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1、(10)申请公布号 CN 104313168 A (43)申请公布日 2015.01.28 CN 104313168 A (21)申请号 201410605987.X (22)申请日 2014.10.30 C12Q 1/68(2006.01) (71)申请人 东南大学 地址 214000 江苏省无锡市新区菱湖大道 99 号 (72)发明人 肖鹏峰 潘荣芳 浦丹 (74)专利代理机构 江苏永衡昭辉律师事务所 32250 代理人 王斌 (54) 发明名称 一种引物选择合成测序分析 PCR 产物单体型 的方法 (57) 摘要 本发明采用一种引物选择合成测序分析 PCR 产物单体型的方法对两个或者两个。
2、以上位点变化 （如 SNP， 突变等） 的 PCR 产物 （多个 DNA 模板） 进行 单体型分析， PCR 产物被特定测序引物杂交后分 成两份， 各自加入一种 3 端封闭的单体试剂， 测 序引物在 DNA 模板指导下延伸位点发生变化的一 个碱基后， 该测序引物 3 端被封闭而不能继续延 伸， 然后对未封闭的引物继续合成测序， 得到特定 DNA 模板的序列信息 , 从而确定 PCR 产物的单体 型。 (51)Int.Cl. 权利要求书 2 页 说明书 5 页 序列表 2 页 附图 2 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书2页 说明书5页 序列表2页 附图2。
3、页 (10)申请公布号 CN 104313168 A CN 104313168 A 1/2 页 2 1. 一种引物选择合成测序分析 PCR 产物单体型的方法， 其特征在于 ： 一段核酸序列的 待检样本中含有两个以上的序列变化位点组成的单体型 DNA 模板， 沿着第一个序列变化位 点有选择地限制特定的测序引物进行合成测序， 从而测定相应 DNA 模板的序列， 确定其单 体型， 具体步骤为 ： 步骤一扩增 ： 利用包含一个 5 端修饰活性基团的 PCR 引物， 对待检样本进行扩增 ； 步骤二 DNA 单链制备 ： 将 PCR 产物利用 5 端修饰活性基团与其它经过修饰的载体结 合， 并通过变性将未。
4、固定的 PCR 另一条 DNA 链清除， 获取固定的单链 DNA 模板 ； 步骤三测序引物的杂交 ： 根据检测位点所包含的可能信息， 在PCR单链DNA模板的第一 个分析位点前， 杂交完全互补的测序引物 ； 步骤四测序引物的封闭 ： 根据检测位点所包含的可能信息， 加入一种 3 端封闭的单体 试剂， 测序引物在 DNA 模板指导下延伸位点发生变化的一个碱基后， 该测序引物 3 端被封 闭而不能继续延伸 ； 步骤五测序引物的延伸测序 ： 当测序引物被部分封闭后， 未封闭的测序引物采用现有 技术延伸， 实现对 DNA 模板序列的测定 ； 步骤六 DNA 模板单体型的确定 ： 根据步骤 5） 测序信。
5、息， 辨识出 DNA 模板中序列变化位 点得到碱基信息， 构建 DNA 单体型。 2. 根据权利要求 1 所述的一种 PCR 产物的单体型分析方法， 其特征在于序列变化位点 包括 SNP、 突变、 插入或缺失造成的碱基序列发生变化。 3. 根据权利要求 1 所述的一种 PCR 产物的单体型分析方法， 其特征在于所述 PCR 引物 5 端修饰的活性基团为在热条件下稳定的丙烯酰胺、 生物素或氨基之一， 所述载体为丙烯 酰胺、 表面修饰亲和素或醛基或羧基基团的载体之一， 使得 PCR 引物 5 端修饰的活性基团 能够与载体、 或者载体表面基团发生化学反应而固定到载体上。 4. 根据权利要求 1 所述。
