一种HPV高危型分型荧光PCR检测试剂盒.pdf

《一种HPV高危型分型荧光PCR检测试剂盒.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《一种HPV高危型分型荧光PCR检测试剂盒.pdf（24页珍藏版）》请在专利查询网上搜索。

1、(10)申请公布号 CN 104017906 A (43)申请公布日 2014.09.03 CN 104017906 A (21)申请号 201410298440.X (22)申请日 2014.06.27 C12Q 1/70(2006.01) C12Q 1/68(2006.01) C12R 1/93(2006.01) (71)申请人 湖南圣维尔医学检验所有限公司 地址 410205 湖南省长沙市高新开发区麓松 路 680 号 (72)发明人 戴立忠 刘佳 李勃 邓中平 (74)专利代理机构 北京聿宏知识产权代理有限 公司 11372 代理人 吴大建 刘华联 (54) 发明名称 一种 HPV 高。

2、危型分型荧光 PCR 检测试剂盒 (57) 摘要 本发明提供一种 HPV 高危型分型荧光 PCR 检 测试剂盒， 所述试剂盒中包括核酸释放剂和两种 或以上的 PCR 反应液， 所述核酸释放剂包含莎梵 婷 (surfactin)0.01 0.5mmol/L， 氯化钾 20 300mmol/L， 十二烷基磺酸钠 0.01 2和乙醇 0.05 1 ； 其中有一种 PCR 反应液中包含高危 HPV16 型和 / 或 18 型的引物探针序列， 另有一种 PCR 反应液中包含内标的引物探针序列。应用本 发明提供的该试剂盒， 可以对疣体表面脱落细胞、 妇女宫颈上皮细胞、 生殖道分泌物等未知样本中 的高危型人。

3、乳头瘤病毒的 DNA 核酸片段进行快速 荧光 PCR 进行分型检测， 检测结果可用于高危型 人乳头瘤病毒感染的辅助诊断， 及宫颈癌的早期 筛查、 宫颈病变的随访、 用于指导疫苗的开发。 (51)Int.Cl. 权利要求书 3 页 说明书 11 页 序列表 9 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书3页 说明书11页 序列表9页 (10)申请公布号 CN 104017906 A CN 104017906 A 1/3 页 2 1.一种HPV高危型分型荧光PCR检测试剂盒， 其特征在于， 所述试剂盒中包括核酸释放 剂和两种或以上的 PCR 反应液， 所述核酸释放剂。

4、包含莎梵婷 (surfactin)0.01 0.5mmol/ L， 氯化钾20300mmol/L， 十二烷基磺酸钠0.012和乙醇0.051； 其中有一种PCR 反应液中包含高危 HPV16 型和 / 或 18 型的引物探针序列， 另有一种 PCR 反应液中包含内标 的引物探针序列 ； 其中， 用于 16 型、 18 型和内标扩增和检测的引物探针序列分别为， 16 型上游引物 ： CACAGGAGCCACCCAGAAAG， 16 型下游引物 ： GTCATATACCTCACGTCGCAGTAAC， 16 型探针 ： CCACAGTTATGCACAGAGCTGCAAACAAC ； 18 型上游引。

5、物 ： TCAGAGGAAGAAAACGATGAAATAG， 18 型下游引物 ： CTGGCTTCACACTTACAACACATAC， 18 型探针 ： AATCATCAACATTTACCAGCCCGACG ； 内标上游引物 ： GACTCTCTCTGCCTATTGGTCTATT， 内标下游引物 ： CCCATAACAGCATCAGGAGTG， 内标探针 ： CAGATCCCCAAAGGACTCAAAGAACC。 2.根据权利要求1所述的试剂盒， 其特征在于， 所述试剂盒中共含任选的216种PCR 反应液， 且在所述216种PCR反应液中还共包含高危HPV31型、 33型、 35型、 39型。

6、、 45型、 51 型、 52 型、 53 型、 56 型、 58 型、 59 型、 66 型和 68 型这 13 种高危 HPV 型的引物探针序列中 的一种或多种， 且每种PCR反应液中含有上述共16种型别中任选的一种或两种型别的引物 探针序列 ； 其中， 用于这 13 种高危 HPV 型扩增和检测的引物探针序列分别为， 31 型上游引物 ： AGCCAACAACACCACCACATC， 31 型下游引物 ： GCTCTGTTCTTGGTCGCTTAGTAG， 31 型探针 ： TCGCCCGCCGCACACCTTCA ； 33 型上游引物 ： ACCGCCCAGCCCCTTAC， 33 型。

