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1、(10)申请公布号 CN 104152584 A (43)申请公布日 2014.11.19 CN 104152584 A (21)申请号 201410394083.7 (22)申请日 2014.08.12 C12Q 1/70(2006.01) C12Q 1/68(2006.01) C12N 15/11(2006.01) C12R 1/93(2006.01) (71)申请人 重庆出入境检验检疫局检验检疫技 术中心 地址 400020 重庆市江北区红黄路 8 号 (72)发明人 聂福平 王昱 杨俊 李应国 王国民 李贤良 (74)专利代理机构 重庆市恒信知识产权代理有 限公司 50102 代理人 。
2、刘小红 (54) 发明名称 羊痘病毒属病毒 Taqman-MGB 探针多重实时 荧光定量 PCR 检测用引物、 方法和试剂盒 (57) 摘要 本 发 明 公 开 了 一 种 羊 痘 病 毒 属 病 毒 的 Taqman-MGB 探针多重实时荧光定量 PCR 检测用 引物、 方法和试剂盒。多重 Taqman-MGB 探针实时 荧光 PCR 方法可对牛疙瘩皮肤病病毒 （LSDV） 、 山 羊痘病毒 (GTPV)、 绵羊痘病毒 （SPPV） 进行快速检 测。本检测方法以三种痘病毒靶序列的保守区域 为基础， 设计 1 对引物和 3 条 Taqman-MGB 探针。 本发明只需要两步法扩增法及简单的反应。
3、条件就 可以快速、 高效、 特异性、 高灵敏度地检测目的靶 序列， 且操作简便， 不需要昂贵的仪器和试剂， 对 操作人员没有技术上的要求， 检测成本低， 检测时 间短。可避免因进行琼脂糖电泳而可能造成的交 叉污染， 从而提高检测的准确率和可信度。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 6 页 序列表 2 页 附图 4 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书6页 序列表2页 附图4页 (10)申请公布号 CN 104152584 A CN 104152584 A 1/1 页 2 1. 羊痘病毒属病毒 TaqmanMGB 探针多重实时荧。
4、光定量 PCR 检测用引物及探针， 其特 征在于 ： 包括羊痘病毒属病毒通用上游引物， 其 NDA 序列为 SEQ ID NO.1; 羊痘病毒属病毒通用下游引物， 其 NDA 序列为 SEQ ID NO.2 ； 牛疙瘩皮肤病病毒 MGB 探针， 其 NDA 序列为 SEQ ID NO.3 ； 山羊痘病毒 MGB 探针， 其 NDA 序列为 SEQ ID NO.4 ； 绵羊痘病毒 MGB 探针， 其 NDA 序列为 SEQ ID NO.5。 2. 羊痘病毒属病毒 TaqmanMGB 探针多重实时荧光定量 PCR 检测用试剂盒， 其特征在 于， 包括扩增反应液管、 阳性对照管、 阴性对照管和灭菌去。
5、离子水管， 其中 ： 所述扩增反应液管， 管内由以下反应液组成 ： DNA 序列为 SEQ ID NO.1 的 10mol/L 的羊痘病毒属病毒通用上游引物 1.6L ； DNA 序列为 SEQ ID NO.2 的 10mol/L 的羊痘病毒属病毒通用下游引物 1.6L ； DNA 序列为 SEQ ID NO.3 的 10mol/L 的牛疙瘩皮肤病病毒 MGB 探针 0.6L ； DNA 序列为 SEQ ID NO.4 的 10mol/L 的山羊痘病毒 MGB 探针 0.3L ； DNA 序列为 SEQ ID NO.5 的 10mol/L 的绵羊痘病毒 MGB 探针 3.0 L ； 2Prem。
