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1、(10)申请公布号 CN 104073500 A (43)申请公布日 2014.10.01 CN 104073500 A (21)申请号 201310109889.2 (22)申请日 2013.03.29 C12N 15/12(2006.01) C12N 15/10(2006.01) C12Q 1/68(2006.01) (71)申请人 中国农业大学 地址 100193 北京市海淀区圆明园西路 2 号 (72)发明人 李宁 任立明 陈志胜 胡晓湘 (74)专利代理机构 北京路浩知识产权代理有限 公司 11002 代理人 王朋飞 张庆敏 (54) 发明名称 一种筛选与 PRRSV 感染和抗性相关。
2、的基因的 方法 (57) 摘要 本发明提供了一种利用高通量测序结合生物 信息学的方法筛选与蓝耳病毒 （PRRSV） 感染和抗 性相关的基因的方法， 所述方法包括 （1） 样品挑 选 ；（2）提取样品总 RNA ；（3） Solexa 文库构建 ； （4） 测序 ；（5） FASTX 检测过滤低质量 Reads ；（6） BWA0.5.8 将 Reads 比对猪基因组， 并计算每个基 因的表达量 ；（7） DEGseq 软件分析差异表达基因 ； （8） 与 PRRSV 感染和抗性相关基因的获取。本发 明的筛选与 PRRSV 感染和抗性相关的基因的方法 为深入理解 PRRSV 对于猪的治病分子机制。
3、提供了 重要的信息， 并在此基础之上为寻找防治和治疗 蓝耳病的新靶点提供了新的方法， 继而为进一步 研究蓝耳病的新的防治方法奠定了基础。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 6 页 附图 1 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书6页 附图1页 (10)申请公布号 CN 104073500 A CN 104073500 A 1/1 页 2 1. 一种筛选与 PRRSV 感染和抗性相关的基因的方法， 其特征在于， 所述方法包括如下 步骤 ： （1） 样品挑选 ： 选取两个品种的对蓝耳病有抗性差异的 35 日龄猪， 分别取两个品种猪 。
4、在未感染 PRRSV 前的组织样和感染 PRRSV 后第 5 天的组织样， 各组织样均存放在 RNA 保存 液 RNAlater 中 ； （2） 提取样品总 RNA ： 提取 RNA 保存液 RNAlater 中的各组织样的总 RNA ； （3） Solexa 文库构建 ： 从总 RNA 中纯化 mRNA， 合成双链 cDNA 片段并进行纯化 ； （4） 测序 ： 将各组织样的 cDNA 片段用 cluster station 放入芯片中进行扩增， 然后用 genome analyzer II 进行 pair-end 测序 ； （5） 利用 FASTX 检测过滤低质量 Reads ； （6） 。
5、利用BWA0.5.8将Reads比对猪基因组， 对单一比对上的序列进行注释， 并计算每个 基因的表达量， 基因表达量用 RPKM 值表示， 计算公式为 ： RPKM= 比对上的 reads 数 / 总 reads 数 / 基因长度 109； （7）利 用 DEGseq 软 件 分 析 差 异 表 达 基 因，符 合 P 0.001， FDR 0.001， |log2foldchange| 1 则为差异显著 ； （8） 与 PRRSV 感染和抗性相关基因的获取 ： 根据上一步标准所筛得的差异表达基因， 获 得两个品种感染前和感染后第5天的差异显著基因交集a和感染前两个品种间的差异表达 基因集 b。
