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1、(10)申请公布号 CN 104031127 A (43)申请公布日 2014.09.10 CN 104031127 A (21)申请号 201410305933.1 (22)申请日 2014.07.01 C07K 7/08(2006.01) C07K 1/08(2006.01) C07K 1/04(2006.01) (71)申请人 济南康和医药科技有限公司 地址 250101 山东省济南市高新区颖秀路 2766 号科研楼 8 层 (72)发明人 张颖 刘鹏 李同金 朱玉正 石鑫磊 高国锐 姜寿俊 孙健 刘元鑫 王学斌 李洪爽 郑良文 (54) 发明名称 一种固液结合制备比伐卢定的方法 (57。
2、) 摘要 本发明属于多肽合成领域， 涉及一种固液结 合制备比伐卢定的方法， 本发明采用液相和固相 相结合的方法制备比伐卢定， 能够很好的避免杂 质肽的产生， 提高粗肽纯度， 降低生产成本。该方 法首先采用液相法合成片段六肽 Fmoc-Arg(pbf) -Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-OH， 然后再在固相上接 肽， 利用此方法可以避免产生杂质肽 BivGly 和 Biv2Gly， 还避免了固相接 Arg 时难以偶联完全 的难题 ； 利用此合成工艺， 可以使粗肽纯度达到 90% 以上， 降低了纯化难度， 使最终产品的纯度超 过 99.5%， 进一步降低了生产成本。与现有技术相 比， 本发。
3、明工艺操作简单， 合成成本低， 利于工业 大规模生产。 (51)Int.Cl. 权利要求书 2 页 说明书 7 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书2页 说明书7页 (10)申请公布号 CN 104031127 A CN 104031127 A 1/2 页 2 1. 一种固液结合制备比伐卢定的方法， 其特征在于， 包括如下步骤 ： （a） 采用 Wang 树脂或 2-chlorotrityl 树脂为固相载体， 用 Fmoc-Leu-OH 与之偶联反应 制备 Fmoc-Leu-Wang 树脂或 Fmoc-Leu-CTC 树脂， 脱保护试剂脱掉保护基 Fmoc。
4、 后， 再按序列 依次偶联连接 11 个 Fmoc 保护氨基酸， 得侧链保护的比伐卢定 9-20 肽树脂 ； 比伐卢定 9-20 肽树脂的结构如下 ： Fmoc-Asn(Trt)-Gly-Asp(OtBu)-Phe-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ile-Pro-Glu(OtBu)-Glu (OtBu)-Tyr(tBu)- Leu- 树脂 ； （b） 在液相条件下由双甘肽和 Boc-Pro-OH 为原料制备 Pro-Gly-Gly -Gly-Gly-OH， 然 后 再 用 Fmoc-Arg(pbf)-OH 与 之 反 应 得 到 片 段 六 肽 Fmoc-Arg(pbf)-Pro-Gl。
5、y- Gly-Gly-Gly-OH ； （c）比 伐 卢 定 9-20 肽 树 脂 脱 Fmoc 后 和 片 段 六 肽 Fmoc-Arg(pbf)-Pro-Gly- Gly-Gly- Gly-OH 在固相条件下缩合反应生成 18 肽片段肽保护树脂， 再按序列依次连接上 Fmoc-Pro-OH 和 Boc-D-Phe-OH 或 Fmoc-D-Phe-OH， 完成比伐卢定肽树脂的制备， 经裂解、 纯 化、 冷冻干燥得比伐卢定精肽。 2. 根 据 权 利 要 求 1 所 述 的 制 备 方 法， 其 特 征 在 于 ： 步 骤 （a）中， 所 述 制 备 的 Fmoc-Leu-Wang 树脂或 F。
6、moc-Leu-CTC 树脂替代度为 0.3-1.5mmol/g ； 所述脱保护试剂为体积比 20% 哌啶的 DMF 溶液 ； 偶联反应中所用的缩合剂为以下组合 DIC/HOBT、 DIC/HOAT、 TBTU/HOBT/DIPEA、 HBTU/HOBT/DIPEA、 HATU/HOAT/DIPEA 的一种。 3. 根 据 权 利 要 求 2 所 述 的 制 备 方 法， 其 特 征 在 于 ： 步 骤 （a）中， 所 述 制 备 的 Fmoc-Leu-Wang 树脂或 Fmoc-Leu-CTC 树脂替代度为 0.4-0.8mmol/g。 4. 根据权利要求 1 所述的固液结合制备比伐卢定的方。
