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1、(10)申请公布号 CN 103038367 A (43)申请公布日 2013.04.10 CN 103038367 A *CN103038367A* (21)申请号 201180037906.5 (22)申请日 2011.06.21 61/375,031 2010.06.21 US C12Q 1/68(2006.01) C12N 15/10(2006.01) (71)申请人 生命技术公司 地址 美国加利福尼亚 (72)发明人 C特里恩 T徐 施雅婷 FN勒 C马约里班克斯 (74)专利代理机构 中国国际贸易促进委员会专 利商标事务所 11038 代理人 李程达 (54) 发明名称 用于核酸的。
2、合成和 / 或检测的组合物、 试剂 盒及方法 (57) 摘要 包含热稳定性 DNA 聚合酶和 PCR 抑制剂阻断 剂的组合物， 其中 PCR 抑制剂阻断剂以有效地增 强装配的 PCR 对 PCR 抑制剂的耐受性的量存在。 (30)优先权数据 (85)PCT申请进入国家阶段日 2013.02.01 (86)PCT申请的申请数据 PCT/US2011/041275 2011.06.21 (87)PCT申请的公布数据 WO2011/163249 EN 2011.12.29 (51)Int.Cl. 权利要求书 3 页 说明书 21 页 附图 9 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专。
3、利申请 权利要求书 3 页 说明书 21 页 附图 9 页 1/3 页 2 1. 聚合酶链式反应 (PCR) 组合物， 其包含 : 热稳定性 DNA 聚合酶 ; 和 PCR 抑制剂阻断剂 , 其中所述 PCR 抑制剂阻断剂以有效地增强装配的 PCR 对 PCR 抑制剂的耐受性的量存 在。 2. 权利要求 1 的组合物， 其中所述 PCR 抑制剂阻断剂为蛋白质。 3. 权利要求 1 的组合物， 其中所述 PCR 抑制剂阻断剂为白蛋白、 明胶或其组合。 4. 权利要求 1 的组合物， 其中所述 PCR 抑制剂阻断剂为牛血清白蛋白、 鱼胶或其组合。 5. 权利要求 1 的组合物 , 其中达到 50M。
4、 血色素在装配的 PCR 中被耐受。 6. 权利要求 1 的组合物， 其中达到 15ng 的腐殖酸 /20L 反应体积在装配的 PCR 中被 耐受。 7. 权利要求 1 的组合物， 其中达到 0.01U/L 肝素在装配的 PCR 中被耐受。 8. 上述权利要求的任一项的组合物， 其还包含非离子型去垢剂。 9. 权利要求 8 的组合物， 其中所述非离子型去垢剂选自 TRITONNonidet P-40(NP-40)、 Tween20 和 Brij35。 10. 权利要求 1 的组合物， 其中所述组合物在室温下稳定达 48 小时。 11. 权利要求 10 的组合物， 其中所述组合物在室温下稳定达约。
5、 72 小时。 12.权利要求1的组合物， 其中所述热稳定性DNA聚合酶选自Taq DNA聚合酶、 Tne DNA 聚合酶、 Tma DNA聚合酶、 Pfu DNA聚合酶、 Pwo DNA聚合酶、 VENT DNA聚合酶、 DEEPVENT DNA 聚合酶、 其突变体或衍生物以及上述酶的组合。 13.权利要求1的组合物， 其中所述热稳定性DNA聚合酶的浓度为约100至约500个单 位 / 毫升。 14. 权利要求 1 的组合物， 其还包含用于热启动 PCR 的试剂。 15. 权利要求 14 的组合物， 其中所述试剂为抗体、 适体、 发夹型引物或隔离石蜡珠。 16. 权利要求 1 的组合物， 其。
6、还包含一种或多种脱氧核苷三磷酸。 17. 权利要求 1 的组合物， 其还包含尿嘧啶 DNA 糖基化酶。 18. 权利要求 1 的组合物， 其还包含被动参考对照。 19. 权利要求 1 的组合物， 其中所述组合物是浓缩原液。 20. 权利要求 1 的组合物， 进一步包含甘油。 22. 权利要求 1 的组合物， 其中对于相同量的模板， 所述组合物的检测限度比商购可得 的 PCR 试剂混合物低至少一个对数。 23. 权利要求 22 的组合物， 其中对于相同量的模板， 所述组合物的检测限度比商购可 得的 PCR 试剂混合物低至少两个对数。 24. 权利要求 1 的组合物， 其中对于相同量的模板， 所述。
