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1、(10)申请公布号 CN 102864214 A (43)申请公布日 2013.01.09 CN 102864214 A *CN102864214A* (21)申请号 201210076645.4 (22)申请日 2012.03.21 C12Q 1/68(2006.01) C12N 15/11(2006.01) C12R 1/445(2006.01) C12R 1/385(2006.01) C12R 1/22(2006.01) (71)申请人 中国人民解放军第三军医大学第一 附属医院 地址 400038 重庆市沙坪坝区高滩岩正街 30 号 (72)发明人 夏涵 梁盼盼 黄庆 府伟灵 (74)专。
2、利代理机构 北京海虹嘉诚知识产权代理 有限公司 11129 代理人 谢殿武 (54) 发明名称 非对称发夹探针及其应用 (57) 摘要 本发明涉及 “非对称发夹探针及其应用” ， 属 于生物检测领域。非对称发夹探针由靶核酸特异 序列和一回文序列组成， 在无靶序列存在的情况 下， 处于亚稳定的发夹结构， 而一旦加入待测靶序 列， 即触发无需酶参与的链式聚合反应， 非对称发 夹探针的靶核酸特异序列部分与对应靶核酸位点 结合， 其余探针则两两复性成两端均为回文序列 的部分双链探针， 在分子识别杂交的同时大幅度 地增强检测信号， 从而实现了待测靶序列的快速 检测。 本发明的非对称发夹探针链反应技术， 。
3、巧妙 地结合了分子杂交的高特异性和链式聚合的高效 性， 通过 DNA 聚合释放的自由能驱动分子级联放 大， 其反应体系简单， 检测效率高， 且有效地避免 了 PCR 等传统技术存在的实验室污染问题。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 4 页 序列表 3 页 附图 2 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 4 页 序列表 3 页 附图 2 页 1/1 页 2 1. 非对称发夹探针 1， 其特征在于 ： 包括回文序列、 两条茎臂和连接于一条茎臂上的粘 性末端， 所述两条茎臂连接于回文序列的两端且具有互补的核酸序列， 所述回文序。
4、列为无 关序列， 所述茎臂与其连接的粘性末端具有靶序列的互补核酸序列。 2. 根据权利要求 1 所述的非对称发夹探针 1， 所述粘性末端位于非对称发夹探针 1 的 5 端。 3. 非对称发夹探针 2， 其特征在于 ： 包括回文序列、 两条茎臂和连接于一条茎臂上的粘 性末端， 所述两条茎臂连接于回文序列的两端且具有互补的核酸序列， 所述回文序列与其 相连的一条茎臂具有靶序列， 所述另一茎臂上相连的粘性末端具有和权利要求 1 中所述的 无关序列的互补核酸序列。 4. 根据权利要求 3 所述的非对称发夹探针 2， 所述粘性末端位于非对称发夹探针 2 的 3 端。 5. 根据权利要求 1-4 所述的非。
5、对称发夹探针 1 或 2， 所述粘性末端为 6-8 个碱基。 6. 非对称发夹探针 1 或 2 在快速检测待测靶序列中的应用。 7. 根据权利要求 6 所述的应用， 为液相杂交链反应体系， 所述反应体系中同时加入有 非对称发夹探针 1 和非对称发夹探针 2 以及待测靶序列， 其中所述非对称发夹探针 1 的粘 性末端位于非对称发夹探针 1 的 5 端， 所述非对称发夹探针 2 的粘性末端位于非对称发夹 探针 1 的 3 端 ； 或者所述非对称发夹探针 1 的粘性末端位于非对称发夹探针 1 的 3 端， 所 述非对称发夹探针 2 的粘性末端位于非对称发夹探针 1 的 5 端。 8. 根据权利要求 。
6、7 所述应用， 所述待测靶序列为细菌的 16S rDNA 序列。 9. 根据权利要求 8 所述应用， 所述细菌为金黄色葡萄球菌， 所述非对称发夹探针 1、 非 对称发夹探针 2 和待测靶序列分别为 ： SA-H1 ： TTCTCTGATGTTAGCGGCGGACGGCAAAGTCCGTCCGCCGCTAACATC， SA-H2 ： CCGTCCGCCGCTAACATCAGAGAAGATGTTAGCGGCGGACGGACTTTG， Tsa ： CCGTCCGCCGCTAACATCAGAGAA。 10.根据权利要求8所述应用， 所述细菌为铜绿假单胞菌， 所述非对称发夹探针1、 非对 称发夹探针 2。