7、下游引物 ： GTCCGCTGCTTGTTTGTGC， 33 型探针 ： CCGCCTTGGACAATAGAACAGCACG ； 35 型上游引物 ： TATTTAGCAGCACAGAACTATCCACT， 35 型下游引物 ： TTGTGATTTGTCTTCTGGGTTTCT， 35 型探针 ： CTACACGCCTACAACACCACCGAGACC ； 39 型上游引物 ： CCAGACGGGATGAACCACA， 39 型下游引物 ： CACACCACGGACACACAAATC， 39 型探针 ： AAGCCTCACGGGATACTCTGCGACA ； 45 型上游引物 ： TTTGTG。

8、TGTCCGTGGTGTGC， 45 型下游引物 ： AAAACCAGCCGTTACAACCC， 45 型探针 ： TCCCCTCCCCGTCTGTACCTTC ； 51 型上游引物 ： TCGGATGATGAGGATGAAAATG， 51 型下游引物 ： CCTCTTTGTTTGCCTGTAATTCTT， 51 型探针 ： TACTGAACCTATTAGCAGCACACCTACTCCA ； 权 利 要 求 书 CN 104017906 A 2 2/3 页 3 52 型上游引物 ： CTCCAAGACCTCCGCAGTGT， 52 型下游引物 ： TGTTGTCCCCGCAAAAGG， 52 。

9、型探针 ： CACACACCTACAACCACCACAGAAACGA ； 53 型上游引物 ： GGTGTGGCTCCTGATCCTGAT， 53 型下游引物 ： TAATGCACACGAGCACCTATTTG， 53 型探针 ： TGCCAAGCCTACTAAAACGCACACC ； 56 型上游引物 ： TGTGCGTTTTAGTAGGCTAGGC， 56 型下游引物 ： CAATAATGGCTGCATTTCAATTTC， 56 型探针 ： CATAATAATAATGCACACGAGCACCTATTTG ； 58 型上游引物 ： CAGACATTTTTTGGTAGGCTACTG， 58 型。

10、下游引物 ： CCAACGCCTGACACAAATCAT， 58 型探针 ： TCCGTGGTTTCTCCTCTGCGTCCT ； 59 型上游引物 ： TGGCAATCCAGTATATGAAATAAATG， 59 型下游引物 ： TCTTCCTCGTGCAAATCTAATCTG， 59 型探针 ： ACCATGTCCTTTCAAAAAAACATTTCCA ； 66 型上游引物 ： GCCGTAAACGTATTCCCTATTTT， 66 型下游引物 ： CGTTTTACATAGGTATCCGTTG， 66 型探针 ： CTAGGCCGCCACATCGCCATCTG ； 68 型上游引物 ： A。

11、ATAGCAGGAAACTTTACAGGACAG， 68 型下游引物 ： GCACGGTGGGCTTTGGT， 68 型探针 ： CGTGTGCGTCTGCGGTCCTCTC。 3. 根据权利要求 2 所述的试剂盒， 其特征在于， 所述试剂盒中共含 8 种 PCR 反应液， 且 所述 8 种 PCR 反应液中分别含有如下型别的引物探针序列 ： 16 型和 18 型， 39 型和 31 型， 33 型和 58 型， 45 型和 59 型， 51 型和 66 型， 52 型和 53 型， 56 型和 68 型， 35 型和内标。 4.根据权利要求13中任意一项所述的试剂盒， 其特征在于， 所述试剂。

12、盒包括核酸释 放剂、 PCR 反应液、 酶混合液、 HPV 高危型定量参考品、 HPV 高危型阳性对照和 HPV 高危型阴 性对照。 5. 一种 HPV 高危型分型荧光 PCR 检测试剂盒， 其特征在于， 所述试剂盒中包括两种或 以上的 PCR 反应液， 其中有一种 PCR 反应液中包含高危 HPV16 型和 / 或 18 型的引物探针序 列， 另有一种 PCR 反应液中包含内标的引物探针序列 ； 其中， 用于 16 型、 18 型和内标扩增和检测的引物探针序列分别为， 16 型上游引物 ： CACAGGAGCCACCCAGAAAG， 16 型下游引物 ： GTCATATACCTCACGTCG。

13、CAGTAAC， 16 型探针 ： CCACAGTTATGCACAGAGCTGCAAACAAC ； 18 型上游引物 ： TCAGAGGAAGAAAACGATGAAATAG， 18 型下游引物 ： CTGGCTTCACACTTACAACACATAC， 18 型探针 ： AATCATCAACATTTACCAGCCCGACG ； 内标上游引物 ： GACTCTCTCTGCCTATTGGTCTATT， 内标下游引物 ： CCCATAACAGCATCAGGAGTG， 权 利 要 求 书 CN 104017906 A 3 3/3 页 4 内标探针 ： CAGATCCCCAAAGGACTCAAAGAACC。