7、组合物在 PCR 中产生的阈值 Ct 低于使用商购可得的 PCR 试剂混合物获得的 Ct。 25. 包含权利要求 1 的组合物的试剂盒， 其还包含对照核酸样品和特异于对照核酸样 品中的 DNA 靶的 PCR 扩增的引物对。 26. 权利要求 25 的试剂盒， 进一步包含引物和探针。 27. 用于进行核酸合成的方法， 包括 : 权 利 要 求 书 CN 103038367 A 2 2/3 页 3 向反应容器中添加权利要求 1 的组合物 ; 向反应容器中添加核酸样品和引物 ； 和 使用核酸样品作为模板合成核酸。 28. 用于装配聚合酶链式反应 (PCR) 的方法， 包括 ： 向反应容器中添加权利要。
8、求 1 的组合物 ； 和 向反应容器中添加核酸样品和引物。 29. 权利要求 28 的方法， 进一步包括对核酸样品进行 PCR。 30. 用于通过聚合酶链式反应 (PCR) 扩增核酸的方法， 包括 ： 向反应容器中添加权利要求 1 的组合物 ； 向反应容器中添加核酸样品和引物 ； 和 对核酸样品进行 PCR。 31. 用于通过通过聚合酶链式反应 (PCR) 检测核酸的方法， 包括 ： 向反应容器中添加权利要求 1 的组合物 ； 向反应容器中添加核酸样品和引物 ； 对核酸样品进行 PCR ； 和 检测扩增的靶。 32. 用于阻断 PCR 抑制剂对聚合酶链式反应 (PCR) 的抑制的方法， 包括 。
9、： 向反应容器中添加权利要求 1 的组合物， 其中所述组合物阻断 PCR 抑制剂对 PCR 的抑 制 ； 向反应容器中添加核酸样品和引物 ； 和 对核酸样品进行 PCR。 33. 减少 PCR 抑制剂对聚合酶链式反应 (PCR) 的运行时间的方法， 包括 : 向反应容器中添加权利要求 1 的组合物， 其中所述组合物减少 PCR 的运行时间 ; 向反应容器中添加核酸样品和引物 ； 和 对核酸样品进行 PCR。 34. 权利要求 27 的方法， 其中所述 PCR 为单重 PCR。 35. 权利要求 27 的方法， 其中所述 PCR 为多重 PCR。 36. 权利要求 35 的方法， 其中所述多重 。
10、PCR 包括阳性对照。 37. 权利要求 27 的方法， 其中所述核酸样品包含 PCR 抑制剂。 38. 权利要求 27 的方法， 其中所述核酸样品获自包含 PCR 抑制剂的来源。 39. 权利要求 37 的方法， 其中所述 PCR 抑制剂选自血色素、 腐殖酸、 肝素， 或其组合。 40. 权利要求 27 的方法， 其中在向反应容器中添加组合物、 核酸样品和引物后达 72 小 时时进行合成。 41. 权利要求 27 的方法， 其中模板以 0.00001ng/l 存在。 42.权利要求27的方法， 其中对于相同量的模板， 检测限值比使用不含PCR抑制剂阻断 剂的 PCR 混合物的方法低至少一个对。
11、数。 43.权利要求42的方法， 其中对于相同量的模板， 检测限值比使用不含PCR抑制剂阻断 剂的 PCR 混合物的方法低至少两个对数。 44. 权利要求 27 的方法， 其中对于相同量的模板， 阈值 Ct 比使用不含 PCR 抑制剂阻断 权 利 要 求 书 CN 103038367 A 3 3/3 页 4 剂的 PCR 混合物的方法低。 权 利 要 求 书 CN 103038367 A 4 1/21 页 5 用于核酸的合成和 / 或检测的组合物、 试剂盒及方法 0001 相关申请的交叉参考 0002 本申请要求 2010 年 6 月 21 日提交的美国临时申请号 61/357,031 在 3。
12、5U. S.C.119(e) 下的优先权的利益， 将所述临时申请通过引用整体并入本文。 0003 背景 0004 本公开内容涉及用于核酸的合成和 / 或检测的组合物、 试剂盒及方法。 0005 对于许多医学、 诊断和法医应用， 特定 DNA 序列的扩增是使其能够在其以极低量 存在于其中的样品中被检测或使其能够从所述样品分离所必需的。最近， 特定基因的体外 扩增已提供了强大的成本较低的方法以促进利用子生物学技术的治疗性蛋白质的生产， 并 且同样可用于基因疗法。 0006 聚合酶链式反应 (PCR) 技术公开于美国专利号 4,683,202;4,683,195;4,800,159 和 4,965,。