7、法， 其特征在于步骤 （c） 中具体 操作步骤为 ： （1）将 所 述 比 伐 卢 定 9-20 肽 树 脂 用 脱 保 护 试 剂 脱 除 Fmoc 后，再 加 入 Fmoc-Arg(pbf)-Pro -Gly-Gly-Gly-Gly-OH 的活化溶液发生偶联反应， 制得侧链全保护的 比伐卢定 3-20 肽树脂 ： Fmoc-Arg(pbf)-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn(Trt)-Gly-Asp(OtBu)-Phe-Glu(OtBu) -Glu(OtBu)-Ile-Pro- Glu(OtBu)- Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Leu- 树脂 ； （2） 将上述比伐。
8、卢定 3-20 肽树脂用脱保护试剂脱除 Fmoc 后， 再依次与 Fmoc-Pro-OH 和 Boc-D-Phe-OH 发生偶联反应， 制得比伐卢定肽树脂 ； （3） 所得比伐卢定肽树脂经裂解试剂处理后， 滤得裂解液， 经沉降、 分离得比伐卢定粗 肽 ； 所得粗肽经制备液相纯化后得的精肽溶液， 浓缩冻干后得比伐卢定精肽。 5. 根据权利要求 4 所述的制备方法， 其特征在于 ： 所述脱保护试剂为体积比 20% 哌啶 的 DMF 溶液 ； 偶联反应中所用的缩合剂为以下组合 DIC/HOBT、 DIC/HOAT、 TBTU/HOBT/DIPEA、 HBTU/HOBT/DIPEA、 HATU/HOA。
9、T/DIPEA 的一种 ； 所述裂解试剂为加入体积比 1-5% 清除剂的 TFA 溶液， 所述清除剂为苯甲醚、 苯甲硫醚、 乙二硫醇、 巯基乙醇、 苯酚、 水中的一种或几种。 6. 根据权利要求 1 所述的固液结合制备比伐卢定的方法， 其特征在于， 步骤 （b） 中， 所 述片段六肽 Fmoc-Arg(pbf)-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-OH 制备方法为 ： 将Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-OH和碳酸钠溶于水中， 加入Fmoc-Arg(pbf)-OSu的有机溶剂 溶液， 搅拌反应， TLC 监测反应终点， 反应结束后， 加入稀盐酸调溶液 pH 值至 2 3， 析出固 权。
10、 利 要 求 书 CN 104031127 A 2 2/2 页 3 体， 抽滤得白色固体， 水洗 3 遍， 干燥后重结晶， 即得。 7. 根据权利要求 6 所述的制备方法， 其特征在于 ： 所述 Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-OH 和碳 酸钠的摩尔比为 1 ： 1 2 ； Fmoc-Arg(pbf)-OSu 与 Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-OH 摩尔比为 1 ： 0.8 1.2 ； 所述有机溶剂为四氢呋喃、 二氧六环、 丙酮中一种或一种以上的混合液。 8. 根据权利要求 6 或 7 所述的制备方法， 其特征在于， 所述 Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-OH 的制备。
11、方法为 ： 由 Boc-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-OH 经 TFA 处理后， 冷乙醚中析晶得 Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-OH。 9. 根据权利要求 8 所述的制备方法， 其特征在于， 所述 Boc-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-OH 制备方法如下 ： 将双甘肽 Gly-Gly-OH 和碳酸钠溶于水中， 加入 Boc-Pro-OSu 的有机溶剂溶液， 搅拌反应， TLC 监测反应终点， 反应结束后， 减压旋蒸掉有机溶剂， 加入柠檬酸调溶 液 pH 值至 2 3， 乙酸乙酯萃取， 浓缩萃取液， 饱和食盐水洗 3 遍， 加入石油醚析晶得 Boc-Pro-Gly-。
12、Gly-OH ； 将双甘肽 Gly-Gly-OH 和碳酸钠溶于水中， 加入 Boc-Pro-Gly-Gly-OSu 的有机溶剂溶 液， 搅拌反应， TLC 监测反应终点， 反应结束后， 加入柠檬酸调溶液 pH 值至 2 3， 乙酸乙酯 萃取， 浓缩萃取液， 饱和食盐水洗 3 遍， 加入石油醚析晶得 Boc-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-OH。 10. 根据权利要求 9 所述的制备方法， 其特征在于 ： 所述有机溶剂为四氢呋喃、 二氧六 环、 丙酮中一种或一种以上的混合液 ； 双甘肽 Gly-Gly-OH 和碳酸钠的摩尔比为 1 ： 1 2 ； Boc-Pro-OSu 与 Gly-Gl。