6、ix Ex Taq 缓冲液 8 L ； 灭菌去离子水 1.9 L ； 合计 17L， 为单次反应的用量 ； 所述阳性对照管， 管内为牛疙瘩皮肤病病毒、 山羊痘病毒和绵羊痘病毒三种羊痘病毒 属病毒阳性重组质粒的混合 DNA， 体积为 20L ； 所述阴性对照管， 管内为无牛疙瘩皮肤病病毒、 山羊痘病毒和绵羊痘病毒三种羊痘病 毒属病毒感染的上皮组织基因组 DNA， 体积为 20L ； 所述灭菌去离子水管 1mL 2mL。 3.根据权利要求2所述羊痘病毒属病毒TaqmanMGB探针多重实时荧光定量PCR检测 用试剂盒， 其特征在于 ： 所述DNA序列为SEQ ID NO.3的牛疙瘩皮肤病病毒MGB探。
7、针的5，端 标记有 VIC 报告基团， 3，端标记有非淬灭基团 ； DNA 序列为 SEQ ID NO.4 的山羊痘病毒 MGB 探针的 5，端标记有 FAM 报告基团， 3，端标记有非淬灭基团 ； DNA 序列为 SEQ ID NO.5 的绵羊 痘病毒 MGB 探针的 5，端标记有 NED 报告基团， 3，端标记有非淬灭基团。 4. 利用权利要求 2 所述试剂盒进行羊痘病毒属病毒 TaqmanMGB 探针多重实时荧光 定量 PCR 检测的非疾病诊断目的的检测方法， 包括如下步骤 ： 1） 制备待检模板 DNA ： 选用市售化的细胞培养液 DNA 提取试剂盒， 提取待检样品的基因 组 DNA，。
8、 获得待检模板 DNA ； 2） 扩增反应体系为 ： 17L 扩增反应液 ； 3L 待检模板 DNA 或阳性对照或阴性对照 ； 反 应体系的总体积为 20L; 3） 羊痘病毒属病毒荧光定量 PCR 扩增 ： 将步骤 2） 中配制好的扩增反应体系进行 PCR 扩 增， 反应条件 ： 预变性 95 30s ； 95 5s， 60 34s 40 个循环 ； 在 60 34s 进行荧光信号 的采集 ； 4） 结果判定 ： 将扩增反应在 35 个循环以内且扩增曲线良好的反应直接判定为阳性， 35 个循环以后的可直接判定为阴性， 同时阳性对照的扩增明显， 阴性对照没有扩增。 权 利 要 求 书 CN 10。
9、4152584 A 2 1/6 页 3 羊痘病毒属病毒Taqman-MGB探针多重实时荧光定量PCR检 测用引物、 方法和试剂盒 技术领域 0001 本发明涉及动物病毒分子生物学检验方法领域， 具体涉及一种羊痘病毒属病毒 Taqman-MGB 探针多重实时荧光定量 PCR 检测用引物、 方法和试剂盒。 背景技术 0002 羊痘病毒属病毒 （Capripoxvirus,CPV） 包括山羊痘病毒 （Goatpox Virus,GTPV） 、 绵 羊 痘 病 毒 （Sheeppox Virus,SPPV）和 牛 疙 瘩 皮 肤 病 病 毒 （Lumpy Skin Disease Virus,LSDV。
10、） 三种， 能引起山羊、 绵羊和牛的皮肤、 器官表面广泛性结节和水肿， 病畜产乳量 急剧减少， 皮毛品质极大下降， 造成巨大经济损失。山羊痘、 绵羊痘病毒引起的羊痘又名羊 “天花” ， 是羊的一种急性、 热性、 接触性传染病。绵羊痘和山羊痘， 被我国列为一类传染病， 对畜牧业养殖影响重大。根据不同毒株的毒力差异， 易感羊群的致死率可达 10% 58% 或 75% 100% 不等。羔羊致死率可达 100%， 妊娠母羊极易流产。同时， 因自由贸易受到限制 造成了国家税收的下降， 致使此病也成为了重要的经济疾病。 该病呈世界性分布， 我国近年 来在如广西、 贵州、 黑龙江、 甘肃等地也有发生。牛疙瘩。
11、皮肤病病毒引起牛的疙瘩皮肤病， 又称牛结节性皮炎或牛结节疹、 块状皮肤病， 是以患牛发热、 皮肤、 黏膜、 器官表面广泛性结 节， 淋巴结肿大， 皮肤水肿为特征的传染病， 能引起感染动物消瘦， 产乳量大幅度降低， 严重 时导致死亡。被世界动物卫生组织 （OIE） 列为必须通报的动物疫病， 感染率为 5% 85%， 病死率为 10% ； 我国目前尚无牛疙瘩皮肤病病毒流行的报导， 国内也无检测该病的相关研 究， 由于印度和斯堪的纳维亚都有人类感染羊痘病毒的报道， 因此， 本病在公共卫生方面具 有一定的意义。 在印度， 管理患病动物的人有的手和腿上发生红色丘疹， 继而出现水疱并结 痂， 但未见有全身。