13、188 中。PCR 法也描述于 Saiki 等人 ,1985,Science230:1350 中。以其最简单形 式， PCR 是用于使用两个寡核苷酸引物酶促合成特定 DNA 序列的体外方法， 所述两个引物与 相反链杂交并且侧翼连接靶 DNA 的目标区域。重复系列的反应步骤 ( 包括模板变性、 引物 退火和通过 DNA 聚合酶进行的退火引物的延伸 ) 导致其末端由引物的 5 末端界定的特定 片段的指数积累。PCR 能够选择性富集特定 DNA 序列至 109倍。 0007 商购可得的 PCR 预混合物 (master mix) 提高了效率并且减小了与高通量分析所 需的大量 PCR 反应的装配相关的。
14、错误。此类预混合物包含对于所有 PCR 反应是共同的试剂 的组合。例如， 预混合物可包含缓冲剂、 盐例如 MgCl2、 脱氧核苷三磷酸 (dNTP) 和热稳定性 DNA聚合酶。 每一个孔可包含共同的预混合物以及特定靶核酸和引物对。 通常， 以浓缩液或 冻干粉 ( 当装配终反应时， 所述浓缩液或冻干粉随后被稀释或溶解 ) 的形式制备和分配预 混合物。 0008 为了进行准确分析， PCR 预混合物应当提供可靠的、 坚实的和可重现的 PCR 结果。 此外， PCR 预混合物应当允许检测低拷贝靶核酸。PCR 预混合物还应当允许进行快速 PCR 反 应循环以允许快速筛选核酸 ( 例如， DNA 和 c。
15、DNA)。此外， PCR 预混合物还应当能够在环境 温度或室温下在实验台上是稳定的， 以便 PCR 反应不必在装配后立即扩增。 0009 核酸样品的来源包括但不限于例如衣服、 土壤、 纸、 金属表面、 空气、 水、 植物部分 以及人和 / 或动物皮肤、 头发、 血液、 血清、 粪便、 奶、 唾液、 尿和 / 或其它分泌液体。此类来 源还可包含抑制 PCR 扩增的化合物。 0010 因此， 需要鉴定阻断或减弱在核酸样品的来源中发现的组分对 PCR 扩增的抑制的 试剂。 0011 概述 0012 本文中公开了用于通过聚合酶链式反应合成和 / 或检测核酸的组合物、 试剂盒和 方法， 所述组合物、 试。
16、剂盒和方法包括 DNA 聚合酶和 PCR 抑制剂阻断剂。PCR 抑制剂阻断剂 减缓由多种通常在包含通过 PCR 分析的核酸的样品中发现的化合物引起的 PCR 的抑制。本 文中公开的组合物、 试剂盒和方法确保在大范围靶核酸浓度上的灵敏可靠的 PCR 结果。组 合物还允许在快速 PCR 热循环中获得快速结果。组合物还提供了可在室温下稳定长达 72 说 明 书 CN 103038367 A 5 2/21 页 6 小时或更长时间的装配的 PCR 反应。 0013 本文中公开了包含热稳定性 DNA 聚合酶和 PCR 抑制剂阻断剂的组合物， 其中 PCR 抑制剂阻断剂以有效地增强装配的 PCR 对 PCR。
17、 抑制剂的耐受性的量存在。 0014 本文中还提供了包括含有热稳定性DNA聚合酶和PCR抑制剂阻断剂的组合物的试 剂盒， 其中 PCR 抑制剂阻断剂以有效地增强装配的 PCR 对 PCR 抑制剂的耐受性的量存在。 0015 本文中还公开了包括含有热稳定性 DNA 聚合酶和 PCR 抑制剂阻断剂、 引物和标记 的探针的组合物的试剂盒， 其中 PCR 抑制剂阻断剂以有效地增强装配的 PCR 对 PCR 抑制剂 的耐受性的量存在。 0016 本文中还公开了用于核酸合成的方法， 包括将含有热稳定性 DNA 聚合酶和 PCR 抑 制剂阻断剂探针的组合物与核酸样品和引物混合， 和使用核酸样品作为模板合成核。
18、酸， 其 中 PCR 抑制剂阻断剂以有效地增强装配的 PCR 对 PCR 抑制剂的耐受性的量存在 ； 和使用核 酸样品作为模板合成核酸。在一些实施方案中， 合成可在将组合物与核酸样品和引物混合 长达 72 小时后发生。 0017 本文还公开了用于装配聚合酶链式反应 (PCR) 的方法， 包括向反应容器中添加含 有热稳定性 DNA 聚合酶和 PCR 抑制剂阻断剂的组合物， 其中 PCR 抑制剂阻断剂以有效地增 强装配的 PCR 对 PCR 抑制剂的耐受性的量存在 ； 和向反应容器中添加核酸样品和引物。 0018 本文还公开了用于通过聚合酶链式反应 (PCR) 扩增核酸的方法， 包括向反应容器 中。
