KRAS引物和探针.pdf

本发明提供用于检测KRAS基因的突变的寡核苷酸引物或探针。本发明还提供一种用于使用本发明中所公开的寡核苷酸引物或探针来检测KRAS基因中的突变的方法。此外，本发明涵盖一种用于预测患者体内的肿瘤对表皮生长因子受体定向化疗的敏感度的方法，所述方法包括：从所述肿瘤获取DNA；以及使用一种利用本发明的寡核苷酸引物和/或探针中的至少一种的方法来测定所述DNA中的KRAS基因的外显子2中的密码子12是否存在突变和/或密码子13是否存在突变。

权利要求书一种寡核苷酸，其选自：
(a)由核苷酸序列：GTCAAGGCACTCTTGCCTAAGT(SEQ ID NO:1)组成的寡核苷酸或与所述寡核苷酸大致上相同的寡核苷酸；
(b)由核苷酸序列：GGCCTGCTGAAAATGACTGA(SEQ ID NO:2)组成的寡核苷酸或与所述寡核苷酸大致上相同的寡核苷酸；
(c)由核苷酸序列：6FAM‑CAACTACCACAAGTTT(SEQ ID NO:3)组成的标记的寡核苷酸或与所述标记的寡核苷酸大致上相同的寡核苷酸；
(d)由核苷酸序列：AGGCACTCTTGCCTCCGT(SEQ ID NO:4)组成的寡核苷酸或与所述寡核苷酸大致上相同的寡核苷酸；
(e)由核苷酸序列：GCCTGCTGAAAATGACTGAATAT(SEQ ID NO:5)组成的寡核苷酸或与所述寡核苷酸大致上相同的寡核苷酸；
(f)由核苷酸序列：6FAM‑CTCCAACTACCACAAGTT(SEQ ID NO:6)组成的标记的寡核苷酸或与所述标记的寡核苷酸大致上相同的寡核苷酸；
(g)由核苷酸序列：CTTGTGGTAGTTGGAGCTGGTAA(SEQ ID NO:7)组成的寡核苷酸或与所述寡核苷酸大致上相同的寡核苷酸；
(h)由核苷酸序列：AATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCTTT(SEQ ID NO:8)组成的寡核苷酸或与所述寡核苷酸大致上相同的寡核苷酸；
(i)由核苷酸序列：GAATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCTAT(SEQ ID NO:9)组成的寡核苷酸或与所述寡核苷酸大致上相同的寡核苷酸；
(j)由核苷酸序列：TATAAACTTGTGGTAGTTGGAGGTGT(SEQ ID NO:10)组成的寡核苷酸或与所述寡核苷酸大致上相同的寡核苷酸；
(k)由核苷酸序列：TGAAGATGTACCTATGGTCCTAGTAGGA(SEQ ID NO:11)组成的寡核苷酸或与所述寡核苷酸大致上相同的寡核苷酸；
(l)由核苷酸序列：GTCCTGAGCCTGTTTTGTGTCTA(SEQ ID NO:12)组成的寡核苷酸或与所述寡核苷酸大致上相同的寡核苷酸；
(m)由核苷酸序列：6FAM‑TAGAAGGCAAATCACA(SEQ ID NO:13)组成的标记的寡核苷酸或与所述标记的寡核苷酸大致上相同的寡核苷酸；
(n)由核苷酸序列：TGAATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGATA(SEQ ID NO:14)组成的寡核苷酸或与所述寡核苷酸大致上相同的寡核苷酸；
(o)由核苷酸序列：AATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGGTC(SEQ ID NO:15)组成的寡核苷酸或与所述寡核苷酸大致上相同的寡核苷酸；
(p)由核苷酸序列：TGAATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGTTT(SEQ ID NO:16)组成的寡核苷酸或与所述寡核苷酸大致上相同的寡核苷酸；
(q)由核苷酸序列：AAACTTGTGGTAGTTGGAGCAGA(SEQ ID NO:17)组成的寡核苷酸或与所述寡核苷酸大致上相同的寡核苷酸；