12、性的扩散。张瑞阳等 （2003） 首次报道了我国人感染羊痘的病例， 病人手 指、 口唇、 面颊等部位出现丘疹。携带有病毒的牛羊肉存在使人患病的可能性， 对于肉制食 品的安全存在潜在的隐患， 因此， 本发明的试剂盒和检测方法在动物产品及其食品的出入 境的快速检验检疫中具有重大的意义。 0003 羊痘病毒 （Capripoxvirus,CPV） 在分类上属于痘病毒科 （poxviridae） 脊椎动物 痘病毒亚科 （chordopoxrinae） 中的羊痘病毒属 （Capripoxvirus） 。羊痘病毒为砖形病毒， 在细胞浆内复制， 其基因组为双链 DNA。 其大小约为 290nm270nm， 。
13、属于较小的痘病毒， 病 毒粒子由 1 个核心、 2 个侧体和 2 层脂质外膜组成， 羊痘病毒的衣壳为对称型， 有囊膜， 囊 膜内含有病毒特异性蛋白。 该病毒对干燥有较强的抵抗力， 在干燥的痂皮内可存活 3-6 个月， 在干燥羊舍内可存活 6-8个月。 反复冻融对其没有明显的灭活作用。 对直射阳光、 常 用消毒药 （酒精、 碘酒等） 以及乙醚或氯仿较敏感。放线菌素 -D 和溴脂氧尿苷可抑制病毒复 制。 0004 山羊痘、 绵羊痘和牛疙瘩皮肤病病毒很强的宿主特异性， 自然条件下， 不会发生交 叉感染。 但病毒对上皮细胞有特殊亲和力， 因此无论通过哪种途径进入机体的病毒， 最终都 经血液达到皮肤和粘。
14、膜， 在上皮细胞内增殖， 引起一系列的炎症过程而发生特异性的痘疹。 说 明 书 CN 104152584 A 3 2/6 页 4 山羊和绵羊均为易感动物。 本病多有病羊和含有羊痘病毒的皮屑随风和灰尘吸入呼吸道而 感染， 也可以通过损伤的皮肤及消化道传染。 丘疹中含大量病毒， 黏膜上的丘疹破溃后可从 鼻、 口分泌物和泪液排泄病毒。病毒进入乳汁、 尿液和精液也可成为病毒传播的重要来源。 被病羊污染的用具、 饲料、 垫草， 病羊的粪便、 分泌物、 皮毛和体外寄生虫 （如羊虱） 都可以成 为传播媒介。该病以春秋两季多发， 主要在冬季春初流行， 常呈地方性或广泛流行。气候严 寒、 雨雪、 霜冻、 枯草和。
15、饲养管理不良等因素都有助于本病的发生和加重病情。目前控制该 病最有效的方法还是使用高效疫苗对易感动物进行免疫接种。 本发明的试剂盒和检测方法 在排查上述饲养用具、 饲料、 垫草， 病羊的粪便、 分泌物等是否含有羊痘病毒属病毒也具有 重要意义。 0005 TaqMan 探针是一种寡核苷酸探针， 荧光基团链接在探针的 5，末端， 淬灭基团则在 3，端。 当探针与靶序列配对时， 荧光基团发射的荧光因与3，端的淬灭基团接近而被淬灭。 在 进行延伸反应时， 聚合酶的 5，外切酶活性将探针切断， 使得荧光基团与淬灭基团分离， 发射 荧光。一分子的产物生成就会伴随着一分子的荧光信号的产生。随着扩增循环数的增。
16、加， 释放出来的荧光基团不断的积累。因此 TaqMan 探针检测的是积累荧光。目前， 水解探针已 被用于基因检测、 病毒定量、 癌细胞基因微突变检测、 细胞因子基因定量等， 其结果都具有 高特异性与高敏感性。 0006 TaqManMGB 探针是近年来的一种新型探针， 它的淬灭基团是一种非荧光的淬灭 基团， 本身不会发生荧光， 这样就降低了 PCR 反应荧光本底信号的强度， 进一步提高了其敏 感性。 0007 中国发明专利 （申请号为 ： 200910103457.4 、 200910094278、 200480005196.8、 201310009019.8 、 201180015187.7。