6、的一种 PCR 产物的单体型分析方法， 其特征在于所述 3 端羟基 封闭的单体试剂为 ddNTPs， 3 -O- 烯丙基、 3 -O- 氰乙基、 3 -O- 叠氮甲基修饰的核苷酸之 一。 5. 根据权利要求 1 所述的一种 PCR 产物的单体型分析方法， 其特征在于所述合成测序 包括单核苷酸加入焦磷酸测序、 两核苷酸加入焦磷酸测序， 桑格测序技术， 在焦磷酸测序方 法测定分析序列时， 测序引物经封闭反应后， 其测序反应体系可以直接用于测序反应 ； 而在 使用桑格技术测序时， 应先将测序引物经过封闭反应后的反应液清除， 配制桑格测序反应 液、 使测序引物延伸， 延伸单链产物用于电泳测序分析。 6。
7、. 根据权利要求 1 所述方法分析 MMP7 (U25346) 基因 PCR 产物， 该 PCR 产物包含 A/G (rs11568818) 和 C/T ( rs11568819) 核酸片段的单体型， 具体步骤为 ： a. 将所有需检测的样本处理后提取 DNA 用作扩增模板， PCR 扩增引物为 SEQ ID NO:1， 即 5 -AGTCTACAGAACTTTGAAAGTATGTG-3 和 SEQ ID NO :2， 即 5 -biotin-CTATGAGAGCAGTC ATTTGACTTTG-3 ； b. 将 PCR 扩增产物与亲和素修饰的磁珠反应， 使修饰生物素的 DNA 链固定到磁珠上。
8、， 在 0.2M NaOH 溶液下变性， 将未固定的另一条 DNA 链清除， 然后用洗液洗涤， 得到固定的单 链 DNA 模板， 分成两份用于下列实验 ； c. 将测序引物 SEQ ID NO:3， 即 ： 5 -CTAAAACGAGGAAGTATTACATC-3 与磁珠固定的其中 权 利 要 求 书 CN 104313168 A 2 2/2 页 3 一份单链 DNA 模板进行杂交 ； d. 在焦磷酸测序反应体系中加入 ddATP 使测序引物完成一个碱基延伸 ； e. 将上述 (d) 的反应体系置于焦磷酸测序仪中， 按照指定的核苷酸加入顺序对未封闭 测序引物杂交的 DNA 模板进行序列测定 ;。
9、 f. 按照 (c),(d),(e) 的流程， 将测序引物 SEQ ID NO: 3， 即 ： 5 -CTAAAACGAGGAAGTATTACATC-3 与磁珠固定的第二份单链 DNA 模板杂交， 在焦磷酸测序 反应体系中加入 ddGTP 使测序引物完成一个碱基延伸 , 最后反应体系置于焦磷酸测序仪 中进行序列测定 ; g 根据 (e),(f) 得到的测序信息， 辨识出 DNA 模板中序列变化位点得碱基信息， 构建 DNA 单体型。 权 利 要 求 书 CN 104313168 A 3 1/5 页 4 一种引物选择合成测序分析 PCR 产物单体型的方法 技术领域 0001 本发明涉及生物技术领。
10、域， 尤其涉及一种采用引物选择合成测序分析 PCR 产物单 体型的方法。 背景技术 0002 在分子生物学研究中， DNA 的序列分析是进一步研究和改造目的基因的基础， 对生 命科学至关重要。随着人类基因组计划和各种模式生物基因组计划的开展和完成， 使人类 步入了后基因时代， 分子生物学相关学科得到了迅猛的发展。从基因水平上认识生命的差 异， 疾病发生、 发展的规律， 以及药物与生命体的相互作用将成为可能。 在基础研究方面， 研 究疾病基因的遗传规律， 克隆致病基因 ； 在应用方面， 直接寻找疾病的易感基因突变位点， 可以获得有关与该疾病相关基因型的信息。通过 DNA 序列信息的分析可以为理解。
11、生命的起 源、 疾病发生、 以及个体化医疗等提供有用的相关核酸序列信息。 人的基因组中存在诸多的 基因变异引起的疾病， 如目前已经确定 4000 多种遗传疾病是由单碱基突变引起的， 而一些 重大疾病如癌症、 糖尿病、 心血管疾病、 抑郁症、 哮喘等， 是受众多基因相关。然而基因型的 信息本身是一种低外显度遗传变异， 加上病例 - 对照研究方法的局限性， 可能会出现假阴 性和假阳性结果 ； 另外 , 在预测功能性 SNP 时 , 主要集中在可能引起蛋白质中氨基酸改变 和影响转录调节区活性的位点上 , 这样势必漏掉一些其他重要的功能位点 ,。已有的研究 发现 , 位于同一条染色体上的不同位点基因型。