(r)由核苷酸序列：AACTTGTGGTAGTTGGAGCAGC(SEQ ID NO:18)组成的寡核苷酸或与所述寡核苷酸大致上相同的寡核苷酸；
(s)由核苷酸序列：CACAAAATGATTCTGAATTAGCTGTATC(SEQ ID NO:19)组成的寡核苷酸或与所述寡核苷酸大致上相同的寡核苷酸；以及
(t)由核苷酸序列：6FAM‑TCAAGGCACTCTTGCCT(SEQ ID NO:20)组成的标记的寡核苷酸或与所述标记的寡核苷酸大致上相同的寡核苷酸。
如权利要求1所述的寡核苷酸，其选自：
由核苷酸序列：GTCAAGGCACTCTTGCCTAAGT(SEQ ID NO:1)组成的寡核苷酸或与所述寡核苷酸大致上相同的寡核苷酸；
由核苷酸序列：GGCCTGCTGAAAATGACTGA(SEQ ID NO:2)组成的寡核苷酸或与所述寡核苷酸大致上相同的寡核苷酸；
由核苷酸序列：AGGCACTCTTGCCTCCGT(SEQ ID NO:4)组成的寡核苷酸或与所述寡核苷酸大致上相同的寡核苷酸；
由核苷酸序列：GCCTGCTGAAAATGACTGAATAT(SEQ ID NO:5)组成的寡核苷酸或与所述寡核苷酸大致上相同的寡核苷酸；
由核苷酸序列：CTTGTGGTAGTTGGAGCTGGTAA(SEQ ID NO:7)组成的寡核苷酸或与所述寡核苷酸大致上相同的寡核苷酸；
由核苷酸序列：AATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCTTT(SEQ ID NO:8)组成的寡核苷酸或与所述寡核苷酸大致上相同的寡核苷酸；
由核苷酸序列：GAATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCTAT(SEQ ID NO:9)组成的寡核苷酸或与所述寡核苷酸大致上相同的寡核苷酸；
由核苷酸序列：TATAAAC TTGTGGTAGTTGGAGGTGT(SEQ ID NO:10)组成的寡核苷酸或与所述寡核苷酸大致上相同的寡核苷酸；
由核苷酸序列：TGAAGATGTACCTATGGTCCTAGTAGGA(SEQ ID NO:11)组成的寡核苷酸或与所述寡核苷酸大致上相同的寡核苷酸；
由核苷酸序列：GTCCTGAGCCTGTTTTGTGTCTA(SEQ ID NO:12)组成的寡核苷酸或与所述寡核苷酸大致上相同的寡核苷酸；
由核苷酸序列：TGAATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGATA(SEQ ID NO:14)组成的寡核苷酸或与所述寡核苷酸大致上相同的寡核苷酸；
由核苷酸序列：AATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGGTC(SEQ ID NO:15)组成的寡核苷酸或与所述寡核苷酸大致上相同的寡核苷酸；
由核苷酸序列：TGAATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGTTT(SEQ ID NO:16)组成的寡核苷酸或与所述寡核苷酸大致上相同的寡核苷酸；
由核苷酸序列：AAACTTGTGGTAGTTGGAGCAGA(SEQ ID NO:17)组成的寡核苷酸或与所述寡核苷酸大致上相同的寡核苷酸；
由核苷酸序列：AACTTGTGGTAGTTGGAGCAGC(SEQ ID NO:18)组成的寡核苷酸或与所述寡核苷酸大致上相同的寡核苷酸；以及
由核苷酸序列：CACAAAATGATTCTGAATTAGCTGTATC(SEQ ID NO:19)组成的寡核苷酸或与所述寡核苷酸大致上相同的寡核苷酸。
如权利要求2所述的寡核苷酸，其选自：
由核苷酸序列：GTCAAGGCACTCTTGCCTAAGT(SEQ ID NO:1)组成的寡核苷酸或与所述寡核苷酸大致上相同的寡核苷酸；