7、 和待测靶序列分别为 ： PA-H 1 ： CGTCCTGAGGGAGAAAGTGGGGGTCAAAGTACCCCCACTTTCTCCCTC， PA-H2 ： ACCCCCACTTTCTCCCTCAGGACGGAGGGAGAAAGTGGGGGT， Tp a ： ACCCCCACTTTCTCCCTCAGGACG。 11.根据权利要求8所述应用， 所述细菌为肺炎克雷伯菌， 所述非对称发夹探针1、 非对 称发夹探针 2 和待测靶序列分别为 ： KP-H1 ： GGTGACGAGTGGCGGACGGGTGAGTTCAAAGTCTAACTCACCCGTCCGCCAC， KP-H2 ： AACTCACCC。
8、GTCCGCCACTCGTCACCGTGGCGGACGGGTGAGTTAGACTTTG， Tkp ： AACTCACCCGTCCGCCACTCGTCACC。 权 利 要 求 书 CN 102864214 A 2 1/4 页 3 非对称发夹探针及其应用 技术领域 0001 本发明涉及一种生物反应技术， 特别是涉及一种非对称发夹探针链反应技术。 背景技术 0002 核酸分子固相杂交法、 DNA 测序法、 毛细管电泳分析、 基因芯片技术等检测方法的 先后建立， 将细菌分子检测方法提高到一个崭新的阶段， 但是这些检测方法大多需要特殊 的大型仪器， 技术难度大， 难以在临床中普及应用。此外， 大多需要预。
9、先对样本进行 PCR 扩 增， 严重干扰了致病菌的定量检测， 同时 PCR 技术存在的实验室污染问题也极大地影响了 这些检测方法的准确性。 0003 DNA 探针技术又称分子杂交技术， 是利用 DNA 分子的变性、 复性以及碱基互补配对 的高度精确性， 对某一特异性 DNA 序列进行探查的新技术。DNA 探针是利用同位素、 生物素 等标记的特定 DNA 片断， 该片断可大至寄生虫基因组 DNA， 小至 20 个碱基。当 DNA 探针与 待测的非标记单链 DNA( 或 RNA) 按碱基顺序互补结合时， 以氢键将 2 条单链连接而形成标 记 DNA-DNA( 或标记 DNA-RNA) 的双链杂交分。
10、子。将未配对结合的探针洗去稀后用检测系统 ( 放射自显影或酶检测等 ) 检测杂交反应结果。由于 DNA 分子碱基互补的精确性， 单连 DNA 探针仅与样品中变性处理的 DNA 单链出现配对杂交， 由此决定了探针的特异性 ； 用放射性 同位素 ( 如 32P) 或生物素标记探针， 使杂交试验同时具有高度的敏感性。 0004 Applied Gene Technologies 公司的专利名称为 “发夹形核酸探针技术” (Nucleic Acid Hairpin Probes)， 专利号为6380377涉及到一种茎环形DNA探针技术， 与标准的单链 核酸探针相比结构更稳定， 酶反应更高效， 对错配更。
11、加敏感， 产生了更少的非特异性靶位结 合。这些优点都提高了基因分析的 特异性。 发明内容 0005 针对上述领域中的缺陷， 本发明设计了非对称发夹探针， 并发明了一种非对称发 夹探针链反应技术， 巧妙地结合了分子杂交的高特异性和链式聚合的高效性， 通过 DNA 聚 合释放的自由能驱动分子级联放大， 其反应体系简单， 检测效率高， 且有效地避免了 PCR 等 传统技术存在的实验室污染问题。 0006 非对称发夹探针 1， 其特征在于 ： 包括回文序列、 两条茎臂和连接于一条茎臂上的 粘性末端， 所述两条茎臂连接于回文序列的两端且具有互补的核酸序列， 所述回文序列为 无关序列， 所述茎臂与其连接的。