13、y-OH 摩尔比为 1 ： 0.8 1.2 ； Boc-Pro-Gly-Gly-OSu 与 Gly-Gly-OH 摩尔比为 1 ： 0.8 1.2。 权 利 要 求 书 CN 104031127 A 3 1/7 页 4 一种固液结合制备比伐卢定的方法 技术领域 0001 本发明涉及多肽合成领域， 特别涉及一种固液结合制备比伐卢定的方法。 技术背景 0002 比伐卢定 （Bivalirudin)， 商品名 Angiomax， 由美国 Medicines 公司申请， 2000 年 12 月经 FDA 批准首先在美国上市。作为抗凝药用于治疗接受经皮冠状动脉腔内成型术 （PTCA） 的不稳定型心绞痛患。
14、者。 比伐卢定是水蛭素类似物， 根据水蛭素蛋白序列设计， 化学 合成。与水蛭素相比， 其作为凝血酶抑制剂具有直接性、 特异性、 可逆性等优点。 0003 比伐卢定是一个有20个氨基酸组成的多肽， 氨基酸序列如下所示 ： D-1Phe-Pro-Ar g-Pro-5Gly-Gly-Gly-Gly-9Asn-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-15Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr-20Leu-OH。 0004 关于比伐卢定的制备方法， 国内外已有大量报道。中国专利 CN101475631A、 CN102164609A、 CN102264757A 采用液相合成方法， 由于比伐卢定含有 20 。
15、个氨基酸残基， 肽 序较长， 液相反应较为繁琐， 不易纯化， 合成起来花费时间较长， 收率低。 0005 比伐卢定结构中含有 -Gly-Gly-Gly-Gly- 片段， 采用固相逐步接肽合成时， 由 于 Gly 自身的特性， 在合成中会极易产生 Bivalirudin1Gly 和 Bivalirudin2Gly 的 杂质肽， 而且这些杂质在后续分离中很难去除 ； 针对上述难题， 专利 WO2010117725 采用 Fmoc-Gly-Gly-OH 作为单体合成比伐卢定， 很好的避免了杂质 Bivalirudin1Gly 的生 成， 但仍然无法避免 Bivalirudin2Gly 的产生 ； C。
16、N102260323A 提出先在液相条件下合成 Fmoc-Gly-Gly-Gly-Gly-OH 四肽片段， 然后将其接到肽树脂上， 再逐步接上剩余氨基酸， 可 有效避免上述四个杂质的产生。 专利CN102286076A和CN102532274A， 其中也是在液相条件 下合成两肽、 三肽或四肽等片段肽， 将其接到肽树脂上， 其目的也是尽量避免上述杂质肽的 生成。 0006 同时比伐卢定的合成过程中， 发现 Fmoc-Gly-Gly-Gly-Gly-OH 的溶解性较差， 即 使在 DMF 中也很难完全溶解， 给接肽反应带来困难 ； 专利 CN103242431A 采取先液相合成片 段 5 肽 Fm。
17、oc-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-OH， 然后再固相接到肽树脂上， 片段 5 肽在 DMF 中的 溶解性远远好于 Fmoc-Gly-Gly-Gly-Gly-OH， 为片段肽的纯化及后续的接肽反应， 降低了难 度。 0007 在比伐卢定的工艺开发中， 3 位 Arg 的连接比较困难， 难以避免产生缺失 Arg 的 杂质或是此位点由于偶联不完全而封端的杂质肽， 即使复投两次也难以达到反应终点 ； 专利 CN102532274A 采用 Fmoc-Arg(Pbf)-Pro-OH 作为单体， 解决了这个问题 ； 但其采用 Fmoc-Gly-Gly-Gly-Gly-OH 作为单体接肽， 仍然会。
18、后遇到溶解困难， 单体难以纯化的问题。 发明内容 0008 为了解决以上比伐卢定合成中遇到的难点， 本发明提供一种固液结合制备比伐卢 定的方法， 既能避免杂质 Bivalirudin1Gly 和 Bivalirudin2Gly 的产生， 又能解决 3 位 Arg 的偶联困难， 需要多次复投的难题 ； 同时提高粗肽的纯度， 降低纯化难度， 使生产成本 说 明 书 CN 104031127 A 4 2/7 页 5 进一步降低， 利于工业上大规模生产比伐卢定。 0009 为实现上述发明目的， 本发明提供以下技术方案 ： 一种固液结合制备比伐卢定的方法， 其特征在于， 包括如下步骤 ： （a）采用 W。