14、。 6.根据权利要求5所述的试剂盒， 其特征在于， 所述试剂盒中共含任选的216种PCR 反应液， 且在所述216种PCR反应液中还共包含高危HPV31型、 33型、 35型、 39型、 45型、 51 型、 52 型、 53 型、 56 型、 58 型、 59 型、 66 型和 68 型这 13 种高危 HPV 型的引物探针序列中 的一种或多种， 且每种PCR反应液中含有上述共16种型别中任选的一种或两种型别的引物 探针序列 ； 其中， 用于这 13 种高危 HPV 型扩增和检测的引物探针序列为如权利要求 2 所示 的序列。 7. 根据权利要求 6 所述的试剂盒， 其特征在于， 所述试剂盒中。

15、共含 8 种 PCR 反应液， 且 所述 8 种 PCR 反应液中分别含有如下型别的引物探针序列 ： 16 型和 18 型， 39 型和 31 型， 33 型和 58 型， 45 型和 59 型， 51 型和 66 型， 52 型和 53 型， 56 型和 68 型， 35 型和内标。 8. 一种核酸释放剂在 HPV 高危型分型荧光 PCR 检测中的应用， 所述核酸释放剂包含莎 梵婷(surfactin)0.010.5mmol/L， 氯化钾20300mmol/L， 十二烷基磺酸钠0.012 和乙醇 0.05 1。 权 利 要 求 书 CN 104017906 A 4 1/11 页 5 一种 H。

16、PV 高危型分型荧光 PCR 检测试剂盒 技术领域 0001 本发明提供一种人乳头瘤病毒 (HPV) 高危型分型荧光 PCR 检测试剂盒。 背景技术 0002 人乳头瘤病毒 (Human papillomavirus， HPV) 是一类分子量较小的无包膜的双链 环状 DNA 病毒， 专性侵染和寄生人体生殖器官及其它组织器官的上皮细胞。在临床上， 根据 HPV 不同亚型致病力大小或致癌危险性大小不同可将 HPV 分为高危型和低危型两大类。低 危型 HPV 主要引起肛门皮肤及男性外生殖器、 女性大小阴唇、 尿道口、 阴道下段的外生性疣 类病变和低度子宫颈上皮内瘤。高危型 HPV 除可引起外生殖器疣。

17、外， 更重要的是引起外生 殖器癌、 宫颈癌及高度子宫颈上皮内瘤变， 其病毒亚型主要有 HPV16、 18、 31、 33、 35、 39、 45、 51、 52、 53、 56、 58、 59、 66、 68 型。 0003 HPV 在人群中极易传播扩散， 可通过直接或间接接触交叉传染， 其感染部位隐蔽， 发病隐匿， 不易早期发现， 可致多种增生性病变， 在女性生殖系统所引起的最常见的恶性肿 瘤为宫颈癌。 全世界每年约有50万妇女宫颈癌新发病例， 其中亚洲约占38万 ； 每年约有27 万女性死于子宫颈癌。在不同地区、 不同经济状况的国家宫颈癌的发病率和死亡率有着显 著的差别， 其中 80的病例。

18、发生在发展中国家。我国每年约有 15 万宫颈癌新发病例， 每年 约有 3 万人死于子宫颈癌， 其死亡率居妇科肿瘤的第二位。近年来， 宫颈癌病人数目在逐渐 上升， 并呈年轻化的趋势。 0004 对宫颈癌的病因学研究可知， 高危 HPV 持续感染是子宫颈癌的主要致病因素， 99.7宫颈癌患者存在 HPV 感染。临床研究显示， 从 HPV 的持续感染到一般的宫颈癌前病 变并最终发展为宫颈癌大约需要 8-10 年。因此筛查是目前预防和早期诊断宫颈癌的主要 手段。在检出的所有型别中主要有 HPV16、 18、 31、 33、 35、 39、 45、 51、 52、 53、 56、 58、 59、 66、。

