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1、(10)申请公布号 CN 104087570 A (43)申请公布日 2014.10.08 CN 104087570 A (21)申请号 201410245359.5 (22)申请日 2014.06.04 C12N 9/88(2006.01) C12N 15/60(2006.01) C12N 15/70(2006.01) C12N 1/15(2006.01) C12N 1/19(2006.01) C12N 1/21(2006.01) C12P 7/48(2006.01) C12N 15/11(2006.01) (71)申请人 安徽丰原发酵技术工程研究有限公 司 地址 233030 安徽省蚌埠市。
2、淮上区怀五路南 侧 (72)发明人 李荣杰 尚海涛 杨为华 邓远德 徐斌 杨金环 (74)专利代理机构 北京路浩知识产权代理有限 公司 11002 代理人 王文君 (54) 发明名称 乌头酸酶突变体、 其编码基因及应用 (57) 摘要 本发明提供一种乌头酸酶突变体， 其氨基酸 序列如 SEQ ID No.1 所示。编码该突变体的基因 序列如 SEQ ID No.2 所示。本发明通过基因工程 方法使黑曲霉中乌头酸酶编码基因突变， 降低其 酶活力， 经计算， 乌头酸酶突变体的酶活力与野生 型蛋白的酶活相比， 降低了 73， 理论上可提高 柠檬酸的产量和 / 或产率。 (51)Int.Cl. 权利要。
3、求书 1 页 说明书 4 页 序列表 8 页 附图 1 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书4页 序列表8页 附图1页 (10)申请公布号 CN 104087570 A CN 104087570 A 1/1 页 2 1.乌头酸酶突变体， 其特征在于， 其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示， 或该序列经替换、 缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。 2. 编码权利要求 1 所述突变体的基因。 3. 如权利要求 2 所述的基因， 其特征在于， 其核苷酸序列如 SEQ ID No.2 所示。 4. 含有权利要求 2 或 3 所。
4、述基因的载体。 5. 含有权利要求 2 或 3 所述基因或权利要求 4 所述载体的工程菌。 6. 权利要求 2 或 3 所述基因在提高发酵生产柠檬酸产量中的应用。 7. 用于 PCR 特异性扩增权利要求 2 或 3 所述基因的引物对， 其特征在于， 所述引物对 为 ： 正向引物 ： 5 -GATCGAGCTCATGGGGTGACGCCAGCGA-3 反向引物 ： 5 -GATCGCGGCCGCCATGCATAACGAATATCA-3。 权 利 要 求 书 CN 104087570 A 2 1/4 页 3 乌头酸酶突变体、 其编码基因及应用 技术领域 0001 本发明涉及基因工程领域， 具体地说。
5、， 涉及一种乌头酸酶突变体、 其编码基因及应 用。 背景技术 0002 柠檬酸， 又名枸橼酸， 化学名称是2-羟基丙烷-1,2,3-三羧酸。 因其具有令人愉悦 的酸味， 人口爽快， 无后酸味， 安全无毒， 已成为当前世界上生产量和消费量最大的食用有 机酸。 世界上柠檬酸行业的集约化程度非常高， 生产重心已转移至中国， 我国柠檬酸产量和 出口量已连续多年居世界第一。2008 年， 我国柠檬酸产能达到 10 万吨， 占世界总量的 70 左右， 其中 70-80用于生产饮料、 食品， 其余用于医药、 化工、 环保、 化妆品、 纺织、 印染、 建 筑等各个领域。 0003 黑曲霉 (Aspergill。
6、us niger) 是生产柠檬酸最常见的菌株， 已有报道称黑曲霉在 发酵生产柠檬酸过程中存在三羧酸循环的酶系， 其中由柠檬酸到异柠檬酸， 即柠檬酸顺 乌头酸异柠檬酸， 两步反应均由乌头酸酶 (aconitase， ACO) 催化。因此阻断柠檬酸向下 的代谢是柠檬酸的积累关键， 即阻断乌头酸酶的催化反应。通过基因工程方法使黑曲霉中 乌头酸酶编码基因突变， 降低其酶活力， 理论上可提高柠檬酸的产量和 / 或产率。 发明内容 0004 本发明的目的是提供一种乌头酸酶突变体、 其编码基因及应用。 0005 为了实现本发明目的， 本发明的乌头酸酶突变体， 其氨基酸序列如SEQ ID No.1所 示， 或。
