铁氧还蛋白的简易分离方法 本发明属于一种植物蛋白的分离方法。
铁氧还蛋白(Ferredoxin,简称Fd)是普遍存在于植物界的一种低分子量(Mr为11000),具有氧化还原性质的蛋白,它参与碳同化和硝酸盐还原等诸多生理活动,许多涉及光合作用和生物固氮等实验都会用到这种生物化学试剂。虽然商品Fd试剂纯度较高,但价格昂贵。而传统的Fd的分离方法需耗用大量丙酮(植物生理学通讯1984(1):46-47)。该方法的主要流程为:(一)用菠菜叶预先深冻(-20℃),室温下解冻,使细胞冻融破裂,加入0.01M Tris-HCI pH7.3缓冲液,捣碎冻融叶片,纱布过滤。(二)滤液中加入深冷(-20℃)丙酮,使之浓度到35%丙酮。经5000×g离心,把沉淀弃去。在离心后的上层液中继续加入深冷丙酮,使之浓度达到75%,静止后,使沉淀沉降,吸去部分上清液后,余留带有沉淀的75%浓度丙酮溶液,经5000×g离心,收集沉淀,用冷风吹干残留沉淀中的丙酮,并使悬浮于0.01M Tris-HCIpH7.3缓冲液,对同样缓冲液透析,再经18000×g离心20分钟,红棕色的上层液为含Fd的粗制品。(三)在红棕色的样品中加入固体NaCl,使之成0.15M NaCl浓度,并把它吸附到预先经0.01M Tris-HCI pH7.3和0.15M NaCl平衡过的DEAE-纤维素(D-52)分离柱上。以同样的缓冲液洗柱,未被吸附的样品流弃。深棕红色地Fd吸附带呈现在分离柱的上端。再分次提高洗脱缓冲液中的NaCl浓度以0.2M、0.25M、0.3M……。同时观察分离柱的上端Fd移动的情况,直到提高NaCl浓度到棕红色吸附带开始下降移动,就不再提升NaCl浓度,继续洗脱,并收集出棕红色的Fd制剂。(四)将收集的Fd溶液,对不含NaCl的0.01M Tris-HCI pH7.3透析脱盐,浓缩保存、备用。但用此方法如提取1Kg菠菜叶片,共需耗丙酮6立升,大量用过的丙酮不仅对回收、处理带来麻烦,而且由于高浓度的丙酮在操作过程中不能用塑料容器,这还对离心设备的使用带来诸多不便,且成本高,又不安全。
本发明的目的是提供一种屏弃丙酮,省时、省钱、安全、简便的Fd分离方法,此方法虽在得率和纯度上不及丙酮提取方法,但在光合电子传递的离体实验中,由于某些成分(Fd-NADP-还原酶、铜兰素等)未被分离掉,反而有利生化反应的进行。同时也解决了由于使用大量高浓度的丙酮,对离心操作带来不便,及对废丙酮回收处理带来的麻烦。
本发明提出的铁氧还蛋白的分离方法,是目前最简单的方法,本发明是这样实现的:(一)菠菜或豌豆叶片的深冻、捣碎、过滤、离心的提取步骤与已有技术相同,缓冲液用0.02M Tris-HCl pH7.6得到第一步提取液后,关键在省略了第二步,不再用35%~75%的丙酮分级沉淀,而是直接用DEAE-纤维素(D-52)吸附蛋白。(二)吸附蛋白:把DEAE-纤维素(D-52)原装干粉,直接投到提取液中,使其充分吸附提取液中的蛋白。缓慢搅拌使DEAE-纤维素分散吸胀。(三)装柱:把吸附蛋白后,呈深色的DEAE-纤维素装到层析柱直径4cm、长25-30cm)上,为了使DEAE均匀地在柱内沉降,可先在柱内装满缓冲液,一边在柱上端加入吸胀的DEAE-纤维素,一边在柱下端放出柱内溶液,使其均匀地沉降下来,缓慢操作,连续灌注,直至完成。(四)洗脱杂蛋白:用含0.15M NaCl的0.02M Tris-HCl pH7.6缓冲液洗柱,需连续洗脱不能中断,使之洗脱过夜,大量不被吸附的蛋白被洗脱掉。流出液由起始的呈深黄色逐渐变淡呈微黄色。(五)收集Fd:当洗脱液中的NaCl浓度由0.15M提高到0.3M,继续洗脱时,DEAE-纤维素柱的上端可以看到有一棕色环带析出,并随洗脱而下移,此为含Fd成份的部分,控制流速,使其尽可能集中在体积较小的洗脱液中。收集棕红色的洗脱液部分。(六)脱盐及浓缩:一般用水溶液法提取得到的Fd制剂较稀,需经浓缩。可以用超滤膜方法来脱盐浓缩,也可以先把样品,对不含NaCl的0.02M Tris-HCl pH7.6缓冲液,透析脱盐,透析后的样品连同透析袋埋于聚乙二醇(PVP 4000~6000)中,将体积缩小3~5倍后取出。冷藏、储用。(七)Fd制品的浓度和纯度计算:本制品为Fd粗制品,含量的近似值可按克分子消光系数ε420=9.4 L·mmol-1·cm-1,分子量11000计算。Fd的质量指标用O.D420/O.D276吸收比值指示,比值越大,相对Fd含量越高(一般在0.2以上)。