由核苷酸序列：AGGCACTCTTGCCTCCGT(SEQ ID NO:4)组成的寡核苷酸或与所述寡核苷酸大致上相同的寡核苷酸；以及
由核苷酸序列：CTTGTGGTAGTTGGAGCTGGTAA(SEQ ID NO:7)组成的寡核苷酸或与所述寡核苷酸大致上相同的寡核苷酸。
如权利要求2所述的寡核苷酸，其选自：
由核苷酸序列：GGCCTGCTGAAAATGACTGA(SEQ ID NO:2)组成的寡核苷酸或与所述寡核苷酸大致上相同的寡核苷酸；以及
由核苷酸序列：GCCTGCTGAAAATGACTGAATAT(SEQ ID NO:5)组成的寡核苷酸或与所述寡核苷酸大致上相同的寡核苷酸。
如权利要求2所述的寡核苷酸，其选自：
由核苷酸序列：AATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCTTT(SEQ ID NO:8)组成的寡核苷酸或与所述寡核苷酸大致上相同的寡核苷酸；
由核苷酸序列：TGAATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGATA(SEQ ID NO:14)组成的寡核苷酸或与所述寡核苷酸大致上相同的寡核苷酸；
由核苷酸序列：AATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGGTC(SEQ ID NO:15)组成的寡核苷酸或与所述寡核苷酸大致上相同的寡核苷酸；
由核苷酸序列：TGAATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGTTT(SEQ ID NO:16)组成的寡核苷酸或与所述寡核苷酸大致上相同的寡核苷酸；
由核苷酸序列：AAACTTGTGGTAGTTGGAGCAGA(SEQ ID NO:17)组成的寡核苷酸或与所述寡核苷酸大致上相同的寡核苷酸；
由核苷酸序列：AACTTGTGGTAGTTGGAGCAGC(SEQ ID NO:18)组成的寡核苷酸或与所述寡核苷酸大致上相同的寡核苷酸；以及
由核苷酸序列：CACAAAATGATTCTGAATTAGCTGTATC(SEQ ID NO:19)组成的寡核苷酸或与所述寡核苷酸大致上相同的寡核苷酸。
如权利要求2所述的寡核苷酸，其选自：
由核苷酸序列：GAATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCTAT(SEQ ID NO:9)组成的寡核苷酸或与所述寡核苷酸大致上相同的寡核苷酸；以及
由核苷酸序列：TATAAAC TTGTGGTAGTTGGAGGTGT(SEQ ID NO:10)组成的寡核苷酸或与所述寡核苷酸大致上相同的寡核苷酸。
如权利要求2所述的寡核苷酸，其选自：
由核苷酸序列：TGAAGATGTACCTATGGTCCTAGTAGGA(SEQ ID NO:11)组成的寡核苷酸或与所述寡核苷酸大致上相同的寡核苷酸；以及
由核苷酸序列：GTCCTGAGCCTGTTTTGTGTCTA(SEQ ID NO:12)组成的寡核苷酸或与所述寡核苷酸大致上相同的寡核苷酸。
一种试剂盒，其包括根据权利要求1所述的寡核苷酸(a)至(t)中的至少一种。
如权利要求8所述的试剂盒，其包括寡核苷酸(a)、(b)、(d)、(e)、(g)、(h)、(i)、(j)、(k)、(l)、(n)、(o)、(p)、(q)、(r)以及(s)中的至少一种，以及寡核苷酸(c)、(f)、(m)以及(t)中的至少一种。
一种检测DNA中的KRAS突变的方法，所述方法包括：
(1)用PCR，使用以下各项来扩增所述DNA：缺乏3’核酸外切酶活性的热稳定DNA聚合酶和