7、该序列经替换、 缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。 0006 与野生型的乌头酸酶(野生型乌头酸酶的氨基酸序列和核苷酸序列分别如SEQ ID No.3和4所示)相比， 本发明的乌头酸酶突变体具体的氨基酸序列的改变是 ： M226V(第226 位甲硫氨酸变为缬氨酸 )， N227Y( 第 227 位天冬酰胺变为酪氨酸 )， T376N( 第 376 位苏氨酸 变为天冬酰胺 )， A377T( 第 377 位丙氨酸变为苏氨酸 )， S529P( 第 529 位丝氨酸变为脯氨 酸 )， I530M( 第 530 位异亮氨酸变为甲硫氨酸 )， H580R( 第 580 位组氨酸变。
8、为精氨酸 )。 0007 本发明还提供编码所述乌头酸酶突变体的基因。 所述基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2 所示。 0008 本发明还提供含有编码所述乌头酸酶突变体基因的载体、 。 0009 本发明还提供含有编码所述乌头酸酶突变体基因、 或上述载体的转基因细胞系及 工程菌。 0010 本发明还提供编码所述乌头酸酶突变体的基因在提高发酵生产柠檬酸产量中的 应用。 0011 本发明还提供用于 PCR 特异性扩增编码所述乌头酸酶突变体的基因的引物对， 所 述引物对为 ： 0012 正向引物 ： 5 -GATCGAGCTCATGGGGTGACGCCAGCGA-3 说 明 书 CN 104087。
9、570 A 3 2/4 页 4 0013 反向引物 ： 5 -GATCGCGGCCGCCATGCATAACGAATATCA-3。 0014 本发明进一步提供所述乌头酸酶突变体的构建方法， 包括以下步骤 ： 0015 (1) 从黑曲霉 (Aspergillus niger) 基因组 DNA 中， 扩增 ACO 的编码基因 aco ； 0016 (2)采用易错PCR技术， 以ACO的编码基因aco为模板， 扩增获得ACO突变体基因 ； 0017 (3) 将步骤 (2) 所得易错 PCR 产物及表达质粒 pET28a(+) 用 Sac I 和 Not I 双酶 切后连接， 连接产物转入大肠杆菌 BL。
10、21(DE3) 感受态细胞， 涂布至含 Kan 的 LB 平板， 将平板 置 37恒温培养箱培养， 即得构建得到重组 ACO 基因突变库 ； 0018 (4) 含 Kan 的 LB 平板上长出菌落， 挑取其中的 100 个单克隆， 转接到含 Kan 的 LB 液体培养基中， 37摇床培养， 待菌液 OD600长至 0.8 时， 加入终浓度为 0.2mM 的 IPTG 诱导， 放回37摇床继续培养12h后， 收集菌体， 超声破碎， 测定ACO野生型和突变体酶活， 挑选酶 活力最低的一株， 并测定其基因序列 (SEQ ID NO.2)。 0019 本发明通过基因工程方法使黑曲霉中乌头酸酶编码基因突。
11、变， 降低其酶活力， 经 计算， 乌头酸酶突变体的酶活力与野生型蛋白的酶活相比， 降低了 73， 理论上可提高柠檬 酸的产量和 / 或产率。 附图说明 0020 图 1 为本发明实施例 1 中野生型乌头酸酶基因的 PCR 扩增结果。 0021 图 2 为本发明实施例 5 中乌头酸酶突变体蛋白的 SDS-PAGE 电泳结果 ； 其中， 1 为 未诱导的菌体经超声破碎后， 离心所得上清， 2 为乌头酸酶野生型蛋白， 3 为乌头酸酶突变 体蛋白。 具体实施方式 0022 以下实施例用于说明本发明， 但不用来限制本发明的范围。若未特别指明， 实施例均按照常规实验条件， 如 Sambrook 等分子克隆。
12、实验手册 (Sambrook J&Russell DW,Molecular cloning:a laboratory manual,2001)， 或按照制造厂商说明书建议的条件。 0023 实施例 1 乌头酸酶基因的获得 0024 以1g黑曲霉(Aspergillus niger)基因组DNA为PCR反应模板， 按SEQ ID NO.4 的序列设计正向引物 ACO-F 为 5 -GATCGAGCTCATGGGGTGACGCCAGCGA-3， 反向引物 ACO-R 为 5 -GATCGCGGCCGCCATGCATAACGAATATCA-3。其中， 斜体字母部分分别为酶切位点 Sac I 和 No。