19、 68 型。早期宫颈病变的治疗效果远比宫颈癌的治疗效果要好得多， 因此， 快速、 准确的检测出 HPV 高危型的感染， 且能够准确分型， 对于早期治疗和降低宫颈癌的发病率和死亡率等具有 重要的意义。 0005 目前， 国内外对于宫颈癌的早期筛查方法主要有细胞学检测和分子生物学检测。 细胞学的检测方法， 有宫颈巴氏 (Pap) 涂片、 阴道镜活检、 液基薄层细胞学或薄片制备细胞 学检查 (TCT) 等多种。宫颈巴氏涂片是群体筛查的常规手段， 但受取材、 涂片制作质量、 阅 片技术影响， 准确性低， 假阳性率高， 重复性差， 敏感性也有限， 漏诊率可达 30。TCT 法大 大改进了细胞学检查的准确。

20、性， 逐渐取代传统的巴氏法。可观察宫颈上皮血管微小变化的 阴道镜检查虽敏感、 准确， 但会引起不适、 操作不便、 费用高， 不易为广大患者接受。宫颈组 织活检有创伤， 不利于人群普查。由于宫颈 HPV 感染多为隐性亚临床感染， 且 HPV 不能在培 养环境中稳定生长， 大部分 HPV 感染无临床症状或为亚临床感染但可致严重后果， 因此， 该 感染不能作为一个普通的临床疾病或通过常规筛查计划或性传播疾病调查得以发现， 只能 通过 HPV DNA 检测得知。 0006 目前 HPV DNA 的检测主要通过应用分子生物学方法， 包括核酸杂交方法、 基因芯片 说 明 书 CN 104017906 A 。

21、5 2/11 页 6 技术以及聚合酶链反应 (PCR) 技术等。其中核酸杂交方法又包括 DNA 印迹杂交、 原位杂交 技术、 杂交捕获方法和分子导流杂交。基因芯片技术的出现时间不长， 其发展势头迅猛， 应 用十分广泛， 但其存在的缺陷限制了其在临床的应用。首先是成本的问题， 由于芯片制作 的工艺复杂， 信号检测也需专门的仪器设备， 一般实验室难以承担其高昂的费用， 其次在芯 片实验技术上还有多个环节尚待提高， 如在探针合成方面， 如何进一步提高合成效率及芯 片的集成程度是研究的焦点。目前认为 PCR 技术是检测 HPV DNA 及分型的最好方法。荧光 PCR 技术是基于传统 PCR 技术并结合。

22、光谱技术而发展起来的一种更灵敏， 更特异， 更精确的 核酸检测技术。检测结果准确， 重复性高， 能动态反应患者治疗前、 后病原体动态变化及与 临床的关系， 且整个过程中避免了传统 PCR 需后处理的问题， 减少了污染。大量研究表明用 PCR技术检测HPV DNA的阳性率远高于其他检测技术， 是当今用于HPV感染诊断最常用的有 力工具， 且能更好的应用于 HPV 致病、 致癌机理的研究之中。 0007 结合国内情况， 在临床高危型人乳头瘤病毒感染的分型诊断中， 实时荧光 PCR 技 术凭借着快速、 敏感、 特异等优点显示出了其临床诊断的优越性， 目前只有极少量荧光 PCR 诊断试剂盒在临床高危 。

23、HPV 感染诊断中使用， 但是缺乏完善的质控体系， 操作比较繁琐， 灵 敏度不高， 还需要进一步完善和提高技术水平， 使此类产品更加满足临床准确快速诊断的 需要。 0008 运用 PCR 技术进行检测主要涉及到两个方面， 核酸的提取和核酸的扩增检测。 0009 目前国内临床上主要采用煮沸法对人乳头瘤病毒的核酸进行提取 ： 先将分泌物样 本浓缩、 洗涤， 再加裂解液， 煮沸， 高速离心， 取上清为模板。 对于浓缩这一步， 不同厂家的浓 缩效果不一样， 有的可以看到沉淀， 有的无法看到， 看得到沉淀的是因为将病毒与蛋白都浓 缩了， 这样， 导致后面加入裂解液时很难充分混匀 ； 无法看到沉淀， 使操。

24、作者无法确定吸弃 上清时会不会吹打到病毒核酸。 0010 临床上检测高危 HPV-DNA 的方法目前主要是基于实时荧光定量 PCR 的技术及其 改进， 实时荧光定量 PCR 技术是近年来发展迅速的一种核酸检测技术， 使用一种带有荧光 检测装置的 PCR 扩增仪， 荧光检测装置能够按照一定的程序周期性地发出特定波长的激 发光， 收集检测荧光信号， 通过检测荧光信号的动态变化实时反映 PCR 的每个循环的扩增 水平， 试验结束后可通过软件自动分析获得扩增曲线， 根据扩增曲线与荧光阈值线的交点 ( 即 Ct 值 ) 以及扩增曲线的形状， 可以判断阴阳性结果 ； 如果同一反应中有已知浓度的定 量参考品。

