铁氧还蛋白的简易分离方法.pdf

上传人:a**** 文档编号:1614009 上传时间:2018-06-28 格式:PDF 页数:9 大小:291.06KB
返回 下载 相关 举报
摘要
申请专利号:

CN01112603.5

申请日:

2001.04.17

公开号:

CN1323801A

公开日:

2001.11.28

当前法律状态:

终止

有效性:

无权

法律详情:

专利权的终止(未缴年费专利权终止)授权公告日:2003.12.31|||专利权人的姓名或者名称、地址的变更变更事项:专利权人变更前:中国科学院上海植物生理研究所变更后:中国科学院上海生命科学研究院变更事项:地址变更前:200032上海市枫林路300号变更后:200031上海市岳阳路320号|||授权|||公开|||实质审查的生效申请日:2001.4.17

IPC分类号:

C07K14/415; C07K1/14

主分类号:

C07K14/415; C07K1/14

申请人:

中国科学院上海植物生理研究所;

发明人:

叶济宁

地址:

200032上海市枫林路300号

优先权:

专利代理机构:

上海东亚专利事务所

代理人:

董梅

PDF下载: PDF下载
内容摘要

本发明涉及一种植物铁氧还蛋白的简易分离方法。铁氧还蛋白是普遍存在于植物体内的一种低分子量具有氧化还原性质的蛋白,它参与光合作用和生物固氮等生理活动。是一种重要的生物化学试剂。传统的分离方法需耗用大量的丙酮,本发明提供一种省略丙酮的分离步骤,解决由于使用丙酮带来工艺上的困难。产品适用于对铁氧还蛋白纯度要求不是很高的生化反应,对于光合电子传递的离体实验,由于某些成分未被分离,反而有利反应进行。

权利要求书

1: 一种铁氧还蛋白的简易分离方法(一)用菠菜叶预先深冻(-20 ℃),室温下解冻,使细胞冻融破裂,加入Tris-HCI 0.01M pH7.3 缓冲液,捣碎冻融叶片,纱布和尼龙布过滤,(二)滤液中加入深 冷(-20℃)丙酮,使之浓度到35%丙酮。经5000×g离心,把沉 淀弃去。在离心后的上层液中继续加入深冷丙酮,使之浓度达到75 %静止后,使沉淀沉降,吸去部分上清液后,余留带有沉淀的75% 浓度丙酮溶液,经5000×g离心,收集沉淀,用冷风吹干残留沉淀 中的丙酮,并使悬浮于0.01 M Tris-HCI pH7.3缓冲液,对同样缓 冲液透析,再经18000×g离心20分钟,红棕色的上层液为含Fd的 粗制品,(三)在红棕色的样品中加入固体NaCl,使之成0.15M NaCl浓度,并把它吸附到预先经0.01M Tris-HCI pH7.3和0.15M NaCl平衡过的DEAE-纤维素(D-52)分离柱上,以同样的缓冲液洗 柱,未被吸附的样品流弃,深棕红色的Fd吸附带呈现在分离柱的上 端,再分次提高洗脱缓冲液中的NaCl浓度以0.2M、0.25M、0.3 M……,同时观察分离柱的上端Fd移动的情况,直到提高NaCl浓 度到棕红色吸附带开始下降移动,就不再提升NaCl浓度,继续洗 脱,并收集出棕红色的Fd制剂,(四)将收集的Fd溶液,对不含 NaCl的0.01M Tris-HCI透析脱盐,浓缩保存、备用,其特征在于 省略了第二步,不再用35%~75%的丙酮分级沉淀,而直接用 DEAE-纤维素吸附蛋白。

说明书


铁氧还蛋白的简易分离方法

    本发明属于一种植物蛋白的分离方法。

    铁氧还蛋白(Ferredoxin,简称Fd)是普遍存在于植物界的一种低分子量(Mr为11000),具有氧化还原性质的蛋白,它参与碳同化和硝酸盐还原等诸多生理活动,许多涉及光合作用和生物固氮等实验都会用到这种生物化学试剂。虽然商品Fd试剂纯度较高,但价格昂贵。而传统的Fd的分离方法需耗用大量丙酮(植物生理学通讯1984(1):46-47)。该方法的主要流程为:(一)用菠菜叶预先深冻(-20℃),室温下解冻,使细胞冻融破裂,加入0.01M Tris-HCI pH7.3缓冲液,捣碎冻融叶片,纱布过滤。(二)滤液中加入深冷(-20℃)丙酮,使之浓度到35%丙酮。经5000×g离心,把沉淀弃去。在离心后的上层液中继续加入深冷丙酮,使之浓度达到75%,静止后,使沉淀沉降,吸去部分上清液后,余留带有沉淀的75%浓度丙酮溶液,经5000×g离心,收集沉淀,用冷风吹干残留沉淀中的丙酮,并使悬浮于0.01M Tris-HCIpH7.3缓冲液,对同样缓冲液透析,再经18000×g离心20分钟,红棕色的上层液为含Fd的粗制品。(三)在红棕色的样品中加入固体NaCl,使之成0.15M NaCl浓度,并把它吸附到预先经0.01M Tris-HCI pH7.3和0.15M NaCl平衡过的DEAE-纤维素(D-52)分离柱上。以同样的缓冲液洗柱,未被吸附的样品流弃。深棕红色地Fd吸附带呈现在分离柱的上端。再分次提高洗脱缓冲液中的NaCl浓度以0.2M、0.25M、0.3M……。同时观察分离柱的上端Fd移动的情况,直到提高NaCl浓度到棕红色吸附带开始下降移动,就不再提升NaCl浓度,继续洗脱,并收集出棕红色的Fd制剂。(四)将收集的Fd溶液,对不含NaCl的0.01M Tris-HCI pH7.3透析脱盐,浓缩保存、备用。但用此方法如提取1Kg菠菜叶片,共需耗丙酮6立升,大量用过的丙酮不仅对回收、处理带来麻烦,而且由于高浓度的丙酮在操作过程中不能用塑料容器,这还对离心设备的使用带来诸多不便,且成本高,又不安全。