19、ang 树脂或 CTC 树脂为固相载体， 用 Fmoc-Leu-OH 与之偶联反应制备 Fmoc-Leu-Wang树脂或Fmoc-Leu-CTC树脂， 再按序列依次偶联连接11个Fmoc保护氨基酸， 得侧链保护比伐卢定 9-20 肽树脂 ； 比伐卢定 9-20 肽树脂的结构如下 ： Fmoc-Asn(Trt)-Gly-Asp(OtBu)-Phe-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ile-Pro-Glu(OtBu)-Glu (OtBu)-Tyr(tBu)- Leu- 树脂 ； （b）在 液 相 条 件 下 由 双 甘 肽 和 Boc-Pro-OH 或 Fmoc-Pro-OH 为 原 料 制。
20、 备 Pro-Gly-Gly -Gly-Gly-OH， 然 后 再 用 Fmoc-Arg(pbf)-OH 与 之 反 应 得 到 片 段 六 肽 Fmoc-Arg(pbf)-Pro-Gly- Gly-Gly-Gly-OH ； （c） 比 伐 卢 定 9-20 肽 树 脂 脱 掉 Fmoc 保 护 基 后，再 和 片 段 六 肽 Fmoc-Arg(pbf)-Pro-Gly-Gly-Gly- Gly-OH在固相条件下缩合反应生成18肽片段肽保护树 脂， 再按序列依次连接上Fmoc-Pro-OH和Boc-D-Phe-OH或Fmoc-D-Phe-OH， 完成比伐卢定肽 树脂的制备， 经裂解、 纯化、 。
21、冷冻干燥得比伐卢定精肽。 0010 优选的， 步骤 （a）中 ： 所述固相载体为替代度为 0.3-1.5mmol/g 的 Wang 树脂或 CTC 树脂 ； 所述 Fmoc-Leu-Wang 树脂或 Fmoc-Leu-CTC 树脂脱除 Fmoc 保护后， 以 2-3 倍的 投料比加入相应的 Fmoc 保护氨基酸进行偶联反应， 每一个偶联反应均是在缩合剂的存在 下进行的固相接肽反应， 每一步偶联反应均以 Kaiser 试剂检测反应终点， 反应完毕后用脱 保护试剂脱除 Fmoc， 再与下一个 Fmoc 保护氨基酸进行偶联反应 ； 重复操作直至合成得到 侧链全保护的比伐卢定 9-20 肽树脂 ： F。
22、moc-Asn(Trt)-Gly-Asp(OtBu)-Phe-Glu(OtBu) -Glu(OtBu)-Ile-Pro- Glu(OtBu)- Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Leu- 树脂。更进一步优选的， 步 骤 （a） 中， 所述制备的 Fmoc-Leu-Wang 树脂或 Fmoc-Leu-CTC 树脂替代度为 0.3-1.5mmol/g， 优选 0.4-0.8mmol/g ； 所述脱保护试剂优选为 20% 哌啶的 DMF 溶液 （体积比） ； 偶联反应中所 用的缩合剂为以下组合 DIC/HOBT、 DIC/HOAT、 TBTU/HOBT/DIPEA、 HBTU/HOBT/DIPE。
23、A、 HATU/ HOAT/DIPEA 的一种。 0011 优选的， 所述步骤 （c） 中具体操作步骤为 ： （1）将 所 述 比 伐 卢 定 9-20 肽 树 脂 用 脱 保 护 试 剂 脱 除 Fmoc 后，再 加 入 Fmoc-Arg(pbf)-Pro -Gly-Gly-Gly-Gly-OH 的活化溶液发生偶联反应， 制得侧链全保护的 比伐卢定 3-20 肽树脂 ： Fmoc-Arg(pbf)-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn(Trt)-Gly-Asp(OtBu)-Phe-Glu(OtBu) -Glu(OtBu)-Ile-Pro- Glu(OtBu)- Glu(OtBu)-。
24、Tyr(tBu)-Leu- 树脂 ； （2） 将上述比伐卢定 3-20 肽树脂用脱保护试剂脱除 Fmoc 后， 再依次与 Fmoc-Pro-OH 和 Boc-D-Phe-OH 发生偶联反应， 制得比伐卢定肽树脂 ； （3） 所得比伐卢定肽树脂经裂解试剂处理后， 滤得裂解液， 经沉降、 分离得比伐卢定粗 肽 ； 所得粗肽经制备液相纯化后得的精肽溶液， 浓缩冻干后得比伐卢定精肽。 0012 进一步优选的， 所述脱保护试剂优选为 20% 哌啶的 DMF 溶液 （体积比） ； 偶联反应中 所用的缩合剂为以下组合 DIC/HOBT、 DIC/HOAT、 TBTU/HOBT/DIPEA、 HBTU/HOB。