19、添加含有热稳定性 DNA 聚合酶和 PCR 抑制剂阻断剂的组合物， 其中 PCR 抑制剂阻断剂以 有效地增强装配的 PCR 对 PCR 抑制剂的耐受性的量存在 ； 向反应容器中添加核酸样品和引 物 ； 和对核酸样品进行 PCR。 0019 本文还公开了用于通过聚合酶链式反应 (PCR) 检测核酸的方法， 包括将含有热稳 定性 DNA 聚合酶和 PCR 抑制剂阻断剂的组合物添加至反应容器中， 其中 PCR 抑制剂阻断剂 以有效地增强装配的 PCR 对 PCR 抑制剂的耐受性的量存在 ； 向反应容器中添加核酸样品和 引物 ； 对核酸样品进行 PCR ； 和检测扩增的靶。 0020 本文还公开了用于。
20、阻断 PCR 抑制剂对聚合酶链式反应 (PCR) 的抑制的方法， 包括 向反应容器中添加含有热稳定性 DNA 聚合酶和 PCR 抑制剂阻断剂的组合物， 其中 PCR 抑制 剂阻断剂以有效地增强装配的 PCR 对 PCR 抑制剂的耐受性的量存在， 其中组合物阻断 PCR 抑制剂对 PCR 的抑制 ； 向反应容器中添加核酸样品和引物 ； 和对核酸样品进行 PCR。 0021 本文还公开了用于减少 PCR 抑制剂对聚合酶链式反应 (PCR) 的运行时间的方法， 包括向反应容器中添加含有热稳定性 DNA 聚合酶和 PCR 抑制剂阻断剂的组合物， 其中 PCR 抑制剂阻断剂以有效地增强装配的 PCR 对。
21、 PCR 抑制剂的耐受性的量存在， 其中组合物减少 PCR 的运行时间 ； 向反应容器中添加核酸样品和引物 ； 和对核酸样品进行 PCR。 0022 上述和其它特征通过下列附图和详细描述来举例说明。 0023 附图描述 0024 图 1 显示了比较使用 2X 浓度的本文中公开的组合物的实施方案和商业组合物 通用 PCR 预混合物进行的一组 13 个基因表达测定的循环阈 值 (Ct) 的曲线。 0025 图 2 显 示 来 自 在 Applied Biosystems7500 快 速 实 时 PCR 系 统 上 于 基因表达测定中使用 2X 浓度的本文中公开的组合物的实施方案在 4 说 明 书 。
22、CN 103038367 A 6 3/21 页 7 个重复反应中扩增的人 cDNA 的系列稀释物的实时 PCR 的代表性扩增曲线。 0026 图 3 显示作为在终反应物的装配后 (A) 和在 30 C 将装配的终反应物温育 72 小 时后 (B)， 使用 2X 浓度的本文中公开的组合物的实施方案在基因表 达测定的 4 个重复反应中扩增的人 cDNA 的系列稀释物的 PCR 循环的函数的 Rn 的曲线。 0027 图 4， 图框 A 显示了 cDNA 的终浓度 (ng/L) 的函数的 Ct 的曲线， 该曲线将使用 2X浓度的公开的组合物的实施方案进行的系列稀释物的单靶(-肌动蛋白基因(ACTB)。
23、或 外源内部阳性对照 (IPC) 靶 )PCR 反应基因表达测定与使用 2X 浓度的公开 的组合物的实施方案进行的系列稀释物的双重靶 (ACTB 和 IPC)PCR 反应基 因表达测定相比较。 0028 图4， 图框B显示了作为cDNA的终浓度(ng/L)的函数的Ct的曲线， 该曲线将使 用2X浓度的公开的组合物的实施方案进行的系列稀释物的单靶(-肌动蛋白基因(ACTB) 或内源内部阳性对照(IPC)靶)PCR反应基因表达测定与使用要求保护的组 合物的实施方案进行的系列稀释物的双重靶 (ACTB 和 IPC)PCR 反应基因表 达测定相比较。 0029 图 5 显 示 了 作 为 使 用 2X。
24、 浓 度 的 公 开 的 组 合 物 的 实 施 方 案 在 AppliedBiosystems7900H 快速实时 PCR 系统上进行的 Let7-cMicroRNA 测 定的 4 个重复反应的系列稀释物的实时 PCR 的终核酸浓度的函数的 Rn 对 PCR 循环的扩 增曲线 ( 上图框 ) 和 Ct 的标准曲线 ( 下图框 )。 0030 图 6 显示了使用 2X 浓度的公开的组合物的实施方案在 AppliedBiosystems7300 实时PCR系统上进行的基因表达测定的4个重复实时PCR反应中扩增 的人 cDNA 的系列稀释物的 Rn 对 PCR 循环的曲线图。 0031 图7A显示。
25、了柱形图， 该图显示对于8个存在10-50M的血色素的单重(上图框) 或双重 ( 下图框 )基因表达测定测量的 Ct。 0032 图 7B 显示了柱形图， 该图显示了对于 8 个存在 10-50M 的血色素的单重和双重 ( 上图框 )基因表达测定测量的 dCt 和对于 8 个存在 10-50M 的血色素的 双重 VIC 对照基因表达测定测量的 Ct。 0033 图8显示了柱形图， 该图显示在添加剂BSA和鱼胶存在或不存在的情况下， 在不存 在腐殖酸或存在15ng/20L反应物的腐殖酸的情况下对于2个基因表达测 定测量的平均 Ct。 0034 图9显示了柱形图， 该图显示在添加剂BSA和鱼胶存在。