17、 、 201110143186.2、 201110279330.5 、 200910200396.3、 200910200393.X 、 200910094272.1、 200910094279.3 等） 分别公开了采 用荧光定量 PCR 扩增技术检测病菌和动物疫病的方法。但是， 目前尚无利用 TaqManMGB 探针荧光定量 PCR 扩增技术检测三种羊痘病毒属病毒的试剂盒及检测方法的报道。 发明内容 0008 为克服现有技术的不足， 本发明的第一个目的是提供一种羊痘病毒属病毒 TaqManMGB 探针多重实时荧光定量 PCR 检测用引物， 第二个目的是提供使用该引物的试 剂盒， 第三个目的是。
18、提供使用上述检测用引物的试剂盒的使用方法。 0009 为了实现上述第一目的本发明采用如下技术方案 ： 羊痘病毒属病毒TaqmanMGB探针多重实时荧光定量PCR检测用引物， 其特征在于 ： 包 括羊痘病毒属病毒通用上游引物， 其NDA序列为SEQ ID NO.1;羊痘病毒属病毒通用下游引 物， 其 NDA 序列为 SEQ ID NO.2 ； 牛疙瘩皮肤病病毒 MGB 探针， 其 NDA 序列为 SEQ ID NO.3 ； 山羊痘病毒 MGB 探针， 其 NDA 序列为 SEQ ID NO.4 ； 绵羊痘病毒 MGB 探针， 其 NDA 序列为 SEQ ID NO.5。 0010 为了实现上述第。
19、二目的， 本发明采用的技术方案是 ： 一种羊痘病毒属病毒Taqman-MGB探针多重实时荧光定量PCR检测方法试剂盒， 包括扩 增反应液管、 阳性对照管、 阴性对照管和灭菌去离子水管， 其中 ： 所述扩增反应液管 管内由以下反应液组成 ： 说 明 书 CN 104152584 A 4 3/6 页 5 DNA 序列为 SEQ ID NO.1 的 10mol/L 的羊痘病毒属病毒通用上游引物 1.6L ； DNA 序列为 SEQ ID NO.2 的 10mol/L 的羊痘病毒属病毒通用下游引物 1.6L ； DNA 序列为 SEQ ID NO.3 的 10mol/L 的牛疙瘩皮肤病病毒 MGB 探。
20、针 0.6L ； DNA 序列为 SEQ ID NO.4 的 10mol/L 的山羊痘病毒 MGB 探针 0.3L ； DNA 序列为 SEQ ID NO.5 的 10mol/L 的绵羊痘病毒 MGB 探针 3.0 L ； 2Premix Ex TaqTM缓冲液 8 L ； 灭菌去离子水 1.9 L ； 合计 17L， 为单次反应的用量 ； 所述阳性对照管， 管内为牛疙瘩皮肤病病毒、 山羊痘病毒和绵羊痘病毒三种羊痘病毒 属病毒阳性重组质粒混合 DNA， 体积各为 20L ； 。 0011 所述阴性对照管， 管内为无三种羊痘病毒属病毒感染的上皮组织基因组 DNA， 体积 为 20L ； 所述灭菌。
21、去离子水管 1mL 2mL。 0012 为了实现上述第三目的， 本发明提供一种羊痘病毒属病毒 Taqman-MGB 探针多重 实时荧光定量 PCR 检测的方法 ： 包括如下步骤 ： 1） 制备待检模板 DNA ： 选用商品化的 DNA 提取试剂盒， 提取待检样品中的基因组 DNA， 获得待检模板 DNA ； 2） 扩增反应体系为 ： 18L 扩增反应液， ； 2L 待检模板 DNA 或阳性对照或阴性对照 ； 反应体系的总体积为 20L; 3） 三种羊痘病毒属病毒荧光定量 PCR 扩增 ： 将配制好 的步骤 2） 的扩增反应体系进行 PCR 管反应条件 ： 预变性 95 30s ； 95 5s，。
22、 60 34s（使用 ABI 7500 建议采用 34s） 40 个循环 ； 在 60 34s 进行荧光信号的采集。 0013 4） 结果判定 ： 将扩增反应在 35 个循环以内且扩增曲线良好的反应直接判定为阳 性， 35 个循环以后的可直接判定为阴性， 同时阳性对照的扩增明显， 阴性对照没有扩增。 0014 本发明的原理是 ： 针对三种羊痘病毒属病毒 500bp 左右的靶序列保守区域设计 1 对通用引物和3条MGB探针， 利用探针只与模板特异性地结合， 其结合的位点在两条引物之 间。山羊痘病毒、 牛疙瘩皮肤病病毒和绵羊痘病毒三条探针的 5，端分别标记有报告基团分 别为 FAM、 VIC、 N。