12、之间不是孤立的， 相邻的等位基因往往倾向 于同时出现。如果相邻的等位基因同时出现的频率超过了随机发生的概率时 , 称为连锁不 平衡， 处于连锁不平衡的、 相邻的 SNP 等位位点也倾向于以一个整体遗传给后代。位于一 条染色体特定区域的一组相互关联并倾向于以整体遗传给后代的基因型 的组合叫作单体 型， 单体型的存在可以极大地减少疾病关联研究的工作量。 0003 目前普遍采用间接的方法则是利用多个基因型的分型结果， 以统计方法推断单体 型， 这种方法得到广泛了的应用， 且用于构建单体型的相关软件也非常之多。然而， 软件分 析的结果对于临床样本而言， 如果得不到直接的实验证实终究是不踏实的， 临床检。
13、测也很 难接受这样的分析结果。 通过实验方法得到自然状态下真实的单体型情况需要进行单分子 测序 ( 如克隆测序、 高通量测序等 )， 这些方法由于成本高， 不适于大规模的个体样本分析。 对于常规 PCR 产物中包含多个 SNP 位点的实验分析单体型方法， 均采用一种等位基因特异 引物 -PCR(AS-PCR) 的方法， 以第一个 SNP 位点为扩增起始点， 用两种特异引物将起始为两 种的不同 DNA 模板分别进行扩增， 然后分别进行测序， 以确定其它 SNP 位点的碱基信息。然 而， 这种方法由于需要等位基因的特异扩增引物， 因而扩增引物的优化设计受到限制， 其扩 增效率会因不同的扩增片段而不。
14、相同， 甚至无法扩增出目的片段， 操作繁琐、 效率不高 ； 同 时需要标记两个特异扩增引物， 费用也不低廉。 0004 现有AS-PCR方法分析单体型是将不同的DNA模板分别扩增， 然后进行序列分析来 实现的。如果能将不同 DNA 模板同时进行 PCR 扩增， 但分别进行测序， 同样可以达到单体型 分析的目的， 且扩增引物可以优化设计， 适合所有两相邻基因型位点间的序列分析。 基于上 说 明 书 CN 104313168 A 4 2/5 页 5 述原理， 本发明提出一种PCR产物的单体型分析方法， 该方法可以设计优化PCR引物扩增需 要分析的核酸序列片段， 然后进行序列分析， 适合任意两 （多。
15、） 位点间的单体型分析， 操作相 对简便， 价格低廉， 可以用于临床检测。 发明内容 0005 本发明所解决的技术问题是 ： 提供一种引物选择合成测序分析 PCR 产物单体型的方法， 当待检样本中含有两个以上 的序列变化位点组成的单体型 DNA 模板时， 沿着第一个序列变化位点有选择地限制特定的 测序引物进行合成测序， 从而测定相应 DNA 模板的序列， 确定其单体型。 0006 为了解决上述技术问题， 本发明所采用的技术方案是 ： 提供一种引物选择合成测序分析 PCR 产物单体型方法， 针对待检样本中一段核酸序列 中含有两个以上的序列变化位点组成的单体型 DNA 模板， 可沿着第一个序列变化。
16、位点有选 择地限制特定的测序引物进行合成测序， 从而测定相应 DNA 模板的序列， 确定其单体型， 具 体步骤为 ： 步骤 1） 扩增 ： 利用包含一个 5 端修饰活性基团的 PCR 引物， 对待检样本进行扩增 ； 步骤 2） DNA 单链制备 ： 将 PCR 产物利用 5 端修饰活性基团与其它经过修饰的载体结 合， 并通过变性将未固定的 PCR 另一条 DNA 链清除， 获取固定的单链 DNA 模板 ； 步骤 3） 测序引物的杂交 ： 根据检测位点所包含的可能信息， 在 PCR 单链 DNA 模板的第 一个分析位点前， 杂交完全互补的测序引物 ； 步骤 4） 测序引物的封闭 ： 根据检测位点。