(I)用于对照分析的一对对照寡核苷酸引物，其中所述一对对照寡核苷酸引物是用于扩增所述KRAS基因的外显子4中的DNA区，并且其中所述一对对照寡核苷酸引物是：根据权利要求1所述的由SEQ ID NO:11所表示的核苷酸序列组成的KrasEx4对照正向引物或与所述KrasEx4对照正向引物大致上相同的寡核苷酸，和根据权利要求1所述的由SEQ ID NO:12所表示的核苷酸序列组成的KrasEx4对照反向引物或与所述KrasEx4对照反向引物大致上相同的寡核苷酸；以及
(II)用于突变分析的至少一对突变寡核苷酸引物，其中所述至少一对突变寡核苷酸引物是用于扩增在定位于所述KRAS基因的外显子2中的密码子12中具有突变的和/或密码子13中具有突变的DNA区，并且其中所述至少一对突变寡核苷酸引物是选自：
(A)第一对密码子13突变寡核苷酸引物，其具有：
(i)反向引物，其选自：(a)根据权利要求1所述的由SEQ ID NO:1所表示的核苷酸序列组成的13ASP反向引物或与所述13ASP反向引物大致上相同的寡核苷酸，或(b)根据权利要求1所述的由SEQ ID NO:4所表示的核苷酸序列组成的寡核苷酸(Kras38A_3TG‑R)或与所述寡核苷酸大致上相同的寡核苷酸，以及
(ii)正向引物，其选自：(a)根据权利要求1所述的由SEQ ID NO:2所表示的核苷酸序列组成的C13正向引物或与所述C13正向引物大致上相同的寡核苷酸，或(b)根据权利要求1所述的由SEQ ID NO:5所表示的核苷酸序列组成的寡核苷酸(KrasC13‑F)或与所述寡核苷酸大致上相同的寡核苷酸；
(B)第二对密码子13突变寡核苷酸引物，其具有：
(i)根据权利要求1所述的由SEQ ID NO:7所表示的核苷酸序列组成的正向引物(13ASP正向引物)或与所述正向引物大致上相同的寡核苷酸；以及
(ii)根据权利要求1所述的由SEQ ID NO:19所表示的核苷酸序列组成的反向引物(C12共用反向引物)或与所述反向引物大致上相同的寡核苷酸；或
(C)至少一对密码子12突变寡核苷酸引物，其包含：
(i)至少一种正向引物，其：(a)根据权利要求1所述的由SEQ ID NO:8所表示的核苷酸序列组成的寡核苷酸(12VAL正向引物)或与所述寡核苷酸大致上相同的寡核苷酸；(b)根据权利要求1所述的由SEQ ID NO:14所表示的核苷酸序列组成的寡核苷酸(12SER正向引物)或与所述寡核苷酸大致上相同的寡核苷酸；(c)根据权利要求1所述的由SEQ ID NO:15所表示的核苷酸序列组成的寡核苷酸(12ARG正向引物)或与所述寡核苷酸大致上相同的寡核苷酸；(d)根据权利要求1所述的由SEQ ID NO:16所表示的核苷酸序列组成的寡核苷酸(12CYS正向引物)或与所述寡核苷酸大致上相同的寡核苷酸；(e)根据权利要求1所述的由SEQ ID NO:17所表示的核苷酸序列组成的寡核苷酸(12ASP正向引物)或与所述寡核苷酸大致上相同的寡核苷酸；(f)根据权利要求1所述的由SEQ ID NO:18所表示的核苷酸序列组成的寡核苷酸(12ALA正向引物)或与所述寡核苷酸大致上相同的寡核苷酸；(g)根据权利要求1所述的由SEQ ID NO:9所表示的核苷酸序列组成的寡核苷酸(KrasM35T_1GA‑F)或与所述寡核苷酸大致上相同的寡核苷酸；或(h)根据权利要求1所述的由SEQ ID NO:10所表示的核苷酸序列组成的寡核苷酸(Kras35T_3CG‑F)或与所述寡核苷酸大致上相同的寡核苷酸；以及
(ii)根据权利要求1所述的由SEQ ID NO:19所表示的核苷酸序列组成的寡核苷酸反向引物(所述C12共用反向引物)或与所述寡核苷酸反向引物大致上相同的寡核苷酸；
(2)测定步骤(1)(I)的产物，所述产物包含用所述一对对照寡核苷酸引物来扩增的外显子4的所述DNA区的扩增产物，其中检测到所述扩增产物表明：所述DNA中存在所述KRAS基因；以及
(3)测定步骤(1)(II)的产物，所述产物包含用所述一对突变寡核苷酸引物来扩增的外显子2的所述DNA区的扩增产物，其中
(a)当在步骤(1)(II)中使用至少一对密码子13突变寡核苷酸引物时，检测到所述扩增产物表明：所述DNA中的所述KRAS基因的外显子2中的密码子13中存在突变；和/或