12、粘性末端具有靶序列的互补核酸序列。 0007 所述粘性末端位于非对称发夹探针 1 的 5 端。 0008 非对称发夹探针 2， 其特征在于 ： 包括回文序列、 两条茎臂和连接于一条茎臂上的 粘性末端， 所述两条茎臂连接于回文序列的两端且具有互补的核酸序列， 所述回文序列与 其相连的一条茎臂具有靶序列， 所述另一茎臂上相连的粘性末端具有和上述无关序列的互 补核酸序列。 0009 所述粘性末端位于非对称发夹探针 2 的 3 端。 说 明 书 CN 102864214 A 3 2/4 页 4 0010 所述粘性末端为 6-8 个碱基。 0011 非对称发夹探针在快速检测待测靶序列中的应用。 0012。
13、 所述应用为液相杂交链反应体系， 所述反应体系中同时加入有非对称发夹探针 1 和非对称发夹探针 2 以及待测靶序列， 其中所述非对称发夹探针 1 的粘性末端位于非对称 发夹探针 1 的 5 端， 所述非对称发夹探针 2 的粘性末端位于非对称发夹探针 1 的 3 端 ； 或 者所述非对称发夹探针 1 的粘性末端位于非对称发夹探针 1 的 3 端， 所述非对称发夹探针 2 的粘性末端位于非对称发夹探针 1 的 5 端。 0013 所述待测靶序列为细菌的 16S rDNA 序列。 0014 所述细菌为金黄色葡萄球菌， 所述非对称发夹探针 1、 非对称发夹探针 2 和待测靶 序列分别为 ： 0015 。
14、SA-H1 ： TTCTCTGATGTTAGCGGCGGACGGCAAAGTCCGTCCGCCGCTAACATC， 0016 SA-H2 ： CCGTCCGCCGCTAACATCAGAGAAGATGTTAGCGGCGGACGGACTTTG， 0017 Tsa ： CCGTCCGCCGCTAACATCAGAGAA。 0018 所述细菌为铜绿假单胞菌， 所述非对称发夹探针 1、 非对称发夹探针 2 和待测靶序 列分别为 ： 0019 PA-H1 ： CGTCCTGAGGGAGAAAGTGGGGGTCAAAGTACCCCCACTTTCTCCCTC， 0020 PA-H2 ： ACCCCCACTTTC。
15、TCCCTCAGGACGGAGGGAGAAAGTGGGGT， 0021 Tpa ： ACCCCCACTTTCTCCCTCAGGACG。 0022 所述细菌为肺炎克雷伯菌， 所述非对称发夹探针 1、 非对称发夹探针 2 和待测靶序 列分别为 ： 0023 KP-H1 ： 0024 GGTGACGAGTGGCGGACGGGTGAGTTCAAAGTCTAACTCACCCGTCCGCCAC， 0025 KP-H2 ： 0026 AACTCACCCGTCCGCCACTCGTCACCGTGGCGGACGGGTGAGTTAGACTTTG， 0027 Tkp ： AACTCACCCGTCCGCCACTCGTC。
16、ACC。 0028 本发明的基本原理是 ： 两条特异性自组装探针由靶核酸特异序列和一回文序列组 成， 在无靶序列存在的情况下， 处于亚稳定的发夹结构， 而一旦加入待测靶序列， 即触发无 需酶参与的链式聚合反应， 此时特异性自组装探针的靶核酸特异序列部分与对应靶核酸位 点结合， 其余探针则两两复性成两端均为回文序列的部分双链探针， 在分子识别杂交的同 时大幅度地增强检测信号， 从而实现了待测靶序列的快速检测。其原理如图 1 所示。其反 应过程如 下 ： (A) 待测靶序列 I 从探针 H1 的粘性末端开始发生严格碱基配对的链置换反 应从而打开探针的发夹结构， 产生新的粘性末端 ； (B)H1 的。
17、粘性末端与 H2 的粘性末端发生 反应继续打开探针的发夹结构， 继而探针H1和H2之间发生交替杂交反应， 形成链式聚合体 大幅度放大信号。 0029 与传统的 PCR、 固相核酸杂交等技术相比， 该技术具有更为突出的优点 ： (1) 液相 杂交反应。 更加接近分子反应的自然状态， 克服了固相杂交存在的空间位阻大的问题， 提高 了杂交反应的效率。 (2)检测效率高， 检测速度快。 传统核酸检测技术通常需要几小时甚至 十几小时， 而该技术同时进行分子识别和级联信号放大， 可在 10 分钟内完成核酸检测。(3) 反应体系简单， 成本低廉。无需酶及其他复杂的分子生物学试剂， 反应体系更为简单， 试剂 。