17、所包含的可能信息， 加入一种 3 端封闭的单体 试剂， 测序引物在 DNA 模板指导下延伸位点发生变化的一个碱基后， 该测序引物 3 端被封 闭而不能继续延伸 ； 步骤 5） 测序引物的延伸测序 ： 当测序引物被部分封闭后， 未封闭的测序引物采用现有 技术延伸， 实现对 DNA 模板序列的测定 ； 步骤 6） DNA 模板单体型的确定 ： 根据步骤 5） 测序信息， 辨识出 DNA 模板中序列变化位 点得到碱基信息， 构建 DNA 单体型。 0007 上述的一种 PCR 产物的单体型分析方法中， 序列变化位点包括 SNP、 突变、 插入或 缺失等造成的碱基序列发生变化。 0008 上述的一种P。
18、CR产物的单体型分析方法中， PCR引物5 端修饰的活性基团是在热 条件下稳定的丙烯酰胺、 生物素或氨基， 所述载体为丙烯酰胺、 表面修饰亲和素或醛基或羧 基基团的载体， 使得 PCR 引物 5 端修饰的活性基团能够与载体、 或者载体表面基团发生化 学反应而固定到载体上。 0009 上述的一种 PCR 产物的单体型分析方法中， 3端羟基封闭的单体试剂包括 ddNTPs， 3 -O- 烯丙基、 3 -O- 氰乙基、 3 -O- 叠氮甲基等修饰的核苷酸 ； 合成测序包括包括 单核苷酸加入焦磷酸测序、 两核苷酸加入焦磷酸测序， 桑格测序技术， 在焦磷酸测序方法测 定分析序列时， 测序引物经封闭反应后。
19、， 其测序反应体系可以直接用于测序反应 ； 而在使用 桑格技术测序时， 应先将测序引物经过封闭反应后的反应液清除， 配制桑格测序反应液、 使 测序引物延伸， 延伸单链产物用于电泳测序分析。 0010 采用一种引物选择合成测序分析PCR产物单体型的方法来分析MMP7 (U25346)基 说 明 书 CN 104313168 A 5 3/5 页 6 因PCR产物， 该PCR产物包含A/G (rs11568818)和C/T ( rs11568819)核酸片段的单体型， 具体步骤为 ： (1)将所有需检测的样本处理后提取DNA用作扩增模板， PCR扩增引物为SEQ ID NO:1， 即 5 -AGTC。
20、TACAGAACTTTGAAAGTATGTG-3 和 SEQ ID NO :2，即 5 -biotin-CTATGAGAGC AGTCATTTGACTTTG-3 ； (2) 将PCR扩增产物与亲和素修饰的磁珠反应， 使修饰生物素的DNA链固定到磁珠上， 在 0.2M NaOH 溶液下变性， 将未固定的另一条 DNA 链清除， 然后用洗液洗涤， 得到固定的单 链 DNA 模板， 分成两份用于下列实验 ； (3) 将测序引物 SEQ ID NO:3， 即 ： 5 -CTAAAACGAGGAAGTATTACATC-3 与磁珠固定的其 中一份单链 DNA 模板进行杂交 ； (4) 在焦磷酸测序反应体系。
21、中加入 ddATP 使测序引物完成一个碱基延伸 ； (5) 将上述 （4）的反应体系置于焦磷酸测序仪 （PSQ 96MA system (Biotage AB, Uppsala, Sweden)） 中， 按照指定的单个核苷酸加入顺序对未封闭测序引物杂交的DNA模板 进行序列测定。 0011 (6) 按 照 (3),(4),(5) 的 流 程，将 测 序 引 物 SEQ ID NO: 3，即 ： 5 -CTAAAACGAGGAAGTATTACATC-3 与磁珠固定的第二份单链 DNA 模板杂交， 在焦磷酸测序 反应体系中加入 ddGTP 使测序引物完成一个碱基延伸 , 最后反应体系置于焦磷酸测序。
22、仪 中进行序列测定。 0012 (7) 根据 (5),(6) 得到的测序信息， 辨识出 DNA 模板中序列变化位点得碱基信息， 构建 DNA 单体型。 0013 本发明的有益效果是 ： 提供了一种引物选择合成测序分析 PCR 产物的单体型的方法对两个或者两个以上位 点变化的 PCR 产物进行单体型分析， PCR 产物被特定测序引物杂交后分成两份， 各自加入一 种 3 端封闭的单体试剂， 测序引物在 DNA 模板指导下延伸位点发生变化的一个碱基后， 该 测序引物 3 端被封闭而不能继续延伸， 然后对未封闭的引物继续合成测序， 得到特定 DNA 模板的序列信息 , 从而确定 PCR 产物的单体型。。