25、或标准品， 则可以通过软件自动分析获得标准曲线， 由此实现对未知样本的定值 ( 即定量检测 )。与传统的 PCR 相对比， 其在反应体系中增加了一条两端分别标记荧光报 告基团和淬灭基团的探针。探针结构完整时， 荧光报告基团发出的荧光能量被淬灭基团吸 收， 呈现淬灭效应 ； 如果扩增过程中有靶序列的存在， 随着目标片段的延伸， 探针分子逐渐 被 Taq 酶水解切断， 荧光报告基团与淬灭基团相互解离， 阻断了二者间荧光能量转移效应， 荧光报告基团发出的荧光信号被荧光检测装置收集。随着扩增的进行， 荧光信号随着目的 片段的扩增而呈现线性增强。试验结束后， 可以通过荧光 PCR 仪自带的软件自动分析数。

26、据， 可以获得阴阳性结果和样本浓度的定值结果， 因此， 该技术在靶多核苷酸样品的检测和定 量分析中， 已逐渐取代传统的 PCR 方法， 得到十分广泛的应用。 0011 国内已有一些基于实时荧光定量PCR技术定量检测高危HPV-DNA的试剂盒应用于 临床检测中， 这些试剂盒所提供的高危型 HPV-DNA 提取方法主要是煮沸法， 其核酸提取过 说 明 书 CN 104017906 A 6 3/11 页 7 程较复杂， 样本处理耗时长， 且在处理样本时， 经过煮沸裂解、 高速离心富集 DNA 等多个步 骤， 样本中的 DNA 存在损耗， 尤其对于高浓度的样本， 裂解不充分、 富集不完全， 会造成 D。

27、NA 的大量丢失导致样本定量偏低， 同时由于采用了水浴或金属浴的高温加热步骤， 容易造成 气溶胶污染。且这些试剂盒的检测灵敏度不高， 约在 10000copies/ml 左右 ； 还因没有设置 阳性内对照 ( 即内标 )， 无法监控假阴性， 和一般没有预防 PCR 产物污染的措施。且现有 HPV 基因分型方法复杂， 操作过程繁琐， 需要开盖操作， 容易污染， 现有的荧光 PCR 分型试 剂， 所能区分的型别少。另外， 受限于其引物探针序列， 本领域还需开发出一种检测高危型 HPV-DNA 特异性好且综合性能优良的分型 PCR 检测试剂盒。 发明内容 0012 本发明的目的在于解决现有高危型人乳。

28、头瘤病毒核酸分型检测试剂盒的缺陷， 提 供一种操作快速、 方法简便、 检测灵敏度高、 检测范围宽的高危型人乳头瘤病毒荧光定量 PCR 分型检测试剂盒， 应用该试剂盒， 可以对疣体表面脱落细胞、 妇女宫颈上皮细胞、 生殖道 分泌物等未知样本中的高危型人乳头瘤病毒16型、 18型、 31型、 33型、 35型、 39型、 45型、 51 型、 52 型、 53 型、 56 型、 58 型、 59 型、 66 型、 68 型这 15 种型别的 DNA 核酸片段进行快速荧光 PCR 进行分型检测， 检测结果可用于高危型人乳头瘤病毒感染的辅助诊断， 及宫颈癌的早期 筛查、 宫颈病变的随访、 用于指导疫苗。

29、的开发。 0013 因此， 本发明提供一种 HPV 高危型分型荧光 PCR 检测试剂盒， 所述试剂盒中包括 核酸释放剂和两种或以上的 PCR 反应液， 所述核酸释放剂包含莎梵婷 (surfactin)0.01 0.5mmol/L， 氯化钾 20 300mmol/L， 十二烷基磺酸钠 0.01 2和乙醇 0.05 1； 其中 有一种 PCR 反应液中包含高危 HPV16 型和 / 或 18 型的引物探针序列， 另有一种 PCR 反应液 中包含内标的引物探针序列 ； 0014 其中， 用于 16 型、 18 型和内标扩增和检测的引物探针序列分别为， 0015 16 型上游引物 ： CACAGGAG。

30、CCACCCAGAAAG， 0016 16 型下游引物 ： GTCATATACCTCACGTCGCAGTAAC， 0017 16 型探针 ： CCACAGTTATGCACAGAGCTGCAAACAAC ； 0018 18 型上游引物 ： TCAGAGGAAGAAAACGATGAAATAG， 0019 18 型下游引物 ： CTGGCTTCACACTTACAACACATAC， 0020 18 型探针 ： AATCATCAACATTTACCAGCCCGACG ； 0021 内标上游引物 ： GACTCTCTCTGCCTATTGGTCTATT， 0022 内标下游引物 ： CCCATAACAGCAT。