26、或不存在的情况下， 在肝素 不存在和存在 0.01U/L 的肝素的情况下对于 3 个基因表达测定测量的平 均 Ct。 0035 图 10 显示了单重和双重扩增反应在快速热循环条件下的结果。 0036 详述 0037 本公开内容总地说来涉及用于检测和 / 或定量核酸的即可使用的试剂混合物、 试 剂盒和方法。 0038 已开发了具有预料之外的优良性质的改进的组合物。 本发明组合物提供了装配的 聚合酶链式反应 (PCR) 预混合物， 当所述预混合物在标准 PCR 仪上运行时与利用标准试剂 说 明 书 CN 103038367 A 7 4/21 页 8 混合物装配的 PCR 相比较显示优良的灵敏性、 。
27、准确性、 动态范围和特异性。在一些实施方 案中， 利用本文中公开的组合物装配的 PCR 的优良灵敏性允许减少在 FAST 或标准 PCR 仪 上的 PCR 运行时间。此外， 在一些实施方案中， 本文中公开的组合物提供了在室温 ( 例如， 23-30 C) 下具有长达 72 小时的极长的稳定性的装配的 PCR， 该特征有益于高通量液体处 理系统的用户获得的结果的准确性。 0039 在一些实施方案中， 本文中公开的组合物对于许多检测核酸的测定是有用的。例 如， 组合物可用于用于检测基因表达、 microRNA(miRNA) 表达或基因分型的基于 PCR 的测 定。 0040 还公开了包括组合物的试。
28、剂盒， 同样地包括了使用所述组合物和试剂盒的方法。 0041 在一个实施方案中， 组合物包含热稳定性 DNA 聚合酶和 PCR 抑制剂阻断剂 , 其中 PCR 抑制剂阻断剂以有效地增强装配的 PCR 对 PCR 抑制剂的耐受性的量存在。在实施方案 中， PCR抑制剂阻断剂为蛋白质。 适当的蛋白质包括白蛋白和明胶。 在一些实施方案中， PCR 抑制剂阻断剂选自血清白蛋白、 鱼胶或上述物质的组合， 其中组分以有效地增强装配的 PCR 对 PCR 抑制剂的耐受性的量存在。血清白蛋白可来自任何动物， 例如牛血清白蛋白 (BSA)、 人血清白蛋白 (HSA)。在实施方案中， 组合物以这样的浓度包含白蛋白。
29、， 以便其在装配的 PCR( 例如， 工作溶液 ) 中的浓度为约 0.05mg/mL 至约 0.8mg/mL、 约 0.1mg/mL 至约 0.6mg/ mL， 更特别地约 0.2mg/mL 至约 0.4mg/mL， 以这样的浓度包含明胶以便其在装配的 PCR 中的 浓度为约 0.05%(w/v) 至约 0.8%(w/v)， 更特别地约 0.2%(w/v) 至约 0.4%(w/v) 或上述浓度 的组合。在另一个实施方案中， PCR 抑制剂阻断剂可以是浓度约 0.3mg/mL 的白蛋白和浓度 约 0.3%(w/v) 的明胶。在一个实施方案中， 白蛋白为 BSA， 明胶为鱼胶。 0042 在一些实。
30、施方案中， 本文中使用的热稳定性 DNA 聚合酶当经历升高的温度， 进行 实现单链核酸的去稳定作用或在 PCR 扩增过程中实现双链核酸的变性所必需的时间时， 不 被不可逆地灭活。酶的不可逆变性是指大体上失去了酶活性。优选地热稳定性 DNA 聚合酶 在例如进行 PCR 扩增通常所需要的条件下在约 90 -100下将不会发生不可逆变性。 0043 在一些实施方案中， 组合物还可包含另外的组分例如甘油、 牛明胶、 NaN3、 缓冲剂、 盐、 dNTP、 表面活性剂和 / 或一般地任何阳离子、 阴离子、 两性离子和 / 或非离子型去垢剂、 用于热启动 PCR 的试剂、 使定量实时 DNA 检测测定的样。
31、品间和 / 或孔间变化最小的被动参 考对照和 / 或尿嘧啶 -DNA 糖基化酶。组合物还可包含拥挤试剂 (crowding agent) 例如 Ficoll70、 糖原和聚乙二醇 (PEG)。 0044 在一些实施方案中， 甘油可以以这样的浓度存在于组合物中， 以便其在装配的 PCR 中的浓度为约6至约11%(w/v)， 特别地约8.5%(w/v)。 牛明胶可以以这样的浓度存在于组合 物中， 以便其在装配的PCR中的浓度为约0.3至约0.7%(w/v)， 特别地约0.5%(w/v)。 NaN3可 以以这样的浓度存在于组合物中， 以便其在装配的PCR中的浓度为约0.007至约0.013%(w/ 。