23、 0014 与现有等位基因特异引物-PCR(AS-PCR)技术分析单体型相比， 本发明对PCR引物 没有限制， 可以随意在包含分析片段内的区域设计、 优化 PCR 引物， 对分析的片段区域没有 限制， 并扩增出足够可用于序列测定的 DNA 模板量， 适合所有片段的单体型分析。 0015 附图说明 0016 图1.为一种测序引物选择合成分析PCR产物的单体型分析方法的一般流程。 图中 1 为固相载体， 2 为 PCR 产物 （DNA 模板） ， 3 为互补杂交测序引物。PCR 扩增产物的一条单链 通过与载体 1 结合得到固定、 并变性后制备出单链 DNA 模板 2， 与测序引物 3 杂交 （a）。
24、 ； 加 入 ddATP， 测序引物 3 在 DNA 模板第一个 SNP 位点碱基 T 的指导下发生合成反应 （b） ， 此后， 该测序引物被封闭， 不能继续合成 ； 加入 dNTP 进行焦磷酸测序反应 （c） ， 测序信号均来自含 有 “C” 的 DNA 模板， 当测序测定第二个 SNP 位点的碱基信息时， 便能知道第二个 SNP 位点碱 基与第一个位点碱基 C 的关联， 从而确定单体型。 说 明 书 CN 104313168 A 6 4/5 页 7 0017 图2为MMP7 (U25346)基因PCR产物包含A/G (rs11568818)和C/T ( rs11568819) 核酸片段的测。
25、序结果。 （1） 为单链 PCR 产物与测序引物杂交、 且当测序引物用 ddATP 封闭 后， 按照仪器上编辑程序依次加入单个核苷酸的焦磷酸测序结果， 其序列特征表明 ： 第一个 SNP 位点碱基 G 相关联的第二个 SNP 位点的碱基信息为 T 和 C; （2） 为单链 PCR 产物与测序 引物杂交、 且当测序引物用 ddGTP 封闭后， 按照仪器上编辑程序依次加入单个核苷酸的焦 磷酸测序结果， 其序列特征表明 ： 第一个SNP位点碱基A相关联的第二个SNP位点的碱基信 息为 C， 与 T 无关联。 0018 具体实施方式 0019 下面将结合说明书附图， 对本发明作进一步的说明。 0020。
26、 实 例 1 ： MMP7 (U25346) 基 因 PCR 产 物 包 含 A/G (rs11568818) 和 C/T ( rs11568819) 核酸片段的单体型分析 (1) 将血样本采用传统的蛋白激酶 K 与苯酚 / 氯仿抽提法提取外周血中的基因组 DNA ； (2) 将 PCR 引物 （5 -AGTCTACAGAACTTTGAAAGTATGTG-3 , 5 -biotin-CTATGAGAGC AGTCATTTGACTTTG-3 ， 200 ng 基因组 DNA， 0.2mM dNTP， 1 U Taq DNA 聚合酶 , 1 扩增缓 冲液, 1.8 mM MgCl2的50L PCR。
27、扩增体系进行扩增。 扩增条件为 ： 94起始变性5分钟， 35 个热循环 ： 94变性 30 秒 61退火 45 秒 72延伸 45 秒， 最后 72延伸 7 分钟。 0021 (3) 将 PCR 扩增与亲和素修饰的磁珠反应， 使修饰生物素的 DNA 链固定到磁珠 上， 在 0.2M NaOH 溶液下变性， 将未固定的另一条 DNA 链清除， 然后用洗液 (10 mM Tris Acetate, pH 7.6) 洗涤， 得到固定的单链 DNA 模板， 分成两份用于下列实验 ； (4) ) 将测序引物 （5 -CTAAAACGAGGAAGTATTACATC-3 ） 与磁珠固定的其中一份单链 DN。