6、， a 与 b 的交集的基因即为与 PRRSV 感染和抗性相关的候选基因。 2. 根据权利要求 1 所述的方法， 其特征在于， 步骤 （1） 中选取两个品种的对蓝耳病有抗 性差异的 35 日龄长白猪和通城猪各 6 头， 隔离饲养， 分别取两个品种猪在未感染 PRRSV 前 的肺组织样， 每个品种猪取 3 头， 然后将剩余的两个品种猪接种蓝耳病毒， 在感染 PRRSV 后 第 5 天取肺组织样， 每个品种猪取 3 头， 各肺组织样均存放在 RNA 保存液 RNAlater 中。 3. 根据权利要求 1 所述的方法， 其特征在于， 步骤 （2） 中用 trizol RNA 提取试剂提 取各组织样的。
7、总 RNA， 并用 Nanodrop2000 检测， 选取 OD260/280=1.8 2.2， OD260/230 2.0， 28S:18S1.0， 23S:16S1.0， 密度400ng/ul的总RNA， 将相同品种的3个个体的总RNA 混合。 4. 根据权利要求 1 所述的方法， 其特征在于， 步骤 （3） Solexa 文库构建的方法包括如 下步骤 ： （A1） 从 10ug 总 RNA 中用连接有 poly-T 的磁性小珠纯化 mRNA ； （A2） 预热 PCR 仪到 94 C， 将纯化的 mRNA 与反应混合液共 20ul 放入 PCR 管中， 在 PCR 仪上 94 C 加热 。
8、5 分钟， 切断 mRNA ； （A3） 用反转录酶和随机引物将切断的 mRNA 反转成第一链 cDNA， 去除第一链 cDNA 中的 RNA， 合成双链 cDNA 分子 ； （A4） 用 T4DNA 聚合酶和 klenow 聚合酶修复 cDNA 分子的粘膜端， 形成平末端 cDNA 分 子， 在补平的 cDNA 分子 3 平末端加一个腺苷酸 A， 并连接上具有 T 末端的接头 ； （A5） 电泳并回收纯化上述反应产物， PCR 反应扩增纯化的 cDNA 片段。 5. 根据权利要求 1 所述的方法， 其特征在于， 步骤 （5） 中， 过滤掉质量小于 20、 碱基的 总数目小于整个 reads 。
9、总数目的 50% 的 reads。 权 利 要 求 书 CN 104073500 A 2 1/6 页 3 一种筛选与 PRRSV 感染和抗性相关的基因的方法 技术领域 0001 本发明涉及生物技术领域， 特别涉及一种利用高通量测序结合生物信息学的方法 筛选与蓝耳病毒 （PRRSV） 感染和抗性相关的基因的方法。 背景技术 0002 目前猪呼吸与繁殖系统综合征 （PRRS) 最早出现在 20 世纪八十年代中期的美国， 随后欧洲也被发现， 最初病因不明确， 被称作神秘猪病， 因为该病会引起病猪四肢末端充 血， 耳朵发蓝， 又叫蓝耳病。该病临床症状表现为母猪流产， 木乃伊胎， 死胎， 育成猪生长 发。
10、育缓慢， 间质性肺炎等。1991 年荷兰首先从病猪身上分离出了一种 RNA 病毒 Lelystad Virus（I 型蓝耳病毒） ， 同时美国分离出了另一种病毒 VR-2332(II 型蓝耳病毒 )， 从而明确 了该病的致病原因是由一种病毒引起的。中国大陆在 1996 年首次发现蓝耳病， 到 2006 年 在全中国又爆发了一场大规模的高热病， 感染了 200 万以上头造成大约 40 万死亡， 而且不 同于传统的蓝耳病毒， 该病毒还感染了大量的成年母猪， 后证实该病是由一种高致病性的 蓝耳病毒引起的， 是一种变异的II型蓝耳病毒， 与一种中国的蓝耳病病毒亚型HB-1高度同 源， 该病毒有一个特点。
11、是在非结构蛋白 2（NSP2） 区有一个不连续的 20 个氨基酸的缺失。 0003 病毒的靶细胞主要是肺泡巨噬细胞或者单核细胞来源的树突状细胞。感染 PRRSV 后， 不能引起有效的免疫应答， 感染初期产生的抗体不具备中和抗体的效果， 而且病毒可能 会借助抗体进入细胞， 形成抗体依赖的增强效应， 从而促进病毒的扩散。 体内和体外细胞实 验证实病毒感染后引起非典型的天然免疫应答效应 ： I 型干扰素 IFN-alfa， TFN-alfa 的表 达受到抑制， 白细胞介素 -10（IL-10） 表达量升高， 从而引起病毒免疫抑制和持续感染。感 染 PRRSV 后在 2-3 周以后才能引起细胞免疫反应。