32、v)， 特别地约 0.01%(w/v)。 0045 组合物可包含缓冲剂和 / 或盐溶液来提供适当的 pH 和离子条件以维持 DNA 聚合 酶的稳定性。术语 “ 稳定 “ 和 “ 稳定性 “， 如本文中所用， 通常意指在将酶或包含酶的组合 物在约室温 ( 例如， 约 20至约 25 ) 的温度下贮存约 3 天后， 在约 4的温度下贮存约 1 周后， 在约 -20的温度下贮存约 2 至 6 个月后， 以及在约 -80的温度下贮存约 6 个月或 更长时间后， 使组合物例如酶组合物保留至少70%， 优选至少80%， 最优选至少90%的原始酶 说 明 书 CN 103038367 A 8 5/21 页 。
33、9 活性 ( 以单位表示 )。此类缓冲剂的实例可包括例如 TRIS、 TRICINE、 BIS-TRICINE、 HEPES、 MOPS、 TES、 TAPS、 PIPES 和 CAPS。此类盐溶液的实例可包括例如氯化钾、 醋酸钾、 硫酸钾、 硫 酸铵、 氯化铵、 醋酸铵、 氯化镁、 醋酸镁、 硫酸镁、 氯化锰、 醋酸锰、 硫酸锰、 氯化钠、 醋酸钠、 氯 化锂和醋酸锂。 应理解， 许多缓冲剂和盐溶液在本领域是已知的， 包括例如未在本文中明确 公开的那些。 0046 在另一个实施方案中， 可以以浓缩原液的形式提供通组合物。 如本文中所用， 术语 “ 浓缩原液 “ 意指在需要进一步稀释以达到用于。
34、进行特定功能 ( 例如核酸的扩增 ) 的溶液 的最佳浓度的浓度。如本文中所用，“工作溶液” 可用于指具有进行特定功能的最佳浓度的 溶液。例如， 组合物可以是约 2X、 约 3X、 约 4X、 约 5X、 约 6X、 约 10X 等的原液。在一些优选实 施方案中， 组合物可需要高于2X、 高于3X、 高于4X、 高于5X、 高于6X、 高于10X等的稀释度以 成为用于核酸合成法的工作浓度或最佳浓度。 0047 可在组合物中提供 dNTP。组合物中包含的每一种 dNTP 的浓度应当为这样的浓 度以便在装配的 PCR 中获得约 0.15mM 至约 0.65mM 的 dNTP 的浓度。包含的 dNTP。
35、 可以是 dATP、 dCTP、 dGTP、 dTTP 或 dUTP。各个 dNTP 的浓度不必相同。在实施方案中， dATP、 dCTP、 dGTP以这样的浓度存在于组合物中以便每一种dNTP在装配的PCR中的浓度为约0.15至约 0.35mM， 特别地约0.25mM， 并且dUTP以这样的浓度存在于组合物中， 以便其在装配的PCR中 的浓度为约 0.35 至约 0.65mM， 特别地为 0.5mM。 0048 非离子型去垢剂可以为例如TRITONNonidetP-40(NP-40)、 TWEEN20或 Brij35。非离子型去垢剂可以以这样的浓度存在于组合物中以便其在装配的 PCR 中的浓。
36、度 为约 0.007 至约 0.013%(w/v)， 特别地约 0.01%(w/v)。在一些实施方案中， TWEEN-20 以这 样的浓度存在于组合物中以便其在装配的 PCR 中的浓度为约 0.007%(w/v)。 0049 用于热启动 PCR 的试剂可以是抗体、 适体、 发夹型引物或隔离石蜡珠。用于热 启动 PCR 的石蜡珠是商购可得的， 例如PCRGem100 和PCR Gem50(Applied Biosystems)。适当的适体的选择可通过本领域已知的方法来进行或可使 用商购可得的适体。类似地， 适当的发夹型引物的选择可通过本领域已知的方法来进行或 可使用商购得的引物。可通过本领域已知。
37、的方法产生或选择用于热启动 PCR 的抗体。或 者， 可使用商购可得的抗体， 例如对于任何 Taq- 衍生的 DNA 聚合酶是有效的 TaqStart 抗体 (Clontech)， 包括天然、 重组和 N 末端缺失突变体。可通过本领域已知的方法， 或对于商业 产品按照制造商所推荐的方法确定装配的 PCR 中用于热启动 PCR 的试剂的适当浓度。 0050 以允许其用作可检测对照的浓度包含使定量实时核酸检测测定的样品间和 / 或 孔间变化减小至最小的被动参考对照。 在实施方案中， 将参照发色团， 特别地荧光基团用作 被动参考对照。 在实施方案中， 参照发色团为染料ROX(Invitrogen)。。