28、A 模板模板在反应体系 （(10 mM TrisHCl, 2 M NaCl, 1 mM EDTA( 乙二胺四乙酸钠 ), 0.1% Tween 20, pH 7.6) 80下放置 5 分钟， 然后自然冷却至室温， 完成杂交 ； (5) 在焦磷酸测序反应体系 (0.1 M Tris-Ac (pH 7.7), 2 mM EDTA( 乙二胺四乙酸 钠 ), 10 mM Mg(Ac)2, 0.2% BSA( 小牛血清蛋白 ), 10 mM DTT( 二巯苏糖醇 ), 10 mM APS( 磷酰硫酸腺 ), 0.4 mg/mL PVP( 聚乙烯吡咯烷酮 ), 4 mM D-luciferin( 虫荧光素。
29、 ), 2 U/mL ATP sulfurylase( 三磷酸腺苷硫酸化酶 ), 0.4 mM luciferase ( 荧光素酶 ), 2 U/mL apyrase VII(三磷酸腺苷双磷酸酶VII), 2 U/mL DNA聚合酶 I (Klenow fragment, exo) 中加入 ddATP 使测序引物在室温下完成一个碱基延伸 ； (6) 将上述 （5）的反应体系置于焦磷酸测序仪 （PSQ 96MA system (Biotage AB, Uppsala, Sweden)） 中， 按照仪器上编辑程序依次加入单个核苷酸对未封闭测序引物在 DNA 模板指导下进行合成测序。得到图 2（1）。
30、 中的图谱， 根据系列特征可以得出， 第一个 SNP 位 点碱基 G 相关联与第二个 SNP 位点的碱基 T 和 C 均由关联。 0022 (7) 按照 (4),(5),(6) 的流程， 将测序引物 （5 -CTAAAACGAGGAAGTATTACATC-3 ） 与磁珠固定的第二份单链 DNA 模板模板杂交， 在焦磷酸测序反应体系中加入 ddGTP 使测序 引物完成一个碱基延伸 , 最后反应体系置于焦磷酸测序仪中， 按照仪器上编辑程序依次加 入单个核苷酸， 对未封闭测序引物在 DNA 模板指导下进行合成测序。得到图 2（2） 中的图 谱， 根据序列特征可以得出， 第一个 SNP 位点碱基 A 。
31、相关联的第二个 SNP 位点的碱基信息为 说 明 书 CN 104313168 A 7 5/5 页 8 C， 与 T 无关联。 0023 (8) 根据图 2 中的图谱， 构建出的 DNA 单体型为下列三种 ： 单体型 1（SEQ ID NO:4) ： 5 GTTATTGGCAGGAAGCACACAATGTATTTGTCTTTCAAA-3 单体型 2（SEQ ID NO:5): 5 GTTATTGGCAGGAAGCACACAATGTATTCGTCTTTCAAA-3 单体型 3（SEQ ID NO:6) : 5 -ATTATTGGCAGGAAGCACACAATGTATTCGTCTTTCAAA-3 。
32、以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点。 本行业的技术人员 应该了解， 本发明不受上述实施例的限制， 上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明 的原理， 在不脱离本发明精神和范围的前提下， 本发明还会有各种变化和改进， 这些变化和 改进都落入要求保护的本发明范围内。 本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效 物界定。 说 明 书 CN 104313168 A 8 1/2 页 9 0001 0002 序 列 表 CN 104313168 A 9 2/2 页 10 序 列 表 CN 104313168 A 10 1/2 页 11 图 1 说 明 书 附 图 CN 104313168 A 11 2/2 页 12 图 2 说 明 书 附 图 CN 104313168 A 12 。