31、CAGGAGTG， 0023 内标探针 ： CAGATCCCCAAAGGACTCAAAGAACC。 0024 在一种具体的实施方案中， 所述试剂盒中共含任选的 2 16 种 PCR 反应液， 且在 所述216种PCR反应液中还共包含高危HPV31型、 33型、 35型、 39型、 45型、 51型、 52型、 53 型、 56 型、 58 型、 59 型、 66 型和 68 型这 13 种高危 HPV 型的引物探针序列中的一种或多 种， 且每种 PCR 反应液中含有上述共 16 种型别中任选的一种或两种型别的引物探针序列 ； 0025 其中， 用于这 13 种高危 HPV 型扩增和检测的引物探。

32、针序列分别为， 0026 31 型上游引物 ： AGCCAACAACACCACCACATC， 0027 31 型下游引物 ： GCTCTGTTCTTGGTCGCTTAGTAG， 说 明 书 CN 104017906 A 7 4/11 页 8 0028 31 型探针 ： TCGCCCGCCGCACACCTTCA ； 0029 33 型上游引物 ： ACCGCCCAGCCCCTTAC， 0030 33 型下游引物 ： GTCCGCTGCTTGTTTGTGC， 0031 33 型探针 ： CCGCCTTGGACAATAGAACAGCACG ； 0032 35 型上游引物 ： TATTTAGCAGCA。

33、CAGAACTATCCACT， 0033 35 型下游引物 ： TTGTGATTTGTCTTCTGGGTTTCT， 0034 35 型探针 ： CTACACGCCTACAACACCACCGAGACC ； 0035 39 型上游引物 ： CCAGACGGGATGAACCACA， 0036 39 型下游引物 ： CACACCACGGACACACAAATC， 0037 39 型探针 ： AAGCCTCACGGGATACTCTGCGACA ； 0038 45 型上游引物 ： TTTGTGTGTCCGTGGTGTGC， 0039 45 型下游引物 ： AAAACCAGCCGTTACAACCC， 0040。

34、 45 型探针 ： TCCCCTCCCCGTCTGTACCTTC ； 0041 51 型上游引物 ： TCGGATGATGAGGATGAAAATG， 0042 51 型下游引物 ： CCTCTTTGTTTGCCTGTAATTCTT， 0043 51 型探针 ： TACTGAACCTATTAGCAGCACACCTACTCCA ； 0044 52 型上游引物 ： CTCCAAGACCTCCGCAGTGT， 0045 52 型下游引物 ： TGTTGTCCCCGCAAAAGG， 0046 52 型探针 ： CACACACCTACAACCACCACAGAAACGA ； 0047 53 型上游引物 ： 。

35、GGTGTGGCTCCTGATCCTGAT， 0048 53 型下游引物 ： TAATGCACACGAGCACCTATTTG， 0049 53 型探针 ： TGCCAAGCCTACTAAAACGCACACC ； 0050 56 型上游引物 ： TGTGCGTTTTAGTAGGCTAGGC， 0051 56 型下游引物 ： CAATAATGGCTGCATTTCAATTTC， 0052 56 型探针 ： CATAATAATAATGCACACGAGCACCTATTTG ； 0053 58 型上游引物 ： CAGACATTTTTTGGTAGGCTACTG， 0054 58 型下游引物 ： CCAACG。

36、CCTGACACAAATCAT， 0055 58 型探针 ： TCCGTGGTTTCTCCTCTGCGTCCT ； 0056 59 型上游引物 ： TGGCAATCCAGTATATGAAATAAATG， 0057 59 型下游引物 ： TCTTCCTCGTGCAAATCTAATCTG， 0058 59 型探针 ： ACCATGTCCTTTCAAAAAAACATTTCCA ； 0059 66 型上游引物 ： GCCGTAAACGTATTCCCTATTTT， 0060 66 型下游引物 ： CGTTTTACATAGGTATCCGTTG， 0061 66 型探针 ： CTAGGCCGCCACATCG。

