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1、(10)申请公布号 CN 104147014 A (43)申请公布日 2014.11.19 CN 104147014 A (21)申请号 201410304394.X (22)申请日 2014.06.27 A61K 31/56(2006.01) C07J 63/00(2006.01) A61P 7/06(2006.01) A61P 7/00(2006.01) (71)申请人 南京广康协生物医药技术有限公司 地址 210019 江苏省南京市建邺区奥体大街 69 号新城科技大厦 01 幢 5 层 (72)发明人 皋林 朱延通 罗东君 吴俊华 (74)专利代理机构 江苏银创律师事务所 32242 代。
2、理人 何震花 (54) 发明名称 闭花木酮 Cleistanone 的二乙胺衍生物在制 备抗红细胞低下性贫血药物中的应用 (57) 摘要 本发明涉及有机合成和药物化学领域， 具体 涉及闭花木酮 Cleistanone 衍生物、 制备方法及 其在制备抗红细胞低下性贫血药物上的用途。本 发明合成了一个新的闭花木酮 Cleistanone 衍生 物， 并公开了其制备方法。药理学实验表明， 本发 明的闭花木酮 Cleistanone 衍生物具有抗红细胞 低下性贫血的作用， 具有开发抗红细胞低下性贫 血药物的价值。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 7 页 (19)中华人民共和国国家知。
3、识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书7页 (10)申请公布号 CN 104147014 A CN 104147014 A 1/1 页 2 1.一种具有式III所示结构的闭花木酮Cleistanone衍生物(III)及其药学上可接受 的盐在治疗红细胞低下性贫血药物中的应用 ： 2. 如权利要求 1 所述的一种具有式 III 所示结构的闭花木酮 Cleistanone 衍生物 (III) 及其药学上可接受的盐在治疗红细胞低下性贫血药物中的应用， 其特征为 ： 所述红 细胞低下性贫血是由失血所引起的。 3. 如权利要求 1 所述的一种具有式 III 所示结构的闭花木酮 Cleist。
4、anone 衍生物 (III) 及其药学上可接受的盐在治疗红细胞低下性贫血药物中的应用， 其特征为 ： 所述红 细胞低下性贫血是由化学物质所引起的红细胞低下。 4. 如权利要求 3 所述的一种具有式 III 所示结构的闭花木酮 Cleistanone 衍生物 (III) 及其药学上可接受的盐在治疗红细胞低下性贫血药物中的应用， 其特征为 ： 所述化 学物质为苯， 所述红细胞低下性贫血是由苯所致的再生障碍性贫血。 5. 如权利要求 3 所述的一种具有式 III 所示结构的闭花木酮 Cleistanone 衍生物 (III) 及其药学上可接受的盐在治疗红细胞低下性贫血药物中的应用， 其特征为 ： 。
5、所述化 学物质为环磷酸胺， 所述红细胞低下性贫血是由环磷酸胺所致红细胞下降。 权 利 要 求 书 CN 104147014 A 2 1/7 页 3 闭花木酮 Cleistanone 的二乙胺衍生物在制备抗红细胞低 下性贫血药物中的应用 技术领域 0001 本发明涉及有机合成和药物化学领域， 具体涉及闭花木酮 Cleistanone 衍生物、 制备方法及其用途。 背景技术 0002 基于不同的临床特点， 贫血有不同的分类。如 ： 按贫血进展速度分急、 慢性贫血 ； 按骨髓红系增生情况分增生性贫血(如溶血性贫血、 缺铁性贫血、 巨幼细胞贫血等)和增生 低下性贫血 ( 如再生障碍性贫血 )。 000。
6、3 临床上常从贫血发病机制和病因的分类 ： 0004 1. 红细胞生成减少性贫血 0005 造血细胞、 骨髓造血微环境和造血原料的异常影响红细胞生成， 可形成红细胞生 成减少性贫血。 0006 (1) 造血干祖细胞异常所致贫血 0007 1) 再生障碍性贫血 (AA)AA 是一种骨髓造血功能衰竭症， 与原发和继发的造血干 祖细胞损害有关。部分全血细胞减少症的发病机制与 B 细胞产生抗骨髓细胞自身抗体， 进 而破坏或抑制骨髓造血细胞有关。 0008 2) 纯红细胞再生障碍贫血 (PRCA)PRCA 是指骨髓红系造血干祖细胞受到 损害， 进而引起贫血。依据病因， 该病可分为先天性和后天性两类。先天。