12、， 而且检测到的免疫细胞同其他病毒如伪 狂犬病毒相比较少， 同时产生的 CD3CD8high 细胞不具有杀伤细胞活性， 从而可能不能及时 清除体内的病毒。 蓝耳病毒的突变率很高， 类型多， 目前的疫苗的效果有限而且弱毒苗具有 反强的危险性， 在防治上比较困难， 急需寻找一种新的方法来弥补传统方法的不足。 有报道 用 RNAi 的方法， 设计针对 PRRSV 的 shRNA 可以在体内和体外抑制 PRRSV 的增殖， 也有研究 用干扰素可以抑制 PRRSV 在体外细胞 MRAC-145 上的复制。不同的个体和品种对 PRRSV 的 抗性也有差异。 0004 高通量第二代测序方法 （如 ： Ill。
13、umina s Genome Analyzer II)， 具有识别单个碱 基变异的高分辨率， 运用 pair-end 方法可以提高测序的效率和 reads 的长度， 通过把测序 的 Reads 比对到参考基因组上， 高通量测序方法可以更准确地提高基因组的注释信息， 识 别非转录区， 新转录本和可变剪接， 也可以分析基因表达差异信息。 0005 如果能够得知与蓝耳病毒感染相关或抗性有关的基因， 就能得到治疗和防治蓝耳 病的新的靶点， 继而进一步得到多种防治蓝耳病的方法， 但是至今鲜有运用高通量测序方 法来分析筛选与蓝耳病毒感染和抗性有关的基因的报道。 发明内容 说 明 书 CN 10407350。
14、0 A 3 2/6 页 4 0006 本发明的目的是提供一种筛选与蓝耳病毒 （PRRSV） 感染和抗性相关的基因的方 法， 从而为治疗和防治蓝耳病寻找新的靶点。 0007 具体的， 本发明的目的是提供一种利用高通量测序结合生物信息学的方法筛选与 PRRSV 感染和抗性相关的基因的方法， 利用所述方法分析感染前后和不同品种间的差异基 因， 继而筛选得到一些与 PRRSV 感染和抗性相关的基因。 0008 本发明的筛选与 PRRSV 感染和抗性相关的基因的方法， 包括如下步骤 ： 0009 （1） 样品挑选 ： 选取两个品种的对蓝耳病有抗性差异的 35 日龄猪， 分别取两个品 种猪在未感染 PRR。
15、SV 前 （第 0 天） 的组织样和感染 PRRSV 后第 5 天的组织样， 各组织样均存 放在 RNA 保存液 RNAlater 中 ； 0010 （2） 提取样品总 RNA ： 提取 RNA 保存液 RNAlater 中的各组织样的总 RNA ； 0011 （3） Solexa 文库构建 ： 从总 RNA 中纯化 mRNA， 合成双链 cDNA 片段并进行纯化 ； 0012 （4） 测序 ： 将各组织样的 cDNA 片段用 cluster station 放入芯片 （Flow cell） 中 进行扩增， 然后用 genome analyzer II 进行 pair-end 测序 ； 001。
16、3 （5） 利用 FASTX 检测过滤低质量 Reads ； 0014 （6） 利用BWA0.5.8将Reads比对猪基因组， 对单一比对上的序列进行注释， 并计算 每个基因的表达量， 基因表达量用 RPKM 值表示， 计算公式为 ： 0015 RPKM= 比对上的 reads 数 / 总 reads 数 / 基因长度 109 0016 （7）利 用 DEGseq 软 件 分 析 差 异 表 达 基 因， 符 合 P 0.001， FDR 0.001， |log2foldchange| 1 则为差异显著 ； 0017 （8） 与 PRRSV 感染和抗性相关基因的获取 ： 根据上一步标准所筛得的。
17、差异表达基 因， 获得两个品种感染前和感染后第 5 天的差异显著基因交集 a（即 C0C5 的差异显著基因 和 T0T5 的差异显著基因交集为 a） 和感染前两个品种间的差异表达基因集 （即 C0T0 差异显 著基因） b， a 与 b 的交集的基因即为与 PRRSV 感染和抗性相关的候选基因。 0018 优选地， 步骤 （1） 中选取两个品种的对蓝耳病有抗性差异的 35 日龄长白猪和通城 猪各 6 头， 隔离饲养， 分别取两个品种猪在未感染 PRRSV 前 （第 0 天） 的肺组织样， 每个品种 猪取 3 头， 然后将剩余的两个品种猪接种蓝耳病毒， 在感染 PRRSV 后第 5 天取肺组织样。