(b)当在步骤(1)(II)中使用至少一对密码子12突变寡核苷酸引物时，检测到所述扩增产物表明：所述DNA中的所述KRAS基因的外显子2中的密码子12中存在突变。
如权利要求10所述的方法，其中在步骤(1)(II)中，步骤(1)(II)中使用的所述至少一对突变寡核苷酸引物是用于扩增在定位于所述KRAS基因的外显子2中的密码子12中具有突变的所述DNA区，针对密码子12的所述至少一对突变寡核苷酸引物包含：
(i)至少一种正向引物，其选自：(a)根据权利要求1所述的由SEQ ID NO:8所表示的核苷酸序列组成的寡核苷酸(12VAL正向引物)或与所述寡核苷酸大致上相同的寡核苷酸；(b)根据权利要求1所述的由SEQ ID NO:14所表示的核苷酸序列组成的寡核苷酸(12SER正向引物)或与所述寡核苷酸大致上相同的寡核苷酸；(c)根据权利要求1所述的由SEQ ID NO:15所表示的核苷酸序列组成的寡核苷酸(12ARG正向引物)或与所述寡核苷酸大致上相同的寡核苷酸；(d)根据权利要求1所述的由SEQ ID NO:16所表示的核苷酸序列组成的寡核苷酸(12CYS正向引物)或与所述寡核苷酸大致上相同的寡核苷酸；(e)根据权利要求1所述的由SEQ ID NO:17所表示的核苷酸序列组成的寡核苷酸(12ASP正向引物)或与所述寡核苷酸大致上相同的寡核苷酸；(f)根据权利要求1所述的由SEQ ID NO:18所表示的核苷酸序列组成的寡核苷酸(12ALA正向引物)或与所述寡核苷酸大致上相同的寡核苷酸；(g)根据权利要求1所述的由SEQ ID NO:9所表示的核苷酸序列组成的寡核苷酸(KrasM35T_1GA‑F)或与所述寡核苷酸大致上相同的寡核苷酸；或(h)根据权利要求1所述的由SEQ ID NO:10所表示的核苷酸序列组成的寡核苷酸(Kras35T_3CG‑F)或与所述寡核苷酸大致上相同的寡核苷酸；以及
(ii)根据权利要求1所述的由SEQ ID NO:19所表示的核苷酸序列组成的寡核苷酸反向引物(所述C12共用反向引物)或与所述寡核苷酸反向引物大致上相同的寡核苷酸。
如权利要求10所述的方法，其中在步骤(1)(II)中，步骤(1)(II)中使用的所述至少一对突变寡核苷酸引物是用于扩增在定位于所述KRAS基因的外显子2中的密码子13中具有突变的所述DNA区，针对密码子13的所述至少一对突变的寡核苷酸引物是选自：
(A)第一对密码子13突变寡核苷酸引物，其包含：
(i)反向引物，其选自：(a)根据权利要求1所述的由SEQ ID NO:1所表示的核苷酸序列组成的13ASP反向引物或与所述13ASP反向引物大致上相同的寡核苷酸，或(b)由SEQ ID NO:4所表示的核苷酸序列组成的寡核苷酸(Kras38A_3TG‑R)或与所述寡核苷酸大致上相同的寡核苷酸，以及
(ii)正向引物，其选自：(a)根据权利要求1所述的由SEQ ID NO:2所表示的核苷酸序列组成的C13正向引物或与所述C13正向引物大致上相同的寡核苷酸，或(b)由SEQ ID NO:5所表示的核苷酸序列组成的寡核苷酸(KrasC13‑F)或与所述寡核苷酸大致上相同的寡核苷酸；以及
(B)第二对密码子13突变寡核苷酸引物，其包含：
(i)由SEQ ID NO:7所表示的核苷酸序列组成的正向引物(13ASP正向引物)或与所述正向引物大致上相同的寡核苷酸；以及
(ii)由SEQ ID NO:19所表示的核苷酸序列组成的反向引物(C12共用反向引物)或与所述反向引物大致上相同的寡核苷酸。
如权利要求12所述的方法，其中在步骤(1)(II)中，所述至少一对突变寡核苷酸引物包含：
(i)反向引物，其选自：(a)根据权利要求1所述的由SEQ ID NO:1所表示的核苷酸序列组成的13ASP反向引物或与所述13ASP反向引物大致上相同的寡核苷酸，或(b)由SEQ ID NO:4所表示的核苷酸序列组成的寡核苷酸(Kras38A_3TG‑R)或与所述寡核苷酸大致上相同的寡核苷酸，以及