本发明的积极效果是明显的,本发明的改进之处是省略了大量丙酮有机溶液,解决了安全操作及因离心容器不能使用丙酮的问题,而且DEAE-纤维素又可以再生利用,操作比原来容易得多。用本发明的方法制备得到的Fd是粗制品(尚未把其中的黄素蛋白、Fd-NADP还原酶、铜兰素等分离开来),但对于离体叶绿体的光合电子传递实验来说,粗制品中所含这些未被分离的成分,反而有利于光合电子传递的进行。因此本发明是一种省时、省钱、安全、简易的Fd分离方法。
以下的附图和实施例将对本发明的技术特征作进一步的描述。
图1Fd的氧化还原吸收光谱。
图2依赖Fd的离体叶绿体NADP光还原。
实施例1:(一)取1公斤新鲜菠菜叶片洗净→去中脉→甩干水份→纱布包紧→-20℃冷冻2-3天→取出后用木棒击碎成粉状→在室温下解冻→使细胞冻融破碎→加入0.02M·L-1Tris-HCl pH7.6缓冲液1500ml→分次用电动捣碎机捣碎成糊状→4层纱布和尼龙网布过滤→挤出液体(呈深绿色)→3000×g离心5分钟→取上层液(呈绿色)。(二)吸附蛋白:将100g原装DEAE-纤维素(D-52)直接分散加入上层液→缓慢搅拌使其分散,吸水膨胀,静放于冰箱(过夜)→倾去部分上层液。(三)装柱:将吸胀后的DEAE转移至层析柱上(直径4cm长30cm)为使DEAE均匀地在柱内沉降,可先在柱内灌满缓冲液,一边灌入吸胀的DEAE,一边缓慢放出柱内溶液,使其均匀沉降下来,应连续灌注,直至完成。(四)洗脱杂蛋白:用含0.15 ML-1 NaCl的0.02M·L-1 Tris-HClpH7.6缓冲液洗柱,连续洗脱不能中断,洗脱过夜,约需耗用5L洗脱液。流出液由起初的深黄色逐渐稀释成微黄色,为保持柱内DEAE界面平整,可以在柱内洗脱液的界面上,浮一片塑料薄片,以便洗脱液下滴时,不直接冲击DEAE-纤维素的界面。(五)收集Fd:当洗脱缓冲液中的NaCl浓度由0.15M更换成0.3M后,柱的上部有一棕红色的环带析出,并洗脱液下移(此为含Fd的部分),洗脱液流速控制在2ml·min-1,合并Fd较集中的部分,体积约50ml。(六)脱盐及浓缩:先把0.3M NaCl洗脱下来的含Fd样品,用10倍体积的0.02M Tris-HCl pH7.6缓冲液透析,更换3次透析液。随后把透析脱盐后的样品,连同透析袋埋于聚乙二醇(PVP 4000),放于冰箱,待透析袋中样品体积浓缩5~10倍后取出,低温贮存。
将本发明铁氧还蛋白的分离方法制取的Fd用以下实验:(1)Fd的氧化还原吸收光谱
取0.3ml Fd用0.02M·L-1Tris-HCl pH7.6缓冲液将样品稀释10倍,在岛津UV-3000分光光度计上扫描吸收光谱。可在463nm处看到Fdox的特征吸收峰,此为氧化型Fd的吸收光谱。在Fd样品比色杯中放入一小粒硼氢化钠(强还原剂),再扫描吸收光谱,此时463nm处吸收峰消失,此为还原型Fd的吸收光谱(图1)。表明样品具有Fd吸收光谱的典型特征。(2)需Fd的离体叶绿体NADP光还原
将用菠菜叶片制备的离体叶绿体,放在含有0.05 mol·L-1 Tris-Hcl pH7.6,5mmol·L-1MgCl2,10mmol·L-1NaCl,0.1mmol·L-1NADP的3ml反应液中,反应液中叶绿体含量为20μg叶绿素。分别置于两个石英比色杯中,其中一个比色杯中加入20μlFd作为样品,另一为对照。先在340nm处比色读OD值。再把样品杯置于光下定时照光,光源用白炽灯或卤素灯,并用10cm厚的玻璃水缸隔热。每照光半分钟后立即测OD值变化。从图2可以看到,含Fd的一组在340nm处的光密度值会随着照光的进程而上升,表示有NADP还原,而不含Fd的一组,仅有微小上升,这可能是离体叶绿体制剂中残留的内源Fd引起。根据光暗的OD差值即可算出NADP的光还原速率。见图2。
从上述结果表明:本发明分离方法制备的Fd为粗制品,其纯度虽不能与商品Fd相比,但对测定离体叶绿体NADP还原实验来说,反而比纯化的Fd有利,因为在非循环光合电子传递链上,还原的Fd向NADP传递电子时,还需要Fd-NADP还原酶(FNR)的催化,如果Fd很纯,则反应系统中还需要另加FNR,而本发明分离方法的Fd制剂中,恰好残留有FNR等黄素蛋白,这对NADP光还原反应的进行是有利的,这进一步说明了本发明的积极效果。