7、性 PRCA 即 Diamond-Blackfan 综合征， 系遗传所致 ； 后天性 PRCA 包括原发、 继发两类。有学者发现部 分原发性 PRCA 患者血清中有自身 EPO 或幼红细胞抗体。继发性 PRCA 主要有药物相关型、 感染相关型(细菌和病毒， 如微小病毒B19、 肝炎病毒等)、 自身免疫病相关型、 淋巴细胞增殖 性疾病相关型(如胸腺瘤、 淋巴瘤、 浆细胞病和淋巴细胞白血病等)以及急性再生障碍危象 等。 0009 3) 先天性红细胞生成异常性贫血 (CDA)CDA 是一类遗传性红系干祖细胞良性克隆 异常所致的、 以红系无效造血和形态异常为特征的难治性贫血。 根据遗传方式， 该病可分。
8、为 常染色体隐陛遗传型和显性遗传型。 0010 4) 造血系统恶性克隆性疾病这些疾病造血干祖细胞发生了质的异常， 包括骨髓增 生异常综合征及各类造血系统肿瘤性疾病如白血病等。前者因为病态造血， 高增生， 高凋 亡， 出现原位溶血 ； 后者肿瘤性增生、 低凋亡和低分化， 造血调节也受到影响， 从而使正常成 熟红细胞减少而发生贫血。 0011 (2) 造血微环境异常所致贫血 0012 造血微环境包括骨髓基质， 基质细胞和细胞因子。 0013 1) 骨髓基质和基质细胞受损所致贫血骨髓坏死、 骨髓纤维化、 骨髓硬化症、 大理石 病、 各种髓外肿瘤性疾病的骨髓转移以及各种感染或非感染性骨髓炎， 均可因损。
9、伤骨髓基 质和基质细胞， 造血微环境发生异常而影响血细胞生成。 说 明 书 CN 104147014 A 3 2/7 页 4 0014 2) 造血调节因子水平异常所致贫血干细胞因子 (SCF)、 白细胞介素 (IL)、 粒 - 单 系集落刺激因子 (GM-CSF)、 粒系集落刺激因子 (G-CSF)、 红细胞生成素 (EPO)、 血小板生成 素 (TPO)、 血小板生长因子 (TGF)、 肿瘤坏死因子 (TNF) 和干扰素 (IFN) 等均具有正负调控 造血作用。 肾功能不全、 肝病和垂体或甲状腺功能低下等时产生EPO不足 ； 肿瘤性疾病或某 些病毒感染会诱导机体产生较多的造血负调控因子如 T。
10、NF、 IFN、 炎症因子等， 均可导致慢性 病性贫血 (ACD)。 0015 (3) 造血原料不足或利用障碍所致贫血 0016 造血原料是指造血细胞增殖、 分化、 代谢所必需的物质， 如蛋白质、 脂类、 维生素 ( 叶酸、 维生素 B12 等 )、 微量元素 ( 铁、 铜、 锌等 ) 等。任一种造血原料不足或利用障碍都 可能导致红细胞生成减少。 0017 1) 叶酸或维生素 B12缺乏或利用障碍所致贫血由于各种生理或病理因素导致机体 叶酸或维生素 B12 绝对或相对缺乏或利用障碍可引起的巨幼细胞贫血。 0018 2)缺铁和铁利用障碍性贫血这是临床上最常见的贫血。 缺铁和铁利用障碍影响血 红素。
11、合成， 有称该类贫血为血红素合成异常性贫血。 该类贫血的红细胞形态变小， 中央淡染 区扩大， 属于小细胞低色素性贫血。 0019 2. 溶血性贫血 (HA) 0020 即红细胞破坏过多性贫血。 0021 3. 失血性贫血 0022 根据失血速度分急性和慢性， 慢性失血性贫血往往合并缺铁性贫血。可分为出凝 血性疾病 ( 如特发性血小板减少性紫癜、 血友病和严重肝病等 ) 所致和非出凝血性疾病 ( 如外伤、 肿瘤、 结核、 支气管扩张、 消化性溃疡、 痔和妇科疾病等 ) 所致两类。 0023 从天然产物中寻找化合物或先导化合物并进行结构修饰获得其衍生物， 从而得到 高效低毒的潜在药物最有重要价值。。