(ii)正向引物，其选自：(a)根据权利要求1所述的由SEQ ID NO:2所表示的核苷酸序列组成的C13正向引物或与所述C13正向引物大致上相同的寡核苷酸，或(b)由SEQ ID NO:5所表示的核苷酸序列组成的寡核苷酸(KrasC13‑F)或与所述寡核苷酸大致上相同的寡核苷酸。
如权利要求13所述的方法，其中步骤(1)(II)中使用的所述至少一对突变寡核苷酸引物包含：
(i)由SEQ ID NO:1所表示的核苷酸序列组成的13ASP反向引物或与所述13ASP反向引物大致上相同的寡核苷酸；以及
(ii)由SEQ ID NO:2所表示的核苷酸序列组成的C13正向引物或与所述C13正向引物大致上相同的寡核苷酸。
如权利要求13所述的方法，其中步骤(1)(II)中使用的所述至少一对突变的寡核苷酸引物包含：
(i)由SEQ ID NO:4所表示的核苷酸序列组成的反向引物寡核苷酸(Kras38A_3TG‑R)或与所述反向引物寡核苷酸大致上相同的寡核苷酸，以及
(ii)由SEQ ID NO:5所表示的核苷酸序列组成的正向引物寡核苷酸(KrasC13‑F)或与所述正向引物寡核苷酸大致上相同的寡核苷酸。
如权利要求11所述的方法，其中在步骤(1)(II)中，针对密码子13的所述至少一对突变寡核苷酸引物包含：
(i)由SEQ ID NO:7所表示的核苷酸序列组成的正向引物(13ASP正向引物)或与所述正向引物大致上相同的寡核苷酸；以及
(ii)由SEQ ID NO:19所表示的核苷酸序列组成的反向引物(C12共用反向引物)或与所述反向引物大致上相同的寡核苷酸。
如权利要求10所述的方法，其中在步骤(2)中，用所述一对对照寡核苷酸引物来扩增的外显子4的所述DNA区的所述扩增产物由以下组成：从所述一对对照寡核苷酸引物的一员跨越至所述一对对照寡核苷酸引物的另一员的所述DNA区，或从与所述一对对照寡核苷酸引物的一员互补的区域跨越至与所述一对对照寡核苷酸引物的另一员互补的区域的所述DNA区。
如权利要求10所述的方法，其中在步骤(3)中，用所述一对突变寡核苷酸引物来扩增的外显子2的所述DNA区的所述扩增产物由以下组成：从所述至少一对突变寡核苷酸引物的一员跨越至所述至少一对突变寡核苷酸引物的另一员的所述DNA区，或从与所述至少一对突变寡核苷酸引物的一员互补的区域跨越至与所述至少一对突变寡核苷酸引物的另一员互补的区域的所述DNA区。
如权利要求10所述的方法，其中步骤(1)中使用的缺乏3’核酸外切酶活性的所述热稳定DNA聚合酶是选自：从嗜热脂肪芽胞杆菌分离的热稳定Bst DNA聚合酶I、等温DNA聚合酶、经由氧化所述核酸外切酶活性所必需的氨基酸残基来除去3’至5’核酸外切酶活性的T7DNA聚合酶(测序酶型式1)或在基因上通过缺失所述3’至5’核酸外切酶活性所必需的28种氨基酸来除去3’至5’核酸外切酶活性的T7DNA聚合酶(测序酶型式2)、VentR(exo‑)DNA聚合酶以及Taq聚合酶。
如权利要求19所述的方法，其中缺乏3’核酸外切酶活性的所述热稳定DNA聚合酶是Taq聚合酶。
如权利要求17所述的方法，其中在步骤(2)中，用由SEQ ID NO:13所表示的核苷酸序列组成的寡核苷酸探针或与所述寡核苷酸探针大致上相同的标记的寡核苷酸来测定用所述一对对照寡核苷酸引物来扩增的外显子4的所述DNA区的所述扩增产物。
如权利要求18所述的方法，其中在步骤(2)中，用由SEQ ID NO:3或6所表示的核苷酸序列组成的寡核苷酸探针或与所述寡核苷酸探针大致上相同的标记的寡核苷酸来测定用所述至少一对突变寡核苷酸引物来扩增的外显子2的所述DNA区的所述扩增产物。
如权利要求22所述的方法，其中在步骤(2)中，用由SEQ ID NO:3所表示的核苷酸序列组成的寡核苷酸探针或与所述寡核苷酸探针大致上相同的标记的寡核苷酸来测定用所述至少一对突变寡核苷酸引物来扩增的外显子2的所述DNA区的所述扩增产物。