18、说 明 书 CN 102864214 A 4 3/4 页 5 可制备成干粉运输及保存。(4) 单管反应， 操作简便。所有检测在单一闭管中进行， 操作步 骤简单， 并且有效地避免了PCR等传统技术存在的实验室污染问题。 (5)适合与其他检测方 法整合。针对细菌的特异性核酸靶序列， 设计多重特异性非对称发夹探针， 结合一种高效、 灵敏的信号检测方法， 就可实现快速并行检测细菌的目的。 附图说明 0030 图 1. 非对称发夹探针链反应技术原理图 0031 图中 H1、 H2、 I ： 发夹探针 1、 发夹探针 2、 待测靶序列 ； A 和 a、 B 和 b、 C 和 c 为互补 核酸序列。 003。
19、2 图 2 金黄色葡萄球菌非对称发夹探针链反应电泳结果， 0033 图 3 铜绿假单胞菌非对称发夹探针链反应电泳结果， 0034 图 4 肺炎克雷伯菌非对称发夹探针链反应电泳结果 ( 粘性末端 12 个碱基 )， 0035 图 5 肺炎克雷伯菌非对称发夹探针链反应电泳结果 ( 粘性末端 6-8 个碱基 )， 0036 图 6 肺炎克雷伯菌非对称发夹探针链反应电泳结果 ( 粘性末端 4 个碱基 )， 0037 图中第一泳道 MM ： DL 2,000 DNA maker。 具体实施方式 0038 本发明的具体实施例主要针对于三种病原菌， 本领域技术人员可以按照 本发明 的原理， 将其应用于任何微。
20、生体的检测， 只要找到合适的特异性的待测靶序列。 0039 实施例 1 0040 1、 1 技术方法及实验结果 0041 1、 检测靶序列的选择及非对称发夹探针的设计 0042 (1) 根据 16S rDNA 的分子生物学特点选择检测的靶序列。 0043 16S rRNA 是研究细菌进化和亲缘关系的重要指标， 其含量大 ( 约占细菌 RNA 总量 的 80 )， 具有多个拷贝， 在细菌中高度保守， 有 “细菌化石” 之称。基于上述 16S rDNA 分 子生物学特征， 通过文献或Genbank数据库(http:/www.ncbi.nlm.nih.gov/)查获致病菌 16SrDNA序列， 采用。
21、Vector NTI Suite 9软件对致病菌的16SrDNA序列进行同源性比较， 确 定检测靶序列。 0044 (2) 特异性非对称 HCR 发夹探针的设计 0045 采用 Array Designer 4.0 和 Primer Premier 5.0 软件设计非对称发夹式探针， 用 Omiga 2.0 软件进行探针间、 探针与靶序列的互补性分析， 设计的备选探针序列提交 Genbank 数据库进行特异性分析。 0046 表 1 ： 三种病原菌探针及靶序列设计 ： 0047 说 明 书 CN 102864214 A 5 4/4 页 6 0048 0049 2、 12l 体系杂交链反应 00。
22、50 12l HCR 反应体系包括 ： 40uM 的探针 H1 0.3l ； 40uM 的探针 H2 0.3l ； 3HBN buffer 4l ； 无菌水 3.4l ； 不同浓度的靶序列 I 4l。反应条件如下 ： 99， 8min ； 50， 1h ； 4保存。HCR 反应产物进行 1.2琼脂糖凝胶电泳， 每孔 5.0l 上样。 0051 实验结果如图 2、 3、 4、 5、 6 所示。 0052 电泳结果显示可见所设计的 HCR 特异性探针均可成功启动杂交链反应， 使得发夹 探针结构打开， 在无需酶作用的链式反应， 因而形成长度不一的聚合 DNA 片段， 在电泳图中 显示为较离散的电泳条。
23、带， 从而可以检测出 0.05uM 的靶序列。 0053 从图 4、 5、 6 可以看出， 粘性末端 6-8 个碱基， 其条带更清楚， 分辨率更高。 说 明 书 CN 102864214 A 6 1/3 页 7 0001 0002 序 列 表 CN 102864214 A 7 2/3 页 8 0003 序 列 表 CN 102864214 A 8 3/3 页 9 序 列 表 CN 102864214 A 9 1/2 页 10 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 102864214 A 10 2/2 页 11 图 3 图 4 图 5 图 6 说 明 书 附 图 CN 102864214 A 11 。