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1、(10)申请公布号 CN 104095857 A (43)申请公布日 2014.10.15 CN 104095857 A (21)申请号 201410304395.4 (22)申请日 2014.06.27 A61K 31/56(2006.01) A61P 1/16(2006.01) C07J 63/00(2006.01) (71)申请人 南京大学 地址 210093 江苏省南京市汉口路 22 号 (72)发明人 皋林 黄蓉 吴俊艺 吴俊华 (74)专利代理机构 江苏银创律师事务所 32242 代理人 何震花 (54) 发明名称 闭花木酮 Cleistanone 的二乙胺衍生物在制 备抗肝纤维化。
2、药物中的应用 (57) 摘要 本发明涉及有机合成和药物化学领域， 具体 涉及闭花木酮 Cleistanone 衍生物、 制备方法及 其在制备抗肝纤维化药物上的用途。本发明合成 了一个新的闭花木酮 Cleistanone 衍生物， 并公 开了其制备方法。药理学实验表明， 本发明的闭 花木酮 Cleistanone 衍生物具有抗肝纤维化的作 用， 具有开发抗肝纤维化药物的价值。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 6 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书6页 (10)申请公布号 CN 104095857 A CN 104095857。
3、 A 1/1 页 2 1.一种具有式III所示结构的闭花木酮Cleistanone衍生物(III)及其药学上可接受 的盐在治疗肝纤维化药物中的应用 ： 2.如权利要求1所述的闭花木酮Cleistanone衍生物(III)及其药学上可接受的盐在 治疗肝纤维化药物中的应用， 其特征为抑制成纤维细胞增殖。 3.如权利要求1所述的闭花木酮Cleistanone衍生物(III)及其药学上可接受的盐在 治疗肝纤维化药物中的应用， 其特征为抑制生长因子诱导的成纤维细胞增殖。 4.如权利要求3所述的闭花木酮Cleistanone衍生物(III)及其药学上可接受的盐在 治疗肝纤维化药物中的应用， 其特征为所述生。
4、长因子为 TGF-1。 权 利 要 求 书 CN 104095857 A 2 1/6 页 3 闭花木酮 Cleistanone 的二乙胺衍生物在制备抗肝纤维化 药物中的应用 技术领域 0001 本发明涉及有机合成和药物化学领域， 具体涉及闭花木酮 Cleistanone 衍生物、 制备方法及其用途。 背景技术 0002 肝纤维化是慢性肝损伤向肝硬化发展的动态过程， 表现为细胞外基质 (ECM) 大量 合成、 分泌， 而降解绝对或相对不足， 使ECM在肝脏内弥漫沉积。 其起始于肝细胞(HC)坏死， 随之是炎症反应、 纤维生成介质释放， 肝星状细胞 (FSC) 激活， 最终以肝脏结缔组织成分的 合。
5、成与降解明显失去平衡。肝纤维化是多种慢性肝病共同的病理过程， 是影响预后的重要 因素。 0003 过去的 20 年间， 肝纤维化的研究取得了长足进展， 证实肝纤维化与一定程度的肝 硬化都是可逆的。近年来陆续出现了一些抗肝纤维化治疗方法， 包括化学药、 生物制剂、 中 药与基因疗法等， 但是理想的临床治疗手段仍然缺乏 ( 刘平 . 加强抗肝纤维化作用机制的 研究.中华肝病杂志， 2005,8(13) ： 561)。 目前防治肝纤维的关键是针对与肝星状细胞激活 相关的环节， 主要是 ： 减轻肝损伤 ； 抑制星状细胞激活， 减少细胞外基质产生 ； 调节细胞因 子紊乱， 促进活化肝星状细胞凋亡 ； 抑。
6、制肝脏成纤维细胞的增殖以及星状细胞激活大量分 泌诱导肝脏成纤维细胞的增殖。 0004 从天然产物中寻找化合物或先导化合物并进行结构修饰获得其衍生物， 从而得到 高效低毒的潜在药物最有重要价值。 0005 本发明涉及的化合物闭花木酮 Cleistanone 是一个 2011 年发表 (Van Trinh Thi Thanh et al.,2011.Cleistanone:A Triterpenoid from Cleistanthus indochinensis with a New Carbon Skeleton.Volume2011,Issue22,pages41084111,August2。