25、T/DIPEA、 HATU/ 说 明 书 CN 104031127 A 5 3/7 页 6 HOAT/DIPEA 的一种 ； 所述裂解试剂为加入体积比 1-5% 清除剂的 TFA 溶液， 所述清除剂为苯 甲醚、 苯甲硫醚、 乙二硫醇、 巯基乙醇、 苯酚、 水中的一种或几种。 0013 优选的， 步骤 （b） 中， 所述片段六肽 Fmoc-Arg(pbf)-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-OH 制 备方法为 ： 将Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-OH和碳酸钠溶于水中， 加入Fmoc-Arg(pbf)-OSu的有机溶剂 溶液， 搅拌反应， TLC 监测反应终点， 反应结束后， 加入。
26、稀盐酸调溶液 pH 值至 2 3， 析出固 体， 抽滤得白色固体， 水洗 3 遍， 干燥后重结晶， 即得。 0014 所 述 Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-OH 和 碳 酸 钠 的 摩 尔 比 为 1 ： 1 2 ； Fmoc-Arg(pbf)-OSu 与 Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-OH 摩尔比为 1 ： 0.8 1.2 ； 所述有机溶剂为 四氢呋喃、 二氧六环、 丙酮中一种或一种以上的混合液。 0015 优选的， 所述 Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-OH 的制备方法为 ： 由 Boc-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-OH 经 TFA 处理后， 冷乙醚。
27、中沉降析出。 0016 优选的， 所述 Boc-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-OH 制备方法如下 ： 将双甘肽 Gly-Gly-OH 和碳酸钠溶于水中， 加入 Boc-Pro-OSu 的有机溶剂溶液， 搅拌反 应， TLC监测反应终点， 反应结束后， 减压蒸掉有机溶剂， 加入10%柠檬酸水溶液调溶液pH值 至 2 3， 乙酸乙酯萃取， 浓缩后加入石油醚析晶得 Boc-Pro-Gly-Gly-OH ； 将双甘肽 Gly-Gly-OH 和碳酸钠溶于水中， 加入 Boc-Pro-Gly-Gly-OSu 的有机溶剂溶 液， 搅拌反应， TLC 监测反应终点， 反应结束后， 加入 10% 柠檬。
28、酸水溶液调溶液 pH 值至 2 3， 乙酸乙酯萃取， 浓缩后加入石油醚析晶得 Boc-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-OH。 0017 更进一步优选的， 所述有机溶剂为四氢呋喃、 二氧六环、 丙酮中一种或一种以上的 混合液 ； 双甘肽 Gly-Gly-OH 和碳酸钠的摩尔比为 1 ： 1 2 ； Boc-Pro-OSu 与 Gly-Gly-OH 摩 尔比为 1 ： 0.8 1.2 ； Boc-Pro-Gly-Gly-OSu 与 Gly-Gly-OH 摩尔比为 1 ： 0.8 1.2。 0018 相对于现有技术， 本发明的有益效果是 ： 本发明首次液相合成 Fmoc-Arg(pbf)-P。
29、ro-Gly-Gly-Gly-Gly-OH， 并将其应用于比伐卢 定的固相合成中， 使得杂质BivalirudinGly的含量降低到0.1%以下 ； 同时采用片段六肽 Fmoc-Arg(pbf)-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-OH 参与接肽反应， 解决了 Arg 偶联困难的问题， 提 高了比伐卢定粗肽的纯度， 使粗肽纯度超过 90% ； 降低了纯化难度， 使最终产品的纯度超过 99.5%， 进一步降低了生产成本。与现有技术相比， 本发明工艺操作简单， 合成成本低， 利于 工业大规模生产。 具体实施方式 0019 下面用具体实施例对本发明进行详细说明， 但不限定本专利 ； 根据本发明改。
30、变原 料的投料比、 或是反应溶剂或及缩合剂等， 均在本发明的保护范围内。 0020 说明书和权利要求书中所使用的缩写含义如下 ： Fmoc 9- 芴甲氧羰基 CTC 树脂 2- 氯三苯甲基氯树脂 Wang Resins 王树脂 tBu 叔丁基 Pbf 2,2,4,6,7- 五甲基苯并呋喃 -5- 磺酰基 说 明 书 CN 104031127 A 6 4/7 页 7 Trt 三苯甲基 DCM 二氯甲烷 DMF N,N- 二甲基甲酰胺 DMAP 4- 二甲氨基吡啶 DIPEA N,N- 二异丙基乙胺 DIC N,N- 二异丙基碳二亚胺 HBTU 苯并三氮唑 -N,N,N,N- 四甲基脲六氟磷酸盐 。