37、CCATCTG ； 0062 68 型上游引物 ： AATAGCAGGAAACTTTACAGGACAG， 0063 68 型下游引物 ： GCACGGTGGGCTTTGGT， 0064 68 型探针 ： CGTGTGCGTCTGCGGTCCTCTC。 0065 在本发明中， 我们把 15 种高危 HPV 型别 (HPV16 型、 18 型、 31 型、 33 型、 35 型、 39 型、 45 型、 51 型、 52 型、 53 型、 56 型、 58 型、 59 型、 66 型和 68 型 ) 和所使用的内标一起简称 说 明 书 CN 104017906 A 8 5/11 页 9 为 16 。

38、种型别。 0066 在本发明中， 优选地， 所述试剂盒中共含 8 种 PCR 反应液， 且所述 8 种 PCR 反应液 中分别含有如下型别的引物探针序列 ： 16 型和 18 型， 39 型和 31 型， 33 型和 58 型， 45 型和 59 型， 51 型和 66 型， 52 型和 53 型， 56 型和 68 型， 35 型和内标。 0067 在一种具体的实施方式中， 所述试剂盒包括核酸释放剂、 PCR 反应液、 酶混合液、 HPV 高危型定量参考品、 HPV 高危型阳性对照和 HPV 高危型阴性对照。 0068 本发明还提供一种HPV高危型分型荧光PCR检测试剂盒， 其特征在于， 所。

39、述试剂盒 中包括两种或以上的 PCR 反应液， 其中有一种 PCR 反应液中包含高危 HPV16 型和 / 或 18 型 的引物探针序列， 另有一种 PCR 反应液中包含内标的引物探针序列 ； 0069 其中， 用于 16 型、 18 型和内标扩增和检测的引物探针序列分别为， 0070 16 型上游引物 ： CACAGGAGCCACCCAGAAAG， 0071 16 型下游引物 ： GTCATATACCTCACGTCGCAGTAAC， 0072 16 型探针 ： CCACAGTTATGCACAGAGCTGCAAACAAC ； 0073 18 型上游引物 ： TCAGAGGAAGAAAACGAT。

40、GAAATAG， 0074 18 型下游引物 ： CTGGCTTCACACTTACAACACATAC， 0075 18 型探针 ： AATCATCAACATTTACCAGCCCGACG ； 0076 内标上游引物 ： GACTCTCTCTGCCTATTGGTCTATT， 0077 内标下游引物 ： CCCATAACAGCATCAGGAGTG， 0078 内标探针 ： CAGATCCCCAAAGGACTCAAAGAACC。 0079 在一个具体实施方式中， 所述试剂盒中共含任选的 2 16 种 PCR 反应液， 且在所 述 2 16 种 PCR 反应液中还共包含高危 HPV31 型、 33 型、。

41、 35 型、 39 型、 45 型、 51 型、 52 型、 53 型、 56 型、 58 型、 59 型、 66 型和 68 型这 13 种高危 HPV 型的引物探针序列中的一种或多 种， 且每种 PCR 反应液中含有上述共 16 种型别中任选的一种或两种型别的引物探针序列 ； 其中， 用于这 13 种高危 HPV 型扩增和检测的引物探针序列如上所示。 0080 优选的， 所述试剂盒中共含 8 种 PCR 反应液， 且所述 8 种 PCR 反应液中分别含有如 下型别的引物探针序列 ： 16 型和 18 型， 39 型和 31 型， 33 型和 58 型， 45 型和 59 型， 51 型和 。

42、66 型， 52 型和 53 型， 56 型和 68 型， 35 型和内标。 0081 本发明还提供一种核酸释放剂在 HPV 高危型分型荧光 PCR 检测中的应用， 所述核 酸释放剂包含莎梵婷 (surfactin)0.01 0.5mmol/L， 氯化钾 20 300mmol/L， 十二烷基磺 酸钠 0.01 2和乙醇 0.05 1。 具体实施方式 0082 实施例 1 0083 本实施例提供一种能检测 15 种高危型人乳头状瘤病毒并能准确分型的检测试剂 盒， 它至少由以下组分组成 ： 0084 核酸释放剂 ： 莎梵婷 (surfactin)0.01 0.5mmol/L( 质量 / 体积 )，。

43、 氯化钾 (KCl)50 200mmol/L( 质量 / 体积 )， 十二烷基磺酸钠 (SDS)0.01 2 ( 质量 / 体积 )， 乙醇 0.05 1 ( 体积 / 体积 ) ； 0085 PCR反应液 ： 包含HPV16型和18型引物探针序列的第一种PCR反应液， 用于检测 说 明 书 CN 104017906 A 9 6/11 页 10 HPV16型及18型 ； 包含HPV39型和31型引物探针序列的第二种PCR反应液， 用于检测HPV39 型及 31 型 ； 包含 HPV33 型和 58 型引物探针序列的第三种 PCR 反应液， 用于检测 HPV33 型及 58型 ； 包含HPV45。