7、011) 的 化合物， 我们对化合物闭花木酮 Cleistanone 进行了结构修饰， 获得了一个新的闭花木酮 Cleistanone 衍生物， 并对其抗肝纤维化活性进行了评价， 其具有抗肝纤维化活性。 0006 由于肝脏星状细胞的激活， 从而引起了多种生长因子的大量分泌， 这些生长因子 会诱导肝脏成纤维细胞的快速增殖， 从而加速纤维化， 其中最重要的生长因子之一就是 TGF。 因此， 筛选抗肝纤维化药物的一个重要思路就是筛选能够抑制肝脏成纤维细胞增殖的 药物或者筛选能够抑制 TGF 等生长因子诱导的成纤维细胞的增殖， 筛选常常在成纤维细胞 上进行， NIH/3T3 细胞是最常用的细胞株。 发。
8、明内容 0007 本发明公开了一个闭花木酮 Cleistanone 衍生物， 其结构为 ： 0008 说 明 书 CN 104095857 A 3 2/6 页 4 0009 本发明闭花木酮 Cleistanone 衍生物 (III) 可通过下面方法制备 ： 0010 (1) 闭花木酮 Cleistanone(I) 与 1,2- 二溴乙烷反应得到闭花木酮 Cleistanone 的 O- 溴乙基衍生物 (II) ； 0011 (2) 闭花木酮 Cleistanone 的 O- 溴乙基衍生物 (II) 与二乙胺发生取代反应制得 闭花木酮 Cleistanone 衍生物 (III)。 0012 00。
9、13 0014 进一步的闭花木酮 Cleistanone 衍生物 (III) 的制备方法为 ： 0015 (1) 将 440mg 化合物闭花木酮 Cleistanone(I) 溶于 10mL 苯， 向溶液中加入 0.04g 的四丁基溴化铵， 3.760g 的 1,2- 二溴乙烷和 6mL 的 50氢氧化钠溶液 ； 混合物在 25 摄氏 度搅拌 24h ； 24h 之后将反应液倒入冰水中， 立即用二氯甲烷萃取两次， 合并有机相溶液 ； 然 后对有机相溶液依次用水和饱和食盐水洗涤 3 次， 再用无水硫酸钠干燥， 最后减压浓缩去 说 明 书 CN 104095857 A 4 3/6 页 5 除溶剂得。
10、到产物粗品 ； 产物粗品用硅胶柱层析纯化， 流动相为 ： 石油醚/丙酮100:1， v/v， 收集黄色集中洗脱带即得到闭花木酮 Cleistanone 的 O- 溴乙基衍生物 (II) 的黄色固体。 0016 (2)将273mg的闭花木酮Cleistanone的O-溴乙基衍生物溶于20mL乙腈当中， 向 其中加入 345mg 的无水碳酸钾， 84mg 的碘化钾和 1460mg 的二乙胺， 混合物加热回流 8h ； 反 应结束后将反应液倒入冰水中， 用等量二氯甲烷萃取三次， 合并有机相 ； 依次用水和饱和食 盐水洗涤合并之后的有机相， 再用无水硫酸钠干燥， 减压浓缩去除溶剂得到产物粗品 ； 产物。
11、 粗品用硅胶柱层析纯化， 流动相为 ： 石油醚 / 丙酮 100:1， v/v， 收集淡黄色集中洗脱带即 得到闭花木酮 Cleistanone 衍生物 (III) 的淡黄色胶状固体。 0017 本发明公开的化合物可以制成药学上可接受的盐或药学上可接受的载体。 0018 药效学实验表明， 本发明的闭花木酮 Cleistanone 衍生物 (III) 具有较好的抗肝 纤维化作用。本发明的药学上可接受的盐与其化合物具有同样的药效。 0019 进一步的， 化合物III的体外实验表明， 化学物III具有很强的抗成纤维细胞增殖 的活性， 因此本发明的化学物 III 有望被用于制备新型抗肝纤维化药物。 00。
12、20 进一步的， 化合物III的体外实验表明， 化合物III具有很强的抗生长因子诱导的 成纤维细胞增殖的活性， 化合物 III 是一个极具开发潜力的化合物 , 它可直接用于相应疾 病的治疗以及相关药物的制备。 0021 以下通过实施例对本发明作进一步详细的说明， 但本发明的保护范围不受具体实 施例的任何限制， 而是由权利要求加以限定。 具体实施方式 0022 实施例 1 化合物闭花木酮 Cleistanone 的制备 0023 化 合 物 闭 花 木 酮 Cleistanone(I) 的 制 备 方 法 参 照 Van Trinh Thi Thanh 等 人 发 表 的 文 献 (Van Tr。
13、inh Thi Thanh et al.,2011.Cleistanone:A Triterpenoid from Cleistanthus indochinensis with a New Carbon Skeleton. Volume2011,Issue22,pages41084111,August2011) 的方法。 0024 0025 实施例 2 闭花木酮 Cleistanone 的 O- 溴乙基衍生物 (II) 的合成 0026 将化合物 I(440mg， 1.00mmol) 溶于 10mL 苯， 向溶液中加入四丁基溴化铵 (TBAB) (0.04g)， 1,2-二溴乙烷(3.760。