31、HATU 2-(7- 偶氮苯并三氮唑 )-N,N,N,N- 四甲基脲六氟磷酸酯 TBTU O- 苯并三氮唑 -N,N,N,N- 四甲基脲四氟硼酸 HOBT 1- 羟基苯并三唑 HOAT 1- 羟基 -7- 偶氮苯并三氮唑 TFA 三氟乙酸 HOSu N- 羟基琥珀酰亚胺 实施例 1 ： Boc-Pro-Gly-Gly-OH 的制备 准确称取双甘肽 Gly-Gly-OH 79.8g（0.6mol） 和碳酸钠 127.2g（1.2mol） 溶于 1200mL 水中， 低温下 （2-8） 缓慢加入 Boc-Pro-OSu 的四氢呋喃溶液 （123.6g， 0.6mol） /1000ml， 搅 拌反应。
32、， TLC 监测反应终点， 反应完全后， 旋蒸掉 THF， 冰水浴下加入 10% 柠檬酸水溶液调溶 液 pH 值至 2 3， 1000ml 乙酸乙酯萃取 3 次 , 合并有机相， 旋蒸浓缩至 1000ml， 200ml 饱和 食盐水洗3次， 无水硫酸钠干燥， 加入石油醚2000ml析晶， 得Boc-Pro-Gly-Gly-OH 148.4g， 收率 75.2%。 0021 实施例 2 ： Boc-Pro-Gly-Gly-OH 的制备 准确称取双甘肽 Gly-Gly-OH 79.8g （0.6mol） 和碳酸钠 63.6g （0.6mol） 溶于 1200mL 水 中， 低温下 （2-8） 缓慢。
33、加入 Boc-Pro-OSu 的四氢呋喃溶液 （123.6g， 0.6mol） /1000ml， 搅拌 反应， TLC 监测反应终点， 反应完全后， 旋蒸掉 THF， 冰水浴下加入 10% 柠檬酸水溶液调溶液 pH 值至 2 3， 1000ml 乙酸乙酯萃取 3 次 , 合并有机相， 旋蒸浓缩至 1000ml， 200ml 饱和食 盐水洗 3 次， 无水硫酸钠干燥， 加入石油醚 2000ml 析晶， 得 Boc-Pro-Gly-Gly-OH 145.2g， 收率 73.5%。 0022 实施例 3 ： Boc-Pro-Gly-Gly -Gly-Gly-OH 的制备 准 确 称 取 双 甘 肽 。
34、Gly-Gly-OH 53.2g（0.4mol) 和 碳 酸 钠 84.8g（0.8mol) 溶 于 800mL 水中， 低温下 （2-8）缓慢加入 Boc-Pro-Gly-Gly-OSu 的四氢呋喃溶液 （170.4g， 0.4mol） /1000ml， 搅拌反应， TLC 监测反应终点， 反应完全后， 旋蒸掉 THF， 冰水浴下加入 10% 柠檬酸水溶液调溶液 pH 值至 2 3， 1000ml 乙酸乙酯萃取 3 次， 合并有机相， 旋蒸 浓缩至 800ml， 120ml 饱和食盐水洗 3 次， 无水硫酸钠干燥， 加入石油醚 1200ml 析晶， 得 Boc-Pro-Gly-Gly-Gly。
35、- Gly-OH 128.6g， 收率 72.6% 。 0023 实施例 4 ： Boc-Pro-Gly-Gly -Gly-Gly-OH 的制备 准 确 称 取 双 甘 肽 Gly-Gly-OH 53.2g（0.4mol) 和 碳 酸 钠 42.4g（0.4mol) 溶 于 800mL 水中， 低温下 （2-8）缓慢加入 Boc-Pro-Gly-Gly-OSu 的四氢呋喃溶液 （170.4g， 0.4mol） /1000ml， 搅拌反应， TLC 监测反应终点， 反应完全后， 旋蒸掉 THF， 冰水浴下加入 10% 柠檬酸水溶液调溶液 pH 值至 2 3， 1000ml 乙酸乙酯萃取 3 次，。
36、 合并有机相， 旋蒸 说 明 书 CN 104031127 A 7 5/7 页 8 浓缩至 800ml， 120ml 饱和食盐水洗 3 次， 无水硫酸钠干燥， 加入石油醚 1200ml 析晶， 得 Boc-Pro-Gly-Gly-Gly- Gly-OH 121.6g， 收率 68.6%。 0024 实施例 5 ： Fmoc-Arg(pbf)-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-OH 准确称取 Boc-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-OH 88.6g （200mmol) 溶于 300mlTFA 中， 搅拌反应 30 分钟后， 将其加入 3L 冷乙醚中， 静置 1h 后， 抽滤得白色固。