如权利要求22所述的方法，其中在步骤(2)中，用由SEQ ID NO:6所表示的核苷酸序列组成的寡核苷酸探针或与所述寡核苷酸探针大致上相同的标记的寡核苷酸来测定用所述至少一对突变寡核苷酸引物来扩增的外显子2的所述DNA区的所述扩增产物。
如权利要求14所述的方法，其中在步骤(2)中，用由SEQ ID NO:3所表示的核苷酸序列组成的寡核苷酸探针或与所述寡核苷酸探针大致上相同的标记的寡核苷酸来测定用所述至少一对突变寡核苷酸引物来扩增的外显子2的所述DNA区的所述扩增产物。
如权利要求15所述的方法，其中在步骤(2)中，用由SEQ ID NO:6所表示的核苷酸序列组成的寡核苷酸探针或与所述寡核苷酸探针大致上相同的标记的寡核苷酸来测定用所述至少一对突变寡核苷酸引物来扩增的外显子2的所述DNA区的所述扩增产物。
如权利要求1所述的方法，其中步骤(1)中使用的所述DNA是基因组DNA或从组织获取的cDNA。
如权利要求27所述的方法，其中步骤(1)中使用的所述DNA是从组织获取的互补cDNA。
一种预测患者体内的肿瘤对表皮生长因子受体定向化疗的敏感度的方法，所述方法包括：
(1)从所述肿瘤获取DNA；以及
(2)使用如权利要求10至28中的一项所述的用于检测DNA中的KRAS突变的方法来测定所述DNA中的所述KRAS基因的外显子2中的密码子12中突变的存在和/或密码子13中突变的存在，其中在密码子12中检测到所述突变和/或密码子13中检测到所述突变预示：与密码子12和密码子13中没有突变的同一类型的肿瘤相比，所述肿瘤对表皮生长因子受体定向化疗具有降低的敏感度。
如权利要求29所述的方法，其中步骤(2)测定所述KRAS基因的外显子2中的密码子12中的突变。
如权利要求29所述的方法，其中步骤(2)测定所述KRAS基因的外显子2中的密码子13中的突变。
如权利要求29所述的方法，其中步骤(2)测定所述KRAS基因的外显子2中的密码子12中的突变和密码子13中的突变。

说明书KRAS引物和探针
本申请要求2010年4月12号提交的美国临时专利申请号61/323,114的权益，该临时专利申请的公开内容据此以引用的方式并入。
发明领域
本发明涉及用于检测DNA中的KRAS突变的PCR引物和探针及使用所述PCR引物和探针来检测KRAS突变的方法，以及预测癌症对表皮生长因子受体定向化疗的敏感度。
背景信息
表皮生长因子受体(EGFR)是在癌症发展中起重要作用的酪氨酸激酶。举例来说，在患有转移性结肠直肠癌(CRC)的患者的多于85%的肿瘤中可以看到EGFR的过度表达。参见Lee JJ和Chu E，Clin Colorectal Cancer 2007；6增刊2：S42‑6。已经开发了靶向EGFR的抗癌药物。西妥昔单抗(cetuximab)和帕尼单抗(panitumumab)是两种EGFR抑制剂，这两种抑制剂已经在用于转移性CRC的二线使用和与基于奥沙利铂(oxaliplatin)和伊立替康(irinotecan)的疗法组合的一线使用中展示有前景的治疗作用。参见Lee JJ和Chu E，Clin Colorectal Cancer.2007；6增刊2：S42‑6；Zhang W等，Ann Med.2006；38：545‑51。然而，不是所有的患者都对西妥昔单抗和帕尼单抗有反应。
Ras基因、H‑ras、K‑ras(KRAS)以及N‑ras编码在EGFR信号传导途径中涉及的小GTP酶。外显子2中的关键密码子12、13或61中的一个密码子上的KRAS基因中的点突变可促进肿瘤发展。KRAS突变发生在约37%的结肠直肠腺癌中。参见Brink M等，Carcinogenesis 2003；24：703‑10。已经展示出突变的K‑ras基因与缺乏对西妥昔单抗和帕尼单抗疗法的反应性以及缺乏西妥昔单抗和帕尼单抗疗法带来的短暂存活之间的强相关性。因为KRAS突变的存在可高度预测出对西妥昔单抗和帕尼单抗的无反应性，所以带有突变KRAS的患者应该考虑前述使用这些EGFR抑制剂的化疗。