23、ED, 它们的 3，端均标记有非淬灭基团， 非淬灭基团本身不产生荧光， 可以大 大降低本低信号的强度。 同时探针上还连接有MGB修饰基团， 可以将探针的Tm值提高10 左右。因此为了获得同样的 Tm 值， 可以将 MGB 探针设计得更短， 既降低了合成车成本， 也使 得探针设计的成功率大为提高。 这种实验方法所使用的仪器比较简单， 同时克服了传统PCR 固有的检测时间长、 容易污染及检测成本等缺点、 此外， 该检测方法对检测人员的技术素质 要求较低， 实际操作极为简单， 不需要特殊的试剂和仪器设备， 有利于建立成本低廉的快速 筛选体系。 0015 TaqManMGB 探针荧光定量 PCR 扩增。
24、技术是一种简便、 快速、 高度特异性的基因扩 增方法。将此基因扩增技术与普通 PCR 或普通的 TaqMan 探针技术进行比较， 可发现该技 术在灵敏度、 特异性和检测范围等指标上优于上面的技术， 且不依赖于任何专门的仪器设 备即可实现现场高通量快速检测。现有检测周期较长， 操作繁琐， 而本发明的试剂盒仅需 说 明 书 CN 104152584 A 5 4/6 页 6 50min 左右。 0016 本发明的优点是 （1） 、 不需要特殊试剂与设备 ；（2） 、 高特异性 ： 应用保守区段， 1 对通用引物及 3 条 MGB 探针， 根据是否扩增就能判断靶标物质的存在与否， 阳性率可达于 99.。
25、5%， 假阳性率小于 0.1% ；（3） 、 快速、 高效扩增 ： 检测时间 50min 左右 ；（4） 、 灵敏度高 ： 最 低检测极限达分别达到 LSDV 为 1.48 拷贝 /L， GTPV 为 3.29 拷 /L， SPPV 为 2.67 拷 / L。标本的检出率达到 99.3% ；（5） 、 鉴定简便 ： 通过最后的扩增曲线就可以进行结果的精 确的， 无需电泳等其他任何分析步骤 ；（6） 、 用途 ： 可用于三种羊痘病毒属病毒及其相关产 品的快速检测及分型。 附图说明 0017 图 1 为三种羊痘病毒属病毒的特异性试验结果 ； 图 2 为 LSDV 的灵敏度试验结果 ； 图中的曲线从。
26、左到右分别表示倍比稀释后的模板浓 度， 依次分别为 1.48107拷贝 /L、 1.48106拷贝 /L、 1.48105拷贝 /L、 1.48104 拷贝 /L、 1.48103拷贝 /L、 1.48102拷贝 /L、 1.48101拷贝 /L、 1.48 拷贝 / L ； 图 3 为 GTPV 的灵敏度试验结果 ； 图中的曲线从左到右分别表示倍比稀释后的模板浓 度， 依次分别为 3.29107拷贝 /L、 3.29106拷贝 /L、 3.29105拷贝 /L、 3.29104 拷贝 /L、 3.29103拷贝 /L、 3.29102拷贝 /L、 3.29101拷贝 /L、 3.29 拷贝 。
27、/ L ； 图 4 为 SPPV 的灵敏度试验结果 ； 图中的曲线从左到右分别表示倍比稀释后的模板浓 度， 依次分别为 2.67107拷贝 /L、 2.67106拷贝 /L、 2.67105拷贝 /L、 2.67104 拷贝 /L、 2.67103拷贝 /L、 2.67102拷贝 /L、 2.67101拷贝 /L、 2.67 拷贝 / L ； 图 5 为三种羊痘病毒属病毒的重复性试验结果 ； 图 6 为 LSDV 的标准曲线 ； 图 7 为 GTPV 的标准曲线 ； 图 8 为 SPPV 的标准曲线。 具体实施方式 0018 实施例 1， 引物的设计及筛选 三种羊痘病毒属病毒荧光定量 PCR 。