37、体， 冷乙醚洗涤六次后， 真空干 燥， 加入 400mL 水溶解， 缓慢加入碳酸钠调 pH 至 3-4 后， 再加入碳酸钠 21.2g （200mmol) ； 低 温下 （2-8） 缓慢加入 Fmoc-Arg(pbf)-OSu 的四氢呋喃溶液 （152g， 200mmol） /1000ml， 搅拌 反应， TLC 监测反应终点， 反应完全后， 加入稀盐酸调溶液 pH 值至 2 3， 析出固体， 抽滤得 白色固体， 水洗 3 遍， 干燥后重结晶得 Fmoc-Arg(pbf)-Pro- Gly-Gly-Gly-Gly-OH 160.1g， 收率 80.2%。 0025 实施例 6 ： Fmoc-A。
38、rg(pbf)-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-OH 准确称取 Boc-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-OH 88.6g（200mmol) 溶于 300mlTFA 中， 搅拌反 应 30 分钟后， 将其加入 3L 冷乙醚中， 静置 1h 后， 抽滤得白色固体， 冷乙醚洗涤六次后， 真空 干燥， 加入 400mL 水溶解， 缓慢加入碳酸钠调 pH 至 3-4 后， 再加入碳酸钠 42.4g （400mmol) ； 低温下 （2-8） 缓慢加入 Fmoc-Arg(pbf)-OSu 的四氢呋喃溶液 （152g, 200mmol） /1000ml， 搅拌反应， TLC 监测反应终点， 。
39、反应完全后， 加入稀盐酸调溶液 pH 值至 2 3， 析出固体， 抽滤得白色固体， 水洗 3 遍， 干燥后重结晶得 Fmoc-Arg(pbf)-Pro- Gly-Gly-Gly-Gly-OH 176.9g， 收率 89.5%。 0026 实施例 7: Fmoc-Leu-Wang Resins 的合成 将载体 Wang 树脂 20.0g(sub=1.0mmol/g) 置于合成柱中， 用 120mL DMF 洗涤两次， 加入 120mL DCM 溶胀 30min ； 抽滤掉 DCM 后， 加入 Fmoc-Leu-OH/DIC/HOBT 的混合 DCM 溶液 称取 8.472g(24mmol) Fm。
40、oc-Leu-OH 和 3.240g(24mmol) HOBT 置于亮氨酸活化瓶， 加入 120mL 体 积比例为 1 1 的 DMF 和 DCM 混合溶液搅拌溶解， 低温 (0） 下加入 3.024g(24mmol) DIC, 活化 5 分钟 ， 反应 10min 后加入 0.264g(0.24mmol) DMAP ； 反应 2h， 抽掉反应液， 用 120mL DMF 洗涤两次， 加入封端试剂 120mL(24ml 乙酸酐和 20.4ml 吡啶溶解于 75.6mL DMF 中 ) 反 应2h， 抽滤掉反应液， 分别用DMF、 DCM、 甲醇洗涤2次， 真空干燥后得Fmoc-Leu-Wang。
41、 Resins 25.7 ； 取少量树脂， 测替代度为 0.68mmol/g。 0027 实施例 8: Fmoc-Leu-Wang Resins 的合成 将载体 Wang 树脂 10.0g(sub=1.0mmol/g) 置于合成柱中， 用 60mL DMF 洗涤两次， 加入 60mL DCM 溶胀 30min ； 抽滤掉 DCM 后， 加入 Fmoc-Leu-OH/DIC/HOBT 的混合 DCM 溶液 称取 4.236g(12mmol) Fmoc-Leu-OH 和 1.620g(12mmol) HOBT 置于亮氨酸活化瓶， 加入 60mL 体积 比例为 1 1 的 DMF 和 DCM 混合溶。
42、液搅拌溶解， 低温 （0） 下加入 1.512g(12mmol) DIC， 活 化 5 分钟 , 反应 10min 后加入 0.132g 0.12mmol)DMAP ； 反应 1h， 抽掉反应液， 用 60mL DMF 洗涤两次， 加入封端试剂 60mL(12ml 乙酸酐和 10.2ml 吡啶溶解于 38mL DMF 中 ) 反应 2h， 抽 滤掉反应液， 分别用DMF、 DCM、 甲醇洗涤2次， 真空干燥后得Fmoc-Leu-Wang Resins12.2 ； 取少量树脂， 测替代度为 0.42mmol/g。 0028 实施例 9: Fmoc-Leu-CTC Resins 的合成 称取CTC。
43、树脂10.0g置于合成柱中， 用60mL DMF 洗涤两次,加入60mL DCM溶胀30min ； 抽滤掉 DCM 后， 加入溶有 Fmoc-Leu-OH 3.53g 的 DCM 溶液 60ml， 搅拌后加入 DIPEA 9.24ml， 说 明 书 CN 104031127 A 8 6/7 页 9 鼓 N2 反应 60min， 抽掉反应液， 加入 DCM/CH3OH/DIPEA ( 体积比 17 ： 2 ： 1) 混合溶液 60ml 封 端 3 次， 每次 5min ； 然后用 DMF、 DCM、 甲醇分别洗涤 2 次， 真空干燥得 Fmoc-Leu-CTC Resins 13.2g。测替代度。