KRAS突变可以通过许多方法来检测。举例来说，DNA可例如通过标准的蛋白酶K消化和苯酚‑氯仿萃取而从冷冻组织样本中提取，并且通过聚合酶链反应(PCR)来扩增，其中KRAS突变然后可以通过PCR产物的测序来检测。参见Tam IY等，Clin Cancer Res.2006；2(5)：1647‑53。
KRAS突变也可以用扩增受阻突变系统PCR(ARMS PCR)检测。ARMSPCR也称为等位基因特异性PCR(ASP)或特异性等位基因的PCR扩增(PASA)，是一种能够检测单个碱基突变的以PCR为基础的方法。参见Newton等，Nucleic Acids Res.1989；17(7)：2503‑16。在ARMS PCR中，一个PCR引物的3’端符合靶突变。因为ARMS PCR采用了错配修复所需要的缺乏3’核酸外切酶活性的聚合酶(通常是Taq聚合酶)，原则上ARMS PCR将只扩增带有靶突变的DNA模板。ARMS可允许仅通过检查反应混合物，例如通过琼脂糖凝胶电泳来检测突变，因为扩增产物的存在表明具体突变的存在。参见Newton等，Nucleic Acids Res.1989；17(7)：2503‑16；Bottema,CD等，Methods Enzymol.1993；218：388‑402。
发明概述
本发明提供寡核苷酸引物和探针，其选自：
(a)由核苷酸序列：GTCAAGGCACTCTTGCCTAAGT(SEQ ID NO:1)组成的寡核苷酸(在下文中也被称为“13ASP反向引物”或“Kras38A_2GT‑R”)或与所述寡核苷酸大致上相同的寡核苷酸；
(b)由核苷酸序列：GGCCTGCTGAAAATGACTGA(SEQ ID NO:2)组成的寡核苷酸(在下文中也被称为“C13正向引物”或“KrasC13‑F4”)或与所述寡核苷酸大致上相同的寡核苷酸；；
(c)由核苷酸序列：6FAM‑CAACTACCACAAGTTT(SEQ ID NO:3)组成的标记的寡核苷酸(在下文中也被称为“C13探针”或“C13‑Mc2“)或与所述寡核苷酸大致上相同的寡核苷酸；
(d)由核苷酸序列：AGGCACTCTTGCCTCCGT(SEQ ID NO:4)组成的寡核苷酸(在下文中也被称为“Kras38A_3TG‑R”)或与所述寡核苷酸大致上相同的寡核苷酸；
(e)由核苷酸序列：GCCTGCTGAAAATGACTGAATAT(SEQ ID NO:5)组成的寡核苷酸(在下文中也被称为”KrasC13‑F”)或与所述寡核苷酸大致上相同的寡核苷酸；
(f)由核苷酸序列：6FAM‑CTCCAACTACCACAAGTT(SEQ ID NO:6)组成的标记的寡核苷酸(在下文中也被称为“KrasC13_Mc”)或与所述寡核苷酸大致上相同的寡核苷酸；
(g)由核苷酸序列：CTTGTGGTAGTTGGAGCTGGTAA(SEQ ID NO:7)组成的寡核苷酸(在下文中也被称为“13ASP正向引物”或“Kras38A_1GA‑F”)或与所述寡核苷酸大致上相同的寡核苷酸；
(h)由核苷酸序列：AATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCTTT(SEQ ID NO:8)组成的寡核苷酸(在下文中也被称为“12VAL正向引物”)或与所述寡核苷酸大致上相同的寡核苷酸；
(i)由核苷酸序列：GAATATAAAC TTGTGGTAGTTGGAGC TAT(SEQ ID NO:9)组成的寡核苷酸(在下文中也被称为“KrasM35T_1GA‑F”)或与所述寡核苷酸大致上相同的寡核苷酸；
(j)由核苷酸序列：TATAAACTTGTGGTAGTTGGAGGTGT(SEQ ID NO:10)组成的寡核苷酸(在下文中也被称为“Kras35T_3CG‑F”)或与所述寡核苷酸大致上相同的寡核苷酸；
(k)由核苷酸序列：TGAAGATGTACCTATGGTCCTAGTAGGA(SEQ ID NO:11)组成的