    本发明的目的是提供一种屏弃丙酮,省时、省钱、安全、简便的Fd分离方法,此方法虽在得率和纯度上不及丙酮提取方法,但在光合电子传递的离体实验中,由于某些成分(Fd-NADP-还原酶、铜兰素等)未被分离掉,反而有利生化反应的进行。同时也解决了由于使用大量高浓度的丙酮,对离心操作带来不便,及对废丙酮回收处理带来的麻烦。

    本发明提出的铁氧还蛋白的分离方法,是目前最简单的方法,本发明是这样实现的:(一)菠菜或豌豆叶片的深冻、捣碎、过滤、离心的提取步骤与已有技术相同,缓冲液用0.02M Tris-HCl pH7.6得到第一步提取液后,关键在省略了第二步,不再用35%~75%的丙酮分级沉淀,而是直接用DEAE-纤维素(D-52)吸附蛋白。(二)吸附蛋白:把DEAE-纤维素(D-52)原装干粉,直接投到提取液中,使其充分吸附提取液中的蛋白。缓慢搅拌使DEAE-纤维素分散吸胀。(三)装柱:把吸附蛋白后,呈深色的DEAE-纤维素装到层析柱直径4cm、长25-30cm)上,为了使DEAE均匀地在柱内沉降,可先在柱内装满缓冲液,一边在柱上端加入吸胀的DEAE-纤维素,一边在柱下端放出柱内溶液,使其均匀地沉降下来,缓慢操作,连续灌注,直至完成。(四)洗脱杂蛋白:用含0.15M NaCl的0.02M Tris-HCl pH7.6缓冲液洗柱,需连续洗脱不能中断,使之洗脱过夜,大量不被吸附的蛋白被洗脱掉。流出液由起始的呈深黄色逐渐变淡呈微黄色。(五)收集Fd:当洗脱液中的NaCl浓度由0.15M提高到0.3M,继续洗脱时,DEAE-纤维素柱的上端可以看到有一棕色环带析出,并随洗脱而下移,此为含Fd成份的部分,控制流速,使其尽可能集中在体积较小的洗脱液中。收集棕红色的洗脱液部分。(六)脱盐及浓缩:一般用水溶液法提取得到的Fd制剂较稀,需经浓缩。可以用超滤膜方法来脱盐浓缩,也可以先把样品,对不含NaCl的0.02M Tris-HCl pH7.6缓冲液,透析脱盐,透析后的样品连同透析袋埋于聚乙二醇(PVP 4000~6000)中,将体积缩小3~5倍后取出。冷藏、储用。(七)Fd制品的浓度和纯度计算:本制品为Fd粗制品,含量的近似值可按克分子消光系数ε420=9.4 L·mmol-1·cm-1,分子量11000计算。Fd的质量指标用O.D420/O.D276吸收比值指示,比值越大,相对Fd含量越高(一般在0.2以上)。

    本发明的积极效果是明显的,本发明的改进之处是省略了大量丙酮有机溶液,解决了安全操作及因离心容器不能使用丙酮的问题,而且DEAE-纤维素又可以再生利用,操作比原来容易得多。用本发明的方法制备得到的Fd是粗制品(尚未把其中的黄素蛋白、Fd-NADP还原酶、铜兰素等分离开来),但对于离体叶绿体的光合电子传递实验来说,粗制品中所含这些未被分离的成分,反而有利于光合电子传递的进行。因此本发明是一种省时、省钱、安全、简易的Fd分离方法。