28、扩增引物及探针， 其设计是根据 GenBank 公布的牛 疙瘩皮肤病病毒、 山羊痘病毒和绵羊痘病毒三种羊痘病毒属病毒参考序列， 用 MEGA5 进行 比对， 分析序列并分别在其保守区域进行引物与探针的设计。采用探针设计软件 Primer Express 3.0， 设计 3 套荧光定量引物， 由英骏 （上海） 有限公司合成， 利用 ABI 7500 FAST PCR 仪对反应进程中的扩增情况进行实时监控， 对不同引物组及探针扩增的起始时间、 进入 最大扩增速率的时间、 最大扩增速率及达到平台期所需时间等参数进行分析， 筛选出扩增 速率最高、 特异性好的 1 组荧光定量 PCR 扩增引物与 3 条。
29、探针， 分别标记为 SEQ ID NO.1 SEQ ID NO.5。 其中引物与探针的的浓度分别为10 mol/L， 10 mol/L ， 10 mol/L。 同 时， 利用 PCR 引物软件设计阳性重组质粒 DNA 的 PCR 引物， 其核苷酸序列分别为 ： PCR 上游 说 明 书 CN 104152584 A 6 5/6 页 7 引物 ： SEQ ID NO.6 ； PCR 下游引物 ： SEQ ID NO.7 ； 它们的体积比为 1:1。 0019 SEQ ID NO.1 代表的序列为 ： 5 - CCACCCCAATATTCTGCTGC -3 SEQ ID NO.2 代表的序列为 ：。
30、 5 - ACATTAGGGAATCATGTGCAGTGA -3 SEQ ID NO.3 代表的序列为 :5 VIC-TCTTGCTAAAATgCCA-MGB 3 SEQ ID NO.4 代表的序列为 ： 5 FAM-TCTTGCTAAAATaCC-MGB 3 SEQ ID NO.5 代表的序列为 ： 5 NED-CTTGCTAAAATtCCA-MGB 3 SEQ ID NO.6 代表的序列为 ： 5 -TTGTCAGAAACGAGG -3 SEQ ID NO.7 代表的序列为 ： 5 - ATGCCTCACTTGTATTTGG -3 。 0020 实施例 2， 阳性对照品的制备 牛疙瘩皮肤病。
31、病毒阳性质粒的制备 ： 用试剂盒提取牛疙瘩皮肤病病毒细胞培养物的核 酸， 将其核酸进行PCR及电泳鉴定， 采用PCR上游引物SEQ ID NO.6和PCR下游引物 SEQ ID NO.7 进行扩增， 并使用胶回收试剂盒回收扩增的条带。按照 1 ： 10 的比例和 PMD19T 载体进 行连接反应， 4连接过夜， 转化DH5菌， 经抗性选择和PCR鉴定阳性后， 再测序验证， 利用 分光光度计测定其核酸的 OD 值， 使其 260/280 的比值在 1.82.0 之间。山羊痘病毒阳性质 粒和绵羊痘病毒阳性质粒的制备方法同牛疙瘩皮肤病病毒阳性质粒的制备。 0021 实施例 3， 阴性对照品的制备 用。
32、试剂盒提取无羊痘病毒属病毒感染的上皮组织的 DNA， 进行 PCR 及电泳鉴定。 0022 实施例 4， 三种羊痘病毒属病毒荧光定量 PCR 扩增快速检测方法 ： 包括如下步骤 ： 1） 制备待检模板 DNA ： 选用商品化的 DNA 提取试剂盒， 提取待检样品中的基因组 DNA， 获得待检模板 DNA ； 2） 扩增反应体系为 ： 17L 扩增反应液 ； 3L 待检模板 DNA 或阳性对照或阴性对照 ； 反 应体系的总体积为 20L; 3） 三种羊痘病毒属病毒荧光定量 PCR 扩增 ： 将配制好的步骤 2） 的扩增反应体系进行 PCR 管反应条件 ： 预变性 95 30s ； 95 5s， 。