38、 可以以这样的浓度将 ROX 包含在组合物中， 以便其在终装配的 PCR 中的浓度为约 40 至约 80nM， 特别地约 60nM。 0051 可将尿嘧啶 DNA 糖基化酶 (UNG) 包含在组合物中。该酶可从许多商业来源例如 Invitrogen、 Enzymatics、 New England Biolabs、 Genscript 或 USB 商购获得。可将 UNG 以 这样的量包含在组合物中， 以便其在终装配的PCR中的浓度为约0.005至约0.015U/L， 特 别地约 0.01U/L。 0052 在实施方案中， 组合物包含热稳定性 DNA 聚合酶、 PCR 抑制剂阻断剂的组合、 缓冲。
39、 盐溶液、 热启动组分、 dNTP、 甘油、 非离子型去垢剂和被动参照染料。可替换或修饰组分。 说 明 书 CN 103038367 A 9 6/21 页 10 0053 在一些实施方案中， 当在约-20C贮存至少5.5个月时， 公开的组合物是稳定的。 0054 可将组合物包装在能够保持组合物并且不会与组合物的组分明显相互作用的适 当的容器中。容器可以是被设计来允许由个人或由液体操作仪容易地分配剂型的容器。 0055 还可将组合物容器包装至多包 (multi-pack) 单元中。 0056 本文中还公开了包括组合物的试剂盒。 试剂盒可进一步包含用于一个或多个测定 中以合成、 检测或定量核酸的试。
40、剂。 0057 在实施方案中， 除所述组合物外， 试剂盒还可包括特异于DNA靶的PCR扩增的引物 对以及特异于 DNA 靶的探针。例如， 探针可以是探针、 HydrolEasyTM探针、 小 沟结合 (MGB) 探针、 锁核酸 (LNA) 探针或循环探针技术 (CPT) 探针。 0058 在另一个实施方案中， 试剂盒还可包括对照核酸样品， 以及特异于对照核酸样品 上的 DNA 靶的 PCR 扩增的引物对。还可在试剂盒中包括用于检测扩增的探针。 0059 视情况而定， 可在各个容器中或单个容器中提供除组合物外的试剂盒的组分。可 有利地提供使用试剂盒的说明书和方案。 0060 可将公开的组合物和试。
41、剂盒用于多种检测或定量核酸的基于 PCR 的测定。例如， 可将组合物用于基因表达测定 ( 例如，基因表达测定 )、 miRNA 测定 ( 例如， MicroRNA 测定 )、 基因分型测定 ( 例如，药物代谢基因分型 测定或SNP 基因分型测定 ) 或 RNA 定量测定 ( 例如， 两步逆转录 - 聚合酶链 式反应测定 ) 和低密度阵列测定。 0061 本文中还公开了使用试剂浓度和试剂盒的方法。 0062 在实施方案中， 用于装配聚合酶链式反应 (PCR) 的方法包括将包含热稳定性 DNA 聚合酶和 PCR 抑制剂阻断剂的组合物添加至反应容器， 其中 PCR 抑制剂阻断剂以有效地增 强装配的 。
42、PCR 对 PCR 抑制剂的耐受性的量存在 ； 和将核酸样品和引物添加至反应容器中。 0063 反应容器的实例包括微量离心管、 孔板 (wellplate) 中的孔、 毛细管或微流控芯 片。 0064 在实施方案中， 用于利用聚合酶链式反应 (PCR) 扩增核酸的方法包括将包含热稳 定性 DNA 聚合酶和 PCR 抑制剂阻断剂的组合物添加至反应容器， 其中 PCR 抑制剂阻断剂以 有效地增强装配的 PCR 对 PCR 抑制剂的耐受性的量存在 ； 将核酸样品和引物添加至反应容 器中 ； 和对核酸样品进行 PCR， 其中在将组合物、 核酸样品和引物添加至反应容器后长达 72 小时才进行 PCR。 。
43、0065 在一些实施方案中， 用于扩增靶核酸的方法可以是其中同时扩增多个靶的多重 PCR 扩增。扩增的靶的数目可达到 10 个靶， 特别地达到 6 个靶， 更特别地达到 3 个靶， 更特 别地 2 个靶。在实施方案中， 多重化的靶之一是用于扩增的内源或外源内部阳性对照。 0066 一般而言， PCR 热循环包括在高温下的初始变性步骤， 随后是被设计来允许模板变 性、 引物退火和通过聚合酶进行的退火引物的延伸的重复的系列的温度循环。 通常， 开始时 将样品在约 95 C 的温度下加热约 2 至 10 分钟以使双链 DNA 样品变性。随后， 在每一个循 环开始时， 取决于样品和使用的仪器类型， 将。