44、型和59型引物探针序列的第四种PCR反应液， 用于检测HPV45型及59型 ； 包含 HPV51 型和 66 型引物探针序列的第五种 PCR 反应液， 用于检测 HPV51 型及 66 型 ； 包含 HPV52型和53型引物探针序列的第六种PCR反应液， 用于检测HPV52型及53型 ； 包含HPV56 型和 68 型引物探针序列的第七种 PCR 反应液， 用于检测 HPV56 型及 68 型 ； 包含 HPV35 型和 -globin 引物探针序列的第八种 PCR 反应液， 用于检测 HPV35 型及内标。其中每种 PCR 反 应液均包括 10PCR 反应缓冲液 5l， 0.05mmol/L。

45、 0.2mmol/L 脱氧核糖核苷三磷酸， 且 八种 PCR 反应液中相应每种靶核苷酸引物探针序列的浓度均为 0.1mol/L 0.3mol/ L， 八种 PCR 反应液中总共的引物序列记为 ： HPV16-F 与 HPV16-R、 HPV18-F 与 HPV18-R、 HPV31-F 与 HPV31-R、 HPV33-F 与 HPV33-R、 HPV35-F 与 HPV35-R、 HPV39-F 与 HPV39-R、 HPV45-F与HPV45-R、 HPV51-F与HPV51-R、 HPV52-F与HPV52-R、 HPV53-F与HPV53-R、 HPV56-F 与 HPV56-R、 H。

46、PV58-F 与 HPV58-R、 HPV59-F 与 HPV59-R、 HPV66-F 与 HPV66-R、 HPV68-F 与 HPV68-R ； 八种 PCR 反应液中总共的探针序列记为 ： HPV16-P、 HPV18-P、 HPV31-P、 HPV33-P、 HPV35-P、 HPV39-P、 HPV45-P、 HPV51-P、 HPV52-P、 HPV53-P、 HPV56-P、 HPV58-P、 HPV59-P、 HPV66-P、 HPV68-P ； 第八种 PCR 反应液中还包括 0.05mol/L 0.2mol/L 的用于内标片 段扩增的上下游引物 IC-F 与 IC-R 和。

47、 0.05mol/L 0.2mol/L 的用于检测内标的探针 IC-P。所述 10PCR 反应缓冲液包括 pH7.5 的 200mmol/L 三羟甲基氨基甲烷盐酸盐溶液、 20mmol/L氯化镁溶液、 500mmol/L氯化钾溶液、 0.2(体积/体积)曲拉通溶液和10(体 积 / 体积 ) 甲酰胺溶液 ； 所述脱氧核糖核苷三磷酸为 dATP、 dCTP、 dUTP、 dGTP 或 dTTP ； 所述 引物探针的碱基序列见表 1。 0086 表 1 0087 说 明 书 CN 104017906 A 10 7/11 页 11 0088 说 明 书 CN 104017906 A 11 8/11 。

48、页 12 0089 酶混合液 ： 耐热 DNA 聚合酶 (Taq 酶 )1U/l 5U/l， 尿嘧啶 DNA 糖基化酶 (UNG酶)0.05U/l0.2U/l ； 其中UNG酶具有降解含有dU的PCR产物的功能， 利用UNG 酶和 PCR 反应液中的 dUTP 可以起到预防 PCR 产物污染的作用 ； 0090 高危 HPV 定量参考品 ： 来源于使用高危 HPV 企业定量线性参考品 L1 L5 定值 后的高危 HPV 强阳性质粒， 其特征在于该高危 HPV 定量参考品包括 A、 B、 C、 D 四个浓度组 成的梯度参考品， 其浓度分别为 1.00 5.00E+07copies/ml(A)、 1.00 5.00E+06copies/ ml(B)、 1.00 5.00E+05copies/ml(C)、 1.00 5.00E+04copies/ml(D) ； 定量参考品能对 15 种高危 HPV 型别检测结果进行定量分析。 0091 高危 HPV 阳性对照 ： 为临床医院收集的 HPV 高危型强阳性样本， 其浓度为 1.00 5.00E+05copies/ml。 0092 高危 HPV 阴性对照 ： 为灭菌生理盐水。 0093 实施例 2 0094 将实施例 1 中的高危型人乳头瘤病毒核酸分型检测试剂盒用于检测疣体表面脱 落细胞、 妇女宫颈上皮细胞、 生殖道分泌物等未知样本中的高危。