12、 0024 本发明涉及的化合物闭花木酮 Cleistanone 是一个 2011 年发表 (Van Trinh Thi Thanh et al.,2011.Cleistanone:A Triterpenoid from Cleistanthus indochinensis with a New Carbon Skeleton.Volume2011,Issue22,pages41084111,August2011) 的 化合物， 我们对化合物闭花木酮 Cleistanone 进行了结构修饰， 获得了一个新的闭花木酮 Cleistanone 衍生物， 并对其抗红细胞低下性贫血活性进行了评价， 其具。
13、有抗红细胞低下性 贫血活性。 发明内容 0025 本发明公开了一个闭花木酮 Cleistanone 衍生物， 其结构为 ： 0026 说 明 书 CN 104147014 A 4 3/7 页 5 0027 本发明闭花木酮 Cleistanone 衍生物 (III) 可通过下面方法制备 ： 0028 (1) 闭花木酮 Cleistanone(I) 与 1,2- 二溴乙烷反应得到闭花木酮 Cleistanone 的 O- 溴乙基衍生物 (II) ； 0029 (2) 闭花木酮 Cleistanone 的 O- 溴乙基衍生物 (II) 与二乙胺发生取代反应制得 闭花木酮 Cleistanone 衍生。
14、物 (III)。 0030 0031 进一步的闭花木酮 Cleistanone 衍生物 (III) 的制备方法为 ： 0032 (1) 将 440mg 化合物闭花木酮 Cleistanone(I) 溶于 10mL 苯， 向溶液中加入 0.04g 的四丁基溴化铵， 3.760g 的 1,2- 二溴乙烷和 6mL 的 50氢氧化钠溶液 ； 混合物在 25 摄氏 度搅拌 24h ； 24h 之后将反应液倒入冰水中， 立即用二氯甲烷萃取两次， 合并有机相溶液 ； 然 说 明 书 CN 104147014 A 5 4/7 页 6 后对有机相溶液依次用水和饱和食盐水洗涤 3 次， 再用无水硫酸钠干燥， 最。
15、后减压浓缩去 除溶剂得到产物粗品 ； 产物粗品用硅胶柱层析纯化， 流动相为 ： 石油醚/丙酮100:1， v/v， 收集黄色集中洗脱带即得到闭花木酮 Cleistanone 的 O- 溴乙基衍生物 (II) 的黄色固体。 0033 (2)将273mg的闭花木酮Cleistanone的O-溴乙基衍生物溶于20mL乙腈当中， 向 其中加入 345mg 的无水碳酸钾， 84mg 的碘化钾和 1460mg 的二乙胺， 混合物加热回流 8h ； 反 应结束后将反应液倒入冰水中， 用等量二氯甲烷萃取三次， 合并有机相 ； 依次用水和饱和食 盐水洗涤合并之后的有机相， 再用无水硫酸钠干燥， 减压浓缩去除溶剂。
16、得到产物粗品 ； 产物 粗品用硅胶柱层析纯化， 流动相为 ： 石油醚 / 丙酮 100:1， v/v， 收集淡黄色集中洗脱带即 得到闭花木酮 Cleistanone 衍生物 (III) 的淡黄色胶状固体。 0034 本发明公开的化合物可以制成药学上可接受的盐或药学上可接受的载体。 0035 本发明的目的在于提供本发明化合物在制药领域中的新的应用。 0036 本发明涉及本发明化合物作为制备治疗红细胞低下性贫血药物中的应用。 0037 以下通过实施例对本发明作进一步详细的说明， 但本发明的保护范围不受具体实 施例的任何限制， 而是由权利要求加以限定。 具体实施方式 0038 实施例 1 化合物闭花。
17、木酮 Cleistanone 的制备 0039 化 合 物 闭 花 木 酮 Cleistanone(I) 的 制 备 方 法 参 照 Van Trinh Thi Thanh 等 人 发 表 的 文 献 (Van Trinh Thi Thanh et al.,2011.Cleistanone:A Triterpenoid from Cleistanthus indochinensis with a New Carbon Skeleton. Volume2011,Issue22,pages41084111,August2011) 的方法。 0040 0041 实施例 2 闭花木酮 Cleistan。