14、g， 20.00mmol)和6mL的50氢氧化钠溶液。 混合物在25摄 氏度搅拌 24h。24h 之后将反应液倒入冰水中， 立即用二氯甲烷萃取两次， 合并有机相溶液。 然后对有机相溶液依次用水和饱和食盐水洗涤 3 次， 再用无水硫酸钠干燥， 最后减压浓缩 去除溶剂得到产物粗品。产物粗品用硅胶柱层析纯化 ( 流动相为 ： 石油醚 / 丙酮 100:1， 说 明 书 CN 104095857 A 5 4/6 页 6 v/v)， 收集黄色集中洗脱带即得到化合物 II 的黄色固体 (344mg， 63 )。 0027 1H NMR(500MHz,DMSO-d6)5.04(s,1H),4.82(s,1H。
15、),3.94(d,J 26.5Hz,1H),3.87(d,J 26.5Hz,2H),3.57(s,2H),2.40(d,J 14.0Hz,1H),2.39(d,J 14.0Hz,1H),2.27(s,1H),2.21(s,1H),2.15(s,1H),1.82(s,1H),1.62(s,2H),1 .57(d,J 3.3Hz,1H),1.54(d,J 3.3Hz,1H),1.50(d,J 1.2Hz,1H),1.47(d,J 1.2Hz,1H),1.39(d,J 15.3Hz,2H),1.34(d,J 15.3Hz,1H),1.26(dd,J 32.6,13.7Hz,4H),1.13(d,J 。
16、18.0Hz,2H),1.05(s,6H),0.98(s,1H),0.88(s,12H),0.78( s,3H),0.74(s,1H)。 0028 13C NMR(125MHz,DMSO-d6)216.59(s),154.50(s),105.23(s),74.63(s),69.85 (s),59.71(s),52.55(s),51.21(s),47.92(s),44.10(s),42.25(s),41.73(s),40.64(s),4 0.16(s),38.88(s),38.65(s),37.21(s),36.23(s),33.34(d,J 1.1Hz),32.96(s),29.91 (s),。
17、27.18(s),26.03(s),24.23(s),23.96(s),20.77(s),18.48(s),17.98(s),16.93(s)。 0029 HRMS(ESI)m/zM+H+calcd for C32H52BrO2:547.3151 ； found547.3159. 0030 0031 实施例 3 闭花木酮 Cleistanone 的 O-( 二乙胺基 ) 乙基衍生物 (III) 的合成 0032 将化合物 II(273mg， 0.5mmol) 溶于 20mL 乙腈当中， 向其中加入无水碳酸钾 (345mg， 2.5mmol)， 碘化钾 (84mg， 0.5mmol) 和二乙胺 。
18、(1460mg， 20mmol)， 混合物加热回流 8h。反应结束后将反应液倒入冰水中， 用等量二氯甲烷萃取三次， 合并有机相。依次用水和 饱和食盐水洗涤合并之后的有机相， 再用无水硫酸钠干燥， 减压浓缩去除溶剂得到产物粗 品。产物粗品用硅胶柱层析纯化 ( 流动相为 ： 石油醚 / 丙酮 100:1， v/v)， 收集淡黄色集 中洗脱带即得到化合物 III 的淡黄色胶状固体 (169.8mg,63 )。 0033 1H NMR(500MHz,DMSO-d6)5.04(s,1H),4.85(s,1H),4.37(s,1H),3.54( s,2H),2.91(s,4H),2.64(s,2H),2.。
19、41(d,J 17.2Hz,2H),2.30(s,1H),2.21(d,J 22.5Hz,2H),1.82(s,1H),1.65(s,2H),1.58(d,J 9.0Hz,2H),1.49(d,J 5.7Hz,2H),1.39(d,J 13.4Hz,3H),1.361.28(m,3H),1.281.26(m,1H),1.26 1.14(m,8H),1.06(s,6H),0.92(d,J 19.4Hz,13H),0.82(s,3H),0.71(s,1H). 0034 13C NMR(125MHz,DMSO-d6)216.59(s),154.50(s),105.23(s),74.65(s),66.。
20、82 (s),59.77(s),52.54(d,J 3.0Hz),51.21(s),47.92(s),47.73(s),44.13(s),42.30(s), 41.77(s),40.65(s),40.17(s),38.86(s),38.68(s),37.26(s),36.27(s),33.35(s),32.97 (s),29.89(s),27.21(s),26.08(s),24.27(s),23.97(s),20.78(s),18.46(s),18.01(s),1 说 明 书 CN 104095857 A 6 5/6 页 7 6.98(s),12.33(s). 0035 HRMS(ESI):m。