33、60 34s（使用 ABI 7500 建议采用 34s） 40 个循环 ； 在 60 34s 进行荧光信号的采集。 0023 4） 结果判定 ： 将扩增反应在 35 个循环以内且扩增曲线良好的反应直接判定为阳 性， 35 个循环以后的可直接判定为阴性， 同时阳性对照的扩增明显， 阴性对照没有扩增。 0024 实施例 5， 三种羊痘病毒属病毒荧光定量 PCR 扩增的特异性试验 采用实施例 4 的反应体系及反应条件进行特异性的试验， 所采用的模板分别牛疙瘩皮 肤病病毒， 山羊痘病毒， 绵羊痘病毒， 牛痘病毒， 羊口疮病毒， 阴性对照。 0025 参见图 1 的结果显示， 图中三条扩增曲线表示检测出。
34、牛疙瘩皮肤病病毒、 山羊痘 病毒和绵羊痘病毒。 0026 实施例 6， 三种羊痘病毒属病毒荧光定量 PCR 扩增的灵敏度试验 将所建立的标准品进行10倍倍比稀释， 采用实施例4的反应体系及反应条件进行灵敏 度试验， 结果显示出， 建立的该方法最低能够检测出分别为 ： LSDV 为 1.48 拷贝 /L， GTPV 为 3.29 拷 /L， SPPV 为 2.67 拷 /L 的 DNA 样品。 0027 参见图 2、 图 3 和图 4 的结果显示。 0028 实施例 7， 三种羊痘病毒属病毒荧光定量 PCR 扩增的重复性试验 以重组质粒标准品1.48106拷贝/L与 1.48107 拷贝/L为模。
35、板， 采用实施例4 说 明 书 CN 104152584 A 7 6/6 页 8 的反应体系及反应条件进行重复性试验， 组内与组间重复试验变异系数为 0.58 1.6 ， 表明该方法具有较好的重复性。 0029 参见图 5 的结果显示。 0030 实施例 8， 三种羊痘病毒属病毒荧光定量 PCR 扩增的标准曲线的建立 把重组的标准品质粒进行五个倍比稀释， 进行标准曲线的制作， 以荧光强度的对数 值为横坐标， 循环数为纵坐标作图， 得到标准曲线， 相关系数都为 R2=0.999， 扩增效率分 别达到 ： LSDV 为 108 ； GTPV 为 103.2 ； SPPV 为 103.2 ； 其扩增。
36、方程分别为 ：（LSDV） Y=3.34x+38.80,(GTPV) Y=3.25x+40.36,(SPPV) Y=3.24x+38.51。由此可见本实验 所建立的标准曲线的扩增效率是较好， 其荧光曲线与所检测的靶基因浓度之间的相关性较 好， 准确度较高。 0031 参见图 6、 图 7 和图 8 的结果显示。 说 明 书 CN 104152584 A 8 1/2 页 9 重庆出入境检验检疫局检验检疫技术中心 羊痘病毒属病毒TaqmanMGB探针多重实时荧光定量PCR检测用引物、 方法和 试剂盒 7 1 20 DNA 人工序列 SEQ ID NO.1 ccaccccaat attctgctgc。
37、 20 2 24 DNA 人工序列 SEQ ID NO.2 acattaggga atcatgtgca gtga 24 3 16 DNA 人工序列 SEQ ID NO.3 VIC-tcttgctaaa atgcca-MGB 16 4 15 DNA 人工序列 SEQ ID NO.4 FAM-tcttgctaaa atacc-MGB 15 5 序 列 表 CN 104152584 A 9 2/2 页 10 15 DNA 人工序列 SEQ ID NO.5 NED-cttgctaaaa ttcca-MGB 15 6 15 DNA 人工序列 SEQ ID NO.6 ttgtcagaaa cgagg 15 7 19 DNA 人工序列 SEQ ID NO.7 atgcctcact tgtatttgg 19 序 列 表 CN 104152584 A 10 1/4 页 11 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 104152584 A 11 2/4 页 12 图 3 图 4 说 明 书 附 图 CN 104152584 A 12 3/4 页 13 图 5 图 6 说 明 书 附 图 CN 104152584 A 13 4/4 页 14 图 7 图 8 说 明 书 附 图 CN 104152584 A 14 。