18、， 每 个品种猪取 3 头， 各肺组织样均存放在 RNA 保存液 RNAlater 中。 0019 优 选 地， 步 骤 （2）中 用 trizol RNA 提 取 试 剂 提 取 各 组 织 样 的 总 RNA， 并 用 Nanodrop2000 检 测， 选 取 OD260/280=1.8 2.2， OD260/230 2.0， 28S:18S 1.0， 23S:16S 1.0， 密度 400ng/ul 的总 RNA， 将相同品种的 3 个个体的总 RNA 混合。 0020 优选地， 步骤 （3） Solexa 文库构建的方法为 illumina 平台测序常规建库方法， 具 体为 ： 00。
19、21 （A1） 从 10ug 总 RNA 中用连接有 poly-T 的磁性小珠纯化 mRNA ； 0022 （A2） 预热 PCR 仪到 94 C， 将纯化的 mRNA 与反应混合液共 20ul 放入 PCR 管中， 在 PCR 仪上 94 C 加热 5 分钟， 切断 mRNA ； 0023 （A3） 用反转录酶和随机引物将切断的 mRNA 反转成第一链 cDNA， 去除第一链 cDNA 中的 RNA， 合成双链 cDNA 分子 ； 0024 （A4） 用 T4DNA 聚合酶和 klenow 聚合酶修复 cDNA 分子的粘膜端， 形成平末端 cDNA 分子， 在补平的 cDNA 分子 3 平末。
20、端加一个腺苷酸 A， 并连接上具有 T 末端的接头 ； 说 明 书 CN 104073500 A 4 3/6 页 5 0025 （A5） 电泳并回收纯化上述反应产物， PCR 反应扩增纯化的 cDNA 片段。 0026 步骤 （A5） 中反应产物约为 200bp。 0027 优选地， 步骤 （5） 中， 过滤掉质量小于 20、 碱基的总数目小于整个 reads 总数目的 50% 的 reads。 0028 优选地， 步骤 （6） 中猪基因组序列在 NCBI 或 GenBank 上的版本号 Sscrofa10.2。 0029 其中， 步骤 （8） 中 a 为两个品种感染前后的差异显著基因的交集，。
21、 其为感染 PRRSV 后对宿主与病毒互作参与了重要生物学功能的基因 ； b 为感染前两个品种间的差异基因， 抗性差异是两个品种在感染前本底基因的表达差异造成的， 感染前品种间的差异基因造成 了抗性的差异 ； a 与 b 的交集为既在感染前后有显著差异表达， 又在感染前两个品种间有差 异表达的基因， 其为参与 PRRSV 感染和抗性相关的重要基因。 0030 本发明的筛选与 PRRSV 感染和抗性相关的基因的方法利用高通量测序结合生物 信息学的方法， 为寻找防治和治疗蓝耳病的新靶点提供了新的方法， 继而为进一步研究蓝 耳病的新的防治方法奠定了基础。利用本发明方法不仅可以快速、 高效的找到与 P。
22、RRSV 致 病的相关基因和潜在的防治和治疗蓝耳病的新的靶基因， 而且还可以发现新的参与 PRRSV 致病过程的分子， 为更深入的理解 PRRSV 致病机理提供了重要的指导信息。 附图说明 0031 图 1 为两个品种感染前后的差异显著基因 ； 0032 图 2 为感染前 （第 0 天） 两个品种间的差异显著基因。 0033 其中， -3.00、 -2.00、 -1.00、 0.00、 1.00、 2.00、 3.00 表示标准化后的相对表达值。 具体实施方式 0034 以下实施例用于说明本发明， 但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神 和实质的情况下， 对本发明方法、 步骤或条件所作的。