44、为 0.65mmol/g. 实施例 10 ： 比伐卢定肽树脂的制备 准确称取替代度为 0.68mmol/g Fmoc-Leu-Wang Resins 14.7g( 合成规模 10mmol) 置 于合成柱中， 加入 100ml DCM 溶胀 30min ； 抽滤掉 DCM 后， 100ml DMF 洗涤 2 次， 加入 20% 哌啶 /DMF 溶液 160ml 脱保护 2 次， 分别反应 5min 和 10min ； 然后用 100ml DMF、 DCM、 DMF 分 别 洗 涤 2 次 ； 加 入 Fmoc-Tyr(tBu)-OH 9.180g(20mmol)、 HOBT 2.70g(20mm。
45、ol) 和 DIC 3.28ml(20mmol) 的 DMF 溶液 100ml， 鼓 N2搅拌反应 2h， 反应终点以 Kaiser 试剂检 测结果为准， 反应达终点后， 抽掉反应液， 用 100ml DMF、 DCM、 DMF 分别洗涤 2 次 ； 随后再 脱保护。如此反复循环操作， 按照比伐卢定肽序， 逐一和保护氨基酸偶联 ； 依次连接的 保 护 氨 基 酸 为 ： Fmoc-Glu(OtBu)-OH、 Fmoc-Glu(OtBu)-OH、 Fmoc-Pro-OH、 Fmoc-Ile-OH、 Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Phe-OH、F。
46、moc-Asp(OtBu)-OH、 Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Arg(pbf)-Pro- Gly-Gly-Gly-Gly-OH、 Fmoc-Pro-OH、 Boc-D-Phe-OH。肽树脂制备完后， 用 100ml DCM 和甲醇分别洗涤 2 次， 真空干 燥得肽树脂 46.0g。 0029 实施例 11 ： 比伐卢定肽树脂的制备 准确称取替代度为0.42mmol/g Fmoc-Leu-Wang Resins 11.9g(合成规模5mmol)置于合 成柱中， 加入 50ml DCM 溶胀 30min ； 抽滤掉 DCM 后， 50ml DMF 洗涤 2。
47、 次， 加入 20% 哌啶 /DMF 溶液 80ml 脱保护 2 次， 分别反应 5min 和 10min; 然后用 50ml DMF、 DCM、 DMF 分别洗涤 2 次 ； 加入 Fmoc-Tyr(tBu)-OH 4.595g(10mmol)、 HOBT 1.35g(10mmol) 和 DIC 1.64ml(10mmol) 的 DMF 溶液 50ml， 鼓 N2搅拌反应 2h， 反应终点以 Kaiser 试剂检测结果为准， 反应达终点后， 抽 掉反应液， 用 50ml DMF、 DCM、 DMF 分别洗涤 2 次 ； 随后再脱保护。如此反复循环操作， 按照 比伐卢定肽序， 逐一和保护氨基酸。
48、偶联 ； 依次连接的保护氨基酸为 ： Fmoc-Glu(OtBu)-OH、 Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、 Fmoc-Glu(OtBu)-OH、 Fmoc-Phe-OH、 Fmoc-Asp(OtBu)-OH、 Fmoc-Gly-OH、 Fmoc-Asn(Trt)-OH、 Fmoc-Arg(pbf)-Pro- Gly-Gly-Gly-Gly-OH、 Fmoc-Pro-OH、 Boc-D-Phe-OH。 肽树脂制备完后， 用 50ml DCM 和甲醇分别洗涤 2 次， 真空干燥得肽树脂 27.55g。 003。
49、0 实施例 12 ： 比伐卢定肽树脂的制备 准确称取替代度为 0.65mmol/g Fmoc-Leu-CTC Resins 7.7g( 合成规模 5mmol) 置于 合成柱中， 加入 50ml DCM 溶胀 30min ； 抽滤掉 DCM 后， 50ml DMF 洗涤 2 次， 加入 20% 哌啶 / DMF 溶液 80ml 脱保护 2 次， 分别反应 5min 和 10min; 然后用 50ml DMF、 DCM、 DMF 分别洗 涤 2 次 ； 加入 Fmoc-Tyr(tBu)-OH 4.595g、 HOBT 1.35g 和 DIC 1.64m 的 DMF 溶液 50ml， 鼓 N2 搅拌反应 2h， 反应终点以 Kaiser 试剂检测结果为准， 反应达终点后。