    以下的附图和实施例将对本发明的技术特征作进一步的描述。

    图1Fd的氧化还原吸收光谱。

    图2依赖Fd的离体叶绿体NADP光还原。

    实施例1:(一)取1公斤新鲜菠菜叶片洗净→去中脉→甩干水份→纱布包紧→-20℃冷冻2-3天→取出后用木棒击碎成粉状→在室温下解冻→使细胞冻融破碎→加入0.02M·L-1Tris-HCl pH7.6缓冲液1500ml→分次用电动捣碎机捣碎成糊状→4层纱布和尼龙网布过滤→挤出液体(呈深绿色)→3000×g离心5分钟→取上层液(呈绿色)。(二)吸附蛋白:将100g原装DEAE-纤维素(D-52)直接分散加入上层液→缓慢搅拌使其分散,吸水膨胀,静放于冰箱(过夜)→倾去部分上层液。(三)装柱:将吸胀后的DEAE转移至层析柱上(直径4cm长30cm)为使DEAE均匀地在柱内沉降,可先在柱内灌满缓冲液,一边灌入吸胀的DEAE,一边缓慢放出柱内溶液,使其均匀沉降下来,应连续灌注,直至完成。(四)洗脱杂蛋白:用含0.15 ML-1 NaCl的0.02M·L-1 Tris-HClpH7.6缓冲液洗柱,连续洗脱不能中断,洗脱过夜,约需耗用5L洗脱液。流出液由起初的深黄色逐渐稀释成微黄色,为保持柱内DEAE界面平整,可以在柱内洗脱液的界面上,浮一片塑料薄片,以便洗脱液下滴时,不直接冲击DEAE-纤维素的界面。(五)收集Fd:当洗脱缓冲液中的NaCl浓度由0.15M更换成0.3M后,柱的上部有一棕红色的环带析出,并洗脱液下移(此为含Fd的部分),洗脱液流速控制在2ml·min-1,合并Fd较集中的部分,体积约50ml。(六)脱盐及浓缩:先把0.3M NaCl洗脱下来的含Fd样品,用10倍体积的0.02M Tris-HCl pH7.6缓冲液透析,更换3次透析液。随后把透析脱盐后的样品,连同透析袋埋于聚乙二醇(PVP 4000),放于冰箱,待透析袋中样品体积浓缩5~10倍后取出,低温贮存。

    将本发明铁氧还蛋白的分离方法制取的Fd用以下实验:(1)Fd的氧化还原吸收光谱

    取0.3ml Fd用0.02M·L-1Tris-HCl pH7.6缓冲液将样品稀释10倍,在岛津UV-3000分光光度计上扫描吸收光谱。可在463nm处看到Fdox的特征吸收峰,此为氧化型Fd的吸收光谱。在Fd样品比色杯中放入一小粒硼氢化钠(强还原剂),再扫描吸收光谱,此时463nm处吸收峰消失,此为还原型Fd的吸收光谱(图1)。表明样品具有Fd吸收光谱的典型特征。(2)需Fd的离体叶绿体NADP光还原

    将用菠菜叶片制备的离体叶绿体,放在含有0.05 mol·L-1 Tris-Hcl pH7.6,5mmol·L-1MgCl2,10mmol·L-1NaCl,0.1mmol·L-1NADP的3ml反应液中,反应液中叶绿体含量为20μg叶绿素。分别置于两个石英比色杯中,其中一个比色杯中加入20μlFd作为样品,另一为对照。先在340nm处比色读OD值。再把样品杯置于光下定时照光,光源用白炽灯或卤素灯,并用10cm厚的玻璃水缸隔热。每照光半分钟后立即测OD值变化。从图2可以看到,含Fd的一组在340nm处的光密度值会随着照光的进程而上升,表示有NADP还原,而不含Fd的一组,仅有微小上升,这可能是离体叶绿体制剂中残留的内源Fd引起。根据光暗的OD差值即可算出NADP的光还原速率。见图2。

    从上述结果表明:本发明分离方法制备的Fd为粗制品,其纯度虽不能与商品Fd相比,但对测定离体叶绿体NADP还原实验来说,反而比纯化的Fd有利,因为在非循环光合电子传递链上,还原的Fd向NADP传递电子时,还需要Fd-NADP还原酶(FNR)的催化,如果Fd很纯,则反应系统中还需要另加FNR,而本发明分离方法的Fd制剂中,恰好残留有FNR等黄素蛋白,这对NADP光还原反应的进行是有利的,这进一步说明了本发明的积极效果。

铁氧还蛋白的简易分离方法.pdf_第1页
第1页 / 共9页
铁氧还蛋白的简易分离方法.pdf_第2页
第2页 / 共9页
铁氧还蛋白的简易分离方法.pdf_第3页
第3页 / 共9页
点击查看更多>>
资源描述

《铁氧还蛋白的简易分离方法.pdf》由会员分享,可在线阅读,更多相关《铁氧还蛋白的简易分离方法.pdf(9页珍藏版)》请在专利查询网上搜索。

本发明涉及一种植物铁氧还蛋白的简易分离方法。铁氧还蛋白是普遍存在于植物体内的一种低分子量具有氧化还原性质的蛋白,它参与光合作用和生物固氮等生理活动。是一种重要的生物化学试剂。传统的分离方法需耗用大量的丙酮,本发明提供一种省略丙酮的分离步骤,解决由于使用丙酮带来工艺上的困难。产品适用于对铁氧还蛋白纯度要求不是很高的生化反应,对于光合电子传递的离体实验,由于某些成分未被分离,反而有利反应进行。。

展开阅读全文
相关资源
猜你喜欢
相关搜索

当前位置:首页 > 化学;冶金 > 有机化学〔2〕


copyright@ 2017-2020 zhuanlichaxun.net网站版权所有
经营许可证编号:粤ICP备2021068784号-1