23、修改或替换， 均属于本发明的范围。 0035 若未特别指明， 本发明实施例中所用的实验材料、 生化试剂和仪器等均可市售获 得， 实施例中所用的技术手段均为本领域技术人员所熟知的常规手段。 0036 1、 实验材料 0037 长白和通城猪各 6 头 ； 0038 105TCID50/ml 的 wuhan-3 高致病性蓝耳病毒 （来自华中农业大学陈淑君老师实验 室） 0039 2、 实验试剂 0040 RNA 保存液 RNAlater 购自 Life Technologies 公司 ； 0041 Trizol RNA 提取试剂购自 invitrogen 公司， 货号为 15596-026 ； 00。
24、42 DEPC 水 ： 去离子水中加入 0.1%DEPC， 37过夜， 高压灭菌 ； 0043 RNA 操作所用枪头、 离心管经 0.1%DEPC 水浸泡过夜， 去离子水冲洗 2-3 遍， 高压灭 菌 ； 0044 RNA 操作所用 75% 乙醇 ： 以 DEPC 处理的水配制乙醇 ； 0045 mRNA Solexa 测序文库构建试剂盒购自 Illumina 公司。 0046 3、 实验仪器及软件 说 明 书 CN 104073500 A 5 4/6 页 6 0047 高通量测序仪 Genome Analyser II 购自 Illumina 公司 ； 0048 生物信息分析软件如下 ： 0。
25、049 数据质量评估软件 ： FASTX 0050 http:/hannonlab.cshl.edu/fastx_toolkit/download.html ； 0051 测序 Reads mapping 软件 BWA0.5.8 0052 http:/ ； 0053 差异基因表达分析软件 DEGseq 0054 http:/www.bioconductor.org/packages/2.10/bioc/html/DEGseq.html。 0055 实施例 1 0056 （1） 样品挑选 ： 选取两个品种的对蓝耳病有抗性差异的 35 日龄长白猪和通城猪各 6 头， 隔离饲养， 分别在两个品种猪未。
26、感染 PRRSV 前 （第 0 天） 先宰杀每个品种猪各 3 头， 并 取其肺组织样， 存放在RNA保存液RNAlater中， 作为对照， 然后将剩余的两个品种猪分别皮 下静脉注射接种 5ml105TCID50/ml 的 wuhan-3 高致病性蓝耳病毒 （来自华中农业大学陈淑 君老师实验室） ， 每天测量体温， 并观察记录临床症状， 在感染 PRRSV 后第 5 天宰杀感染猪， 取各肺组织样， 每个品种猪各取 3 头， 保存在 RNA 保存液 RNAlater 中。 0057 其中， C0,C5,T0,T5 分别表示未感染 PRRSV 前 （第 0 天） 的长白猪， 感染 PRRSV 后第 。
27、5 天的长白猪， 未感染 PRRSV 前 （第 0 天） 通城猪， 感染 PRRSV 后第 5 天的通城猪。 0058 （2）提取样品总 RNA ： 将 RNA 保存液 RNAlater 中的各肺组织样取出， 用 trizol RNA 提取试剂提取各组织样的总 RNA， 并用 Nanodrop2000 检测， 选取 OD260/280=1.8 2.2， OD260/230 2.0， 28S:18S 1.0， 23S:16S 1.0， 密度 400ng/ul 的总 RNA， 将相同品种的 3 个个体的总 RNA 混合。 0059 （3） 按 illumina 平台测序常规建库方法进行 Solex。
28、a 文库构建 ： 0060 （A1） 从 10ug 总 RNA 中用连接有 poly-T 的磁性小珠纯化 mRNA ； 0061 （A2） 预热 PCR 仪到 94 C， 将纯化的 mRNA 与反应混合液共 20ul 放入 PCR 管中， 在 PCR 仪上 94 C 加热 5 分钟， 切断 mRNA ； 0062 （A3） 用反转录酶和随机引物将切断的 mRNA 反转成第一链 cDNA， 去除第一链 cDNA 中的 RNA， 合成双链 cDNA 分子 ； 0063 （A4） 用 T4DNA 聚合酶和 klenow 聚合酶修复 cDNA 分子的粘膜端， 形成平末端 cDNA 分子， 在补平的 c。