18、one 的 O- 溴乙基衍生物 (II) 的合成 0042 将化合物 I(440mg， 1.00mmol) 溶于 10mL 苯， 向溶液中加入四丁基溴化铵 (TBAB) (0.04g)， 1,2-二溴乙烷(3.760g， 20.00mmol)和6mL的50氢氧化钠溶液。 混合物在25摄 氏度搅拌 24h。24h 之后将反应液倒入冰水中， 立即用二氯甲烷萃取两次， 合并有机相溶液。 然后对有机相溶液依次用水和饱和食盐水洗涤 3 次， 再用无水硫酸钠干燥， 最后减压浓缩 去除溶剂得到产物粗品。产物粗品用硅胶柱层析纯化 ( 流动相为 ： 石油醚 / 丙酮 100:1， v/v)， 收集黄色集中洗脱带。
19、即得到化合物 II 的黄色固体 (344mg， 63 )。 0043 1H NMR(500MHz,DMSO-d6)5.04(s,1H),4.82(s,1H),3.94(d,J 26.5Hz,1H),3.87(d,J 26.5Hz,2H),3.57(s,2H),2.40(d,J 14.0Hz,1H),2.39(d,J 14.0Hz,1H),2.27(s,1H),2.21(s,1H),2.15(s,1H),1.82(s,1H),1.62(s,2H),1 说 明 书 CN 104147014 A 6 5/7 页 7 .57(d,J 3.3Hz,1H),1.54(d,J 3.3Hz,1H),1.50(。
20、d,J 1.2Hz,1H),1.47(d,J 1.2Hz,1H),1.39(d,J 15.3Hz,2H),1.34(d,J 15.3Hz,1H),1.26(dd,J 32.6,13.7Hz,4H),1.13(d,J 18.0Hz,2H),1.05(s,6H),0.98(s,1H),0.88(s,12H),0.78( s,3H),0.74(s,1H)。 0044 13C NMR(125MHz,DMSO-d6)216.59(s),154.50(s),105.23(s),74.63(s),69.85 (s),59.71(s),52.55(s),51.21(s),47.92(s),44.10(s),4。
21、2.25(s),41.73(s),40.64(s),4 0.16(s),38.88(s),38.65(s),37.21(s),36.23(s),33.34(d,J 1.1Hz),32.96(s),29.91 (s),27.18(s),26.03(s),24.23(s),23.96(s),20.77(s),18.48(s),17.98(s),16.93(s)。 0045 HRMS(ESI)m/zM+H+calcd for C32H52BrO2:547.3151 ； found547.3159. 0046 0047 实施例 3 闭花木酮 Cleistanone 的 O-( 二乙胺基 ) 乙基衍生物。
22、 (III) 的合成 0048 将化合物 II(273mg， 0.5mmol) 溶于 20mL 乙腈当中， 向其中加入无水碳酸钾 (345mg， 2.5mmol)， 碘化钾 (84mg， 0.5mmol) 和二乙胺 (1460mg， 20mmol)， 混合物加热回流 8h。反应结束后将反应液倒入冰水中， 用等量二氯甲烷萃取三次， 合并有机相。依次用水和 饱和食盐水洗涤合并之后的有机相， 再用无水硫酸钠干燥， 减压浓缩去除溶剂得到产物粗 品。产物粗品用硅胶柱层析纯化 ( 流动相为 ： 石油醚 / 丙酮 100:1， v/v)， 收集淡黄色集 中洗脱带即得到化合物 III 的淡黄色胶状固体 (16。
23、9.8mg,63 )。 0049 1H NMR(500MHz,DMSO-d6)5.04(s,1H),4.85(s,1H),4.37(s,1H),3.54( s,2H),2.91(s,4H),2.64(s,2H),2.41(d,J 17.2Hz,2H),2.30(s,1H),2.21(d,J 22.5Hz,2H),1.82(s,1H),1.65(s,2H),1.58(d,J 9.0Hz,2H),1.49(d,J 5.7Hz,2H),1.39(d,J 13.4Hz,3H),1.361.28(m,3H),1.281.26(m,1H),1.26 1.14(m,8H),1.06(s,6H),0.92(d。
