可设计出在被导入后可被加工成可影响相应。

40、的 mRNA 表达的 miRNA 的多核苷酸构建物， 也即所述多核苷酸构建物能够在体内上调相应的 miRNA 的量。所述的多核苷酸构建物可被人细胞转录成前体 miRNA， 所述的前体 miRNA 可被 人细胞剪切且表达成所述的 miRNA。 0065 通常， 所述的多核苷酸构建物位于表达载体上。因此， 本发明还包括一种载体， 它 含有所述的 miRNA， 或所述的多核苷酸构建物。所述的表达载体通常还含有启动子、 复制起 点和 / 或标记基因等。本领域的技术人员熟知的方法能用于构建本发明所需的表达载体。 说 明 书 CN 104293782 A 8 7/12 页 9 这些方法包括体外重组 DNA。

41、 技术、 DNA 合成技术、 体内重组技术等。所述的表达载体优选地 包含一个或多个选择性标记基因， 以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状， 如卡拉霉 素、 庆大霉素、 潮霉素、 氨苄青霉素抗性。 0066 本发明优点 ： 0067 (a) 本发明提供的 miR-29692 和 / 或 ssc-miR-28-3p 与绵羊肌肉品质具有很好的 相关性， 可用于绵羊肌肉品质相关的辅助遗传育种中。 0068 (b)本发明提供的检测miR-29692和/或ssc-miR-28-3p表达水平的荧光定量PCR 试剂盒包含了从 RNA 提取到荧光定量实验所用的整套试剂， 既方便使用， 又保证了结果的 一致性。。

42、 附图说明 0069 图 1.Real-time PCR 检测绵羊脂肪组织中 miR-29692 的相对表达量。 0070 图 2.Real-time PCR 检测绵羊脂肪组织中 ssc-miR-28-3p 的相对表达量。 具体实施方式 0071 下面结合具体实施例， 进一步阐述本发明， 仅用于解释本发明， 而不能理解为对本 发明的限制。本领域的普通技术人员可以理解 ： 在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可 以对这些实施例进行多种变化、 修改、 替换和变型， 本发明的范围由权利要求及其等同物限 定。下列实施例中未注明具体条件的实验方法， 通常按照常规条件或按照厂商所建议的条 件实施检测。 00。

43、72 实施例 1 高通量转录组测序寻找不同品种绵羊脂肪组织中表达谱差异的 microRNA 0073 选 5 例 Dorset 及 5 例 HanSheep 绵羊分别取他们的腹脂， 组织标本自取出后分成 小块速冻于液氮 30 秒， 然后储存于 -70冰箱。随后低温送往测序公司进行小 RNA 测序。 0074 运用 Fast-QC(http ： /www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/ fastqc/) 软件对测序数据的质量进行整体评估， 包括碱基的质量值分布， 质量值的位置分 布， GC 含量， PCRduplication 含量， kmer 的。

44、 frequency 等。 0075 将成熟小 RNA 分析结果的 counts 数加和小于 10 的删除， 再采用结合国际公认算 法 EBSeq 进行差异筛选。其中 logFC 1 或 LogFC -1， FDR 0.05。通过分析最终挑选 出表达差异明显的 miR-29692 和 ssc-miR-28-3p， 序列为 SEQ ID NO 1 和 SEQ ID NO 8， 通 过搜 RNAhybrid 数据库， 预测出他们调控的靶基因为 FABP6。 0076 实施例2Real-time PCR检测绵羊脂肪组织中miR-29692、 ssc-miR-28-3p及FABP6 的表达 0077 。

45、试剂 ： 0078 反转录试剂盒 ： SG One-Step miRNA RT Kit， #33-30120， SinoGene 0079 PCR Mix ： 2SG PCR MasterMix， #33-10201， SinoGene 0080 qPCR 试剂 ： 2SG Green qPCR Mix(with ROX)， #22-10102， SinoGene 0081 相关实验物品的去 Rnase 的处理 ： 0082 将所有玻璃器皿应用前均用DEPC冲洗侵泡， 120高压20min， 180高温烤干2 说 明 书 CN 104293782 A 9 8/12 页 10 小时以上。 008。

46、3 将塑料器皿 ( 如 ： EP 管 / 枪头 ) 使用前需用 0.1 DEPC 水侵泡过夜， 后控干液 体， 120高压 20min， 烤箱烤干备用。 0084 选取45例Dorsetp绵羊脂肪组织、 45例HanSheep绵羊脂肪组织， 编码后随机选择 提取 RNA。 0085 miRNA 提取 ： 0086 (1) 从液氮中分别取出冻存绵羊脂肪组织， 称重， 分别放入离心管中， 按 50-100mg 组织 /ml Trizol 的量加入 Trizol， 组织体积不能超过 Trizol 体积的 10， 充分匀浆约 1-2min ； 0087 (2) 组织加入 Trizol 后， 15-30。

47、孵育 5min， 使其充分裂解 ； 0088 (3) 加入 1/10 体积的 miRNA 匀浆添加剂， 漩涡数下混合均匀， 冰上放置 10 分钟 ； (4) 向裂解物中加入同体积的三氯甲烷， 漩涡 30-60s 混匀 ； 0089 (5) 室温最大转速 (10000g) 离心 5 分钟， 使水相有机相分离， 中间相析出 ； 中间相 如果没有析出， 再次离心 ； 0090 (6) 小心吸取上层水相至新的收集管中， 记录水相体积 ； 0091 (7) 向收集管中加入 1/3 体积的无水乙醇， 漩涡或颠倒数下混匀 ； 0092 (8) 将裂解液 / 乙醇混合液加入过滤芯过滤， 过滤芯放入新的收集管中。

48、， 每个样本 用一个过滤芯 ； 0093 (9) 用移液管将上步中的混合液移入过滤芯， 一次可容纳体积 700l。超过 700l 继续用同样的过滤芯再次过滤 ； 0094 (10)10000g 离心 15s 使液体通过滤芯 ； 0095 (11)收集滤液， 如果裂解液/乙醇体积多于700l， 继续过滤时用新的收集管， 直 到所有裂解液 / 乙醇混合液过滤完毕， 收集过滤液， 记录体积 ； 0096 (12) 向上一步中收集到的过滤液中加入 2/3 体积的室温无水乙醇 ； 0097 (13) 将过滤液 / 乙醇混合液加入第二个过滤芯中过滤， 弃去过滤液， 每个样本用 一个过滤芯， 将过滤芯放入提。

49、供的收集管中 ； 0098 (14) 用移液管将上步中的混合液移入过滤芯， 一次可容纳体积 700l 时。超过 700l 继续用同样的过滤芯再次过滤 ； 0099 (15)10000g 离心 15s 使液体通过滤芯 ； 0100 (16) 弃去过滤出的液体， 留过滤芯用于下一步洗脱 ； 0101 (17) 向过滤芯中加入 700l 的 miRNA 洗液 1( 工作液中加入乙醇 )， 离心 5-10s， 弃去洗脱出的液体， 收集管继续使用 ； 0102 (18)向过滤芯中加入500l的miRNA洗液2/3(工作液中加入乙醇)， 离心5-10s， 弃去洗脱出的液体 ； 0103 (19) 重复上一步骤 ； 0104 (20) 将过滤芯放入新的收集管 ( 试剂盒。