29、DNA 分子 3 平末端加一个腺苷酸 A， 并连接上具有 T 末端的接头 ； 0064 （A5） 2% 琼脂糖凝胶电泳上述反应产物， 回收 200bp 左右的 cDNA 分子并进行纯化， PCR 反应扩增纯化的 cDNA 片段。 0065 跑琼脂糖胶电泳检测最终产物的大小和浓度。 0066 （4） 测序 ： 将各样品的 cDNA 片段用 cluster station 放入芯片 （Flow cell） 中进 行扩增， 然后用 Illuminagenome analyzer II 进行 pair-end 常规测序 ； 0067 （5） 利用 FASTX 检测过滤低质量 Reads ： 过滤掉质量。
30、小于 20、 碱基的总数目小于整 个 reads 总数目的 50% 的 reads。 0068 （6） 利用 BWA0.5.8 将 Reads 比对猪基因组， 猪基因组序列在 NCBI 或 GenBank 上的 版本号 Sscrofa10.2， 测序 Reads 比对结果和预测的基因数目如表 1 所示， 对单一比对上的 序列进行注释， 并计算每个基因的表达量， 基因表达量用 RPKM 值表示， 计算公式为 ： 说 明 书 CN 104073500 A 6 5/6 页 7 0069 RPKM= 比对上的 reads 数 / 总 reads 数 / 基因长度 109 0070 表 1 测序 Rea。
31、ds 比对结果和预测的基因数目 0071 0072 （7）利 用 DEGseq 软 件 分 析 差 异 表 达 基 因， 符 合 P 0.001， FDR 0.001， |log2foldchange| 1 则为差异显著 ； 0073 （8） 与 PRRSV 感染和抗性相关基因的获取 ： 根据上一步标准所筛得的差异表达基 因， 获得两个品种感染前后的差异显著基因的交集 a 和感染前两个品种间的差异显著基因 集 b， a 与 b 的交集的基因即为与 PRRSV 感染和抗性相关的基因， 其中， C0C5 差异显著基因 4281 个， T0T52127 个， 两者交集 a 为 1610 个， C0T。
32、0 差异显著基因 b 为 828 个， a 与 b 的交 集为 282 个， 选取 a 与 b 交集的基因差异倍数在前 20 的共有差异显著基因作为与 PRRSV 感 染和抗性最相关的候选基因， 符合所述标准的 6 个基因如表 2 所示。 0074 其中， a 为两个品种感染前后的差异显著基因的交集， 即 C0C5 差异显著基因和 T0T5 差异显著基因所共有的差异显著基因， 如图 1 所示， a 为感染 PRRSV 后对宿主与病毒互 作参与了重要生物学功能的基因 ； b 为感染前两个品种间的差异显著基因即 C0T0 差异显著 基因， 如图 2 所示， 抗性差异是两个品种在感染前本底基因的表达。
33、差异造成的， 感染前品种 间的差异基因造成了抗性的差异 ； a 与 b 的交集为既在感染前后有显著差异表达， 又在感染 前两个品种间有差异表达的基因， 其为参与 PRRSV 感染和抗性相关的重要基因。 0075 表 2 符合标准的 6 个基因 0076 说 明 书 CN 104073500 A 7 6/6 页 8 0077 虽然， 上文中已经用一般性说明、 具体实施方式及试验， 对本发明作了详尽的描 述， 但在本发明基础上， 可以对之作一些修改或改进， 这对本领域技术人员而言是显而易见 的。 因此， 在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进， 均属于本发明要求保护的 范围。 说 明 书 CN 104073500 A 8 1/1 页 9 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 104073500 A 9 。