24、,J 19.4Hz,13H),0.82(s,3H),0.71(s,1H). 0050 13C NMR(125MHz,DMSO-d6)216.59(s),154.50(s),105.23(s),74.65(s),66.82 (s),59.77(s),52.54(d,J 3.0Hz),51.21(s),47.92(s),47.73(s),44.13(s),42.30(s), 41.77(s),40.65(s),40.17(s),38.86(s),38.68(s),37.26(s),36.27(s),33.35(s),32.97 (s),29.89(s),27.21(s),26.08(s),24.2。
25、7(s),23.97(s),20.78(s),18.46(s),18.01(s),1 6.98(s),12.33(s). 0051 HRMS(ESI):m/zM+H+calcd for C36H62NO2:540.4781 ； found:540.4787。 0052 说 明 书 CN 104147014 A 7 6/7 页 8 0053 实施例 4 化合物 III 抗红细胞低下性贫血实验 0054 实验 1 化合物 III 对失血小鼠的治疗作用 0055 ICR 小鼠 30 只， 各半， 均分成 3 组 (n 10)。除生理盐水组外， 其它组每只小 鼠从眼眶静脉放血 0.5ml， 24h 后。
26、再取血测全部各组指标， 然后连续灌胃给药 1 周且给药之 后每天放血0.5ml， 末次给药1h后， 从眼眶静脉丛取血用F-800全血小板分析仪进行红细胞 计数 (1012/L)。 0056 表 1 化合物 III 对因失血所致红细胞减少的治疗作用 0057 0058 与模型组比较 ： *p0.05 0059 结果表明， 放血小鼠经服用化合物 III 治疗 7 天后， 与模型组比较， 其红细胞显著 高于模型组， 接近生理盐水组。 0060 二、 化合物 III 对环磷酰胺致红细胞减少的治疗作用 0061 对小鼠骨髓造血功能损伤的防治作用 ICR 小鼠 30 只， 兼用， 均分成 3 组 (n 1。
27、0)， 即生理盐水组、 造模组、 化合物 III1.2mg/kg 组， 口服给药， 每天 1 次。第 0、 5、 10 日除 生理盐水组外， 其它各组小鼠分别腹腔注射环磷酸胺 80mg/kg， 然后继续给药 3 天。于末次 给药后 1h， 从眼眶静脉丛取血， 测红细胞数 (1012/L)。 0062 表 2 化合物 III 对环磷酰胺所致红细胞的影响 0063 说 明 书 CN 104147014 A 8 7/7 页 9 0064 与模型组比较 ： *p0.01 0065 结果表明， 与生理盐水组比较， 环磷酸胺能使小鼠骨髓损伤， 造成外周血细胞下 降， 化合物 III 组与模型组比较， 可明。
28、显对抗环磷酸胺所致小鼠红细胞下降。 0066 三、 化合物 III 对苯所致红细胞减少的治疗作用 0067 对再生障碍性贫血小鼠的影响 ： 昆明种小鼠 30 只， 兼用， 均分成 3 组 (n 10)， 除生理盐水组外， 其它组小鼠皮下注射苯 0.5ml/kg， 连续 12 天， 造模的当日， 同时口服 给药， 每天 1 次， 共 18 天， 末次给药后 1h， 眼眶静脉丛取血， 测红细胞。 0068 表 3 化合物 III 对苯所致红细胞减少的治疗作用 0069 0070 与模型组比较 ： *p0.01 0071 结果表明， 给药组与模型组比较， 可明显对抗苯所致再生障碍性贫血小鼠红细胞 的下降。 0072 结论 ： 化合物 III 能够显著升高红细胞， 可以用来制备治疗贫血的药物。 0073 实施例 5 本发明所涉及化合物 III 片剂的制备 0074 取20克化合物III或者其药学上可接受的盐当中的一种， 加入制备片剂的常规辅 料 180 克， 混匀， 常规压片机制成 1000 片。 0075 实施例 6 本发明所涉及化合物 III 胶囊的制备 0076 取20克化合物III或者其药学上可接受的盐当中的一种， 加入制备胶囊剂的常规 辅料如淀粉 180 克， 混匀， 装胶囊制成 1000 粒。 说 明 书 CN 104147014 A 9 。