13、t I。PCR 反应在 50l 总体积中进行， 反应条件为在 94变性 5min 后开始循环 ； 94变性 50s， 58退火 1min， 72延伸 2min， 共 30 个循环 ； 再于 72延伸 10min。取 3l PCR 扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分析， 结果如图 1 所示。取 100l PCR 产物进行琼脂糖 凝胶电泳， 按照胶回收试剂盒的步骤回收目的片段。 0025 实施例 2 野生型乌头酸酶基因表达载体的构建 0026 实施例1中PCR产物经限制性内切酶Sac I和Not I双酶切消化后， 与同样用Sac I和Not I内切酶消化的pET-28a(+)质粒(Novagen公司)进。
14、行连接反应， 构建的载体被称 为 pET-ACO， 然后用连接产物 pET-ACO 混合物转化大肠杆菌 DH5-( 购自 promega 公司 )， 并进行序列测定提取转化菌体库的质粒， 转化大肠杆菌 BL21(DE3) 菌株 (Promega 公司 )。 0027 实施例 3 易错 PCR 扩增黑曲霉乌头酸酶基因 说 明 书 CN 104087570 A 4 3/4 页 5 0028 利用Taq DNA聚合酶不具有3-5校对功能的性质， 在高镁离子浓度(5-9mmol/ L) 和不同浓度 dNTP 的浓度下 (1.5-3.5mmol/L)， 来控制随机突变的频率， 向目的基因中引 入随机突变。
15、， 构建突变库。实验中最优的突变率约为 0.6。 0029 易错 PCR 反应体系 (100l) ： 0030 0031 PCR 反应程序为 ： 96预变性 4min ； 94变性 1min， 56退火 1min， 75延伸 2min， 共 45 个循环 ； 最后 75延伸 15min。采用胶回收方法回收 PCR 产物。取 5l 产物进 行 1琼脂糖凝胶电泳检验， -20保存备用。 0032 实施例 4 pET-ACOM 表达载体的构建 0033 实施例 3 中 PCR 产物经限制性内切酶 Sac I 和 Not I 双酶切消化后， 与用 Sac I 和 Not I 内切酶消化的 pET-28。
16、a(+) 质粒进行连接反应， 构建的载体被命名为 pET-ACOM， 然 后用连接产物 pET-ACOM 混合物转化大肠杆菌 DH5， 构建转化菌体突变库。 0034 实施例 5 构建表达突变库及高产量突变体的筛选 0035 提取转化菌体库的质粒， 分别转化大肠杆菌 BL21(DE3) 菌株， 获得转化子约 100 株， 构建表达突变体库。挑取突变菌株至含 kan 的 LB 培养基 (150l/ 孔 ) 的 96 孔板中， 37、 150rpm 培养， 待 OD 值达 0.6-0.8， 加入 IPTG( 终浓度 0.2mmol/L)， 继续培养 12h， 收集 菌体。 超声破碎菌体， 离心收集。
17、上清， 并进行酶活测定。 检测酶活性最低的菌株， 并挑选其克 隆， 并提取质粒， 测定与野生型乌头酸酶对应的基因序列。测定的基因序列为 SEQ ID NO.2 所示， 其对应的氨基酸序列为 SEQ ID NO.1 所示。乌头酸酶突变体蛋白的 SDS-PAGE 电泳结 果如图 2 所示。 0036 乌头酸酶的酶活检测 ： 按照乌头酸酶活性检测试剂盒 (Biovision 公司 ) 进行。经 计算， 野生型蛋白的酶活为 6.3u/L， 突变体蛋白的最低酶活为 1.7u/L， 结果表明， 通过易错 PCR 对 ACO 进行改造， 获得了酶活力降低了 73的突变株。 说 明 书 CN 10408757。
18、0 A 5 4/4 页 6 0037 虽然， 上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述， 但在 本发明基础上， 可以对之作一些修改或改进， 这对本领域技术人员而言是显而易见的。因 此， 在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进， 均属于本发明要求保护的范围。 说 明 书 CN 104087570 A 6 1/8 页 7 0001 0002 序 列 表 CN 104087570 A 7 2/8 页 8 0003 序 列 表 CN 104087570 A 8 3/8 页 9 0004 序 列 表 CN 104087570 A 9 4/8 页 10 0005 序 列 表 CN 104087570 A 10 5/8 页 11 0006 序 列 表 CN 104087570 A 11 6/8 页 12 0007 序 列 表 CN 104087570 A 12 7/8 页 13 0008 序 列 表 CN 104087570 A 13 8/8 页 14 序 列 表 CN 104087570 A 14 1/1 页 15 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 104087570 A 15 。