21、/zM+H+calcd for C36H62NO2:540.4781 ； found:540.4787。 0036 0037 实施例 4 化合物 III 抗肝纤维化活性 0038 由于肝脏星状细胞的激活， 从而引起了多种生长因子的大量分泌， 这些生长因子 会诱导肝脏成纤维细胞的快速增殖， 从而加速纤维化， 其中最重要的生长因子之一就是 TGF。 因此， 筛选抗肝纤维化药物的一个重要思路就是筛选能够抑制肝脏成纤维细胞增殖的 药物或者筛选能够抑制 TGF 等生长因子诱导的成纤维细胞的增殖， 筛选常常在成纤维细胞 上进行， NIH/3T3 细胞是最常用的细胞株。 0039 实验例 1 ： 化合物 I。
22、II 对成纤维细胞 NIH/3T3 增殖的抑制作用 0040 一、 实验方法 ： 0041 NIH/3T3细胞株购自引自ATCC(American Type Culture Collection)的中科院上 海细胞所细胞库。 0042 将对数生长期的亚融合的NIH/3T3细胞用0.25胰酶消化， 洗涤， 离心后， 用DMEM 培养液 ( 含 10 FCS) 制成 1104cell/ml 的细胞悬液， 台盼蓝染色鉴定存活率大于 95， 按每孔 100ul 加入 96 孔板中， 在 37、 5 CO2培养 24h 同步处理后， 弃上清， 加入含有药物 的 DMEM 培养液 ( 含 10 FCS)2。
23、00ul， 培养 48h， 每孔加入 MTT 溶液孵育 4h。弃去培养液， 加 入 150ulDMSO， 振荡 10 分钟， 使结晶溶解， 酶标仪 490nm 处读取 OD 值， 结果以 OD490表示。 0043 二、 实验结果 ： 0044 1、 形态学观察 0045 NIH/3T3 在用药前伸展良好， 折光性较弱， 有方向性， 呈放射状， 细胞增殖的速度 快 ； 而加药物 24h 后， 成纤维细胞数目减少， 形状变得不规则， 突起变短， 细胞排列混乱， 细 胞内代谢产物增多。 0046 MTT 法检测化合物 III 对 NIH/3T3 细胞增殖的抑制作用。 0047 表 1 ： MTT 。
24、法检测化合物 III 对 NIH/3T3 增殖的抑制作用 0048 说 明 书 CN 104095857 A 7 6/6 页 8 0049 注 ： *， 与细胞阴性对照 P0.05 ； *， 与细胞阴性对照 P0.01 0050 结果 ： 化合物 III 在 20ug/ml 对成纤维细胞 NIH/3T3 的细胞增殖有显著的抑制作 用。表明化合物 III 体外对成纤维细胞的增殖有显著抑制作用。 0051 实验例 2 ： 化合物 III 对转化生长因子 -1(TGF-1) 诱导的成纤维细胞增殖的抑 制作用 0052 TGF-1是促进细胞增殖和胶原生成的强活性因子， 在细胞中加入 TGF-110ng。
25、/ ml 刺激细胞增殖， 再检测药物对 TGF-1 诱导的细胞增殖的抑制作用， 以分析判断化合物 III 的作用机理。 0053 表 2 ： MTT 法检测化合物 III 对 TGF 诱导 NIH/3T3 增殖的抑制作用 0054 0055 0056 注 ： *， 与细胞 +TGF 对照 P0.05 ； *， 与细胞 +TGF 对照 P0.01 0057 结果 ： 化合物 III 在 20ug/ml 对成纤维细胞 NIH/3T3 在 TGF-1的诱导下的细胞 增殖有显著的抑制作用。表明化合物 III 体外对纤维细胞增殖的抑制作用可能是通过干预 TGF 信号通路实现的。 0058 结论 ： 化合。
26、物 III 对成纤维细胞 NIH/3T3 在 10小牛血清的刺激下的细胞增殖有 显著的抑制作用 ； 化合物 III 对成纤维细胞 NIH/3T3 在 TGF-1的诱导下的细胞增殖有显 著的抑制作用。化合物 III 可以用来制备抗肝纤维化药物。 0059 实施例 5 本发明所涉及化合物 III 片剂的制备 0060 取20克化合物III或者其药学上可接受的盐当中的一种， 加入制备片剂的常规辅 料 180 克， 混匀， 常规压片机制成 1000 片。 0061 实施例 6 本发明所涉及化合物 III 胶囊的制备 0062 取20克化合物III或者其药学上可接受的盐当中的一种， 加入制备胶囊剂的常规 辅料如淀粉 180 克， 混匀， 装胶囊制成 1000 粒。 说 明 书 CN 104095857 A 8 。