44、样品变性约10至60秒。 变性后， 使引物在更低 的温度 ( 从约 40 C 至约 60 C) 下与靶 DNA 退火， 进行约 20 至 60 秒。通常在约 60 C 至约72C范围内的温度下进行聚合酶对引物的延伸。 用于延伸的时间量将取决于扩增子 说 明 书 CN 103038367 A 10 7/21 页 11 的大小和用于扩增的酶的类型， 并且可通过常规实验容易地确定。 此外， 可将退火步骤与延 伸步骤组合， 从而导致两步骤循环。热循环在 PCR 测定中还可包括另外的温度变动。用于 测定的循环次数取决于许多因素， 包括使用的引物、 存在的样品 DNA 的量及热循环条件。用 于任何测定的循。
45、环次数可由本领域技术人员使用常规实验容易地确定。任选地， 可在完成 热循环后加上终延伸步骤以确保所有扩增产物的合成。 0067 在一个实施方案中， 使用本文中公开的组合物进行 PCR 扩增的示例性热循环条件 如下 : 0068 UNG 步骤 ( 任选的 ):50 ,2 分钟 0069 活化 :95 ,20 秒 0070 ( 变性 :95-97 /1-3 秒 ) 0071 ( 延伸 :60-62 /20-30 秒 )x40 个循环 0072 在一个实施方案中， 当本文中公开的组合物用于低密度阵列 (TLDA) 平台时， 推荐在 92下活化 10 分钟。 0073 可在 “标准” PCR 仪例如 。
46、Applied Biosystems7900HT、 7500 和 7300 标准 PCR 系统 上， 或 “快速” PCR 仪例如 Applied BiosystemsStepOne、 StepOne Plus、 7500 和 7900HT 快速 实时 PCR 系统上进行利用公开的组合物的 PCR。 0074 核苷酸。如本文中所用，“核苷酸”是指碱基 - 糖 - 磷酸组合。 “核苷”是指碱 基 - 糖组合。核苷酸是核酸序列 ( 例如 DNA 和 RNA) 的单体单位。术语核苷酸包括脱氧核 糖核苷和核糖核苷的单、 二和三磷酸形式及其衍生物。术语核苷酸具体地包括脱氧核糖核 苷三磷酸例如 dATP,。
47、dCTP,dITP,dUTP,dGTP,dTTP 或其衍生物。此类衍生物包括例如 S dATP,7- 脱氮 -dGTP 和 7- 脱氮 -dATP。术语核苷酸， 如本文中所用， 还指二脱氧核糖核苷三 磷酸(ddNTP)及其衍生物。 适用于本发明组合物的核苷酸的实例包括但不限于dUTP， dATP， dTTP， dCTP， dGTP， dITP， 7- 脱氮 -dGTP,a- 硫代 -dATP,a- 硫代 -dTTP,a- 硫代 -dGTP,a- 硫 代-dCTP或其衍生物， 其全都可从来源包括Life Technologies(Carlsbad,CA)、 NewEngland BioLabs(。
48、Beverly， Mass.) 和 Sigma Chemical Company(SaintLouis,Mo.) 商购获得。此 类dNTP可不被标记， 或它们可通过利用本领域已知的方法将其与放射性同位素(例如,3H、 14C、32P 或35S)、 维生素 ( 例如， 生物素 )、 荧光部分 ( 例如 , 荧光素、 罗丹明、 德克萨期红或藻 红蛋白 )、 化学发光标记物地高辛 (DIG) 等偶联来进行可检测地标记。标记 dNTP 也可例如 从 Life Technologies(Carlsbad,CA) 或 Sigma ChemicalCompany(Saint Louis,MO) 商购 获得。。
49、在本发明组合物的一些实施方案中， 可添加 dNTP 以在工作溶液中产生约 0.001 至约 100 毫摩尔、 约 0.01 至约 10 毫摩尔、 约 0.1 至约 1 毫摩尔或优选约 0.2 至约 0.6 毫摩尔的 每一种 dNTP 的终浓度。 0075 多核苷酸和寡核苷酸。如本文中所用，“多核苷酸” 和 “寡核苷酸” 是指合成或生物 产生的分子， 其包含可通过一个核苷酸的戊糖的 3位与相邻核苷酸的戊糖的 5位之间 的磷酸二酯键连接的核苷酸的共价连接的序列。此外， 多核苷酸或寡核苷酸可包含修饰的 或非天然存在的糖残基 ( 例如， 阿拉伯糖 ) 和 / 或修饰碱基残基。多核苷酸或寡核苷酸还 可包括阻止分子与特定蛋白质、 酶或底物的相互作用的封闭基团。 0076 核酸。如本文中所用，“核酸” 包括具有多个天然核苷酸和 / 或非天然 ( 或 “衍生 的” ) 核苷酸单元的化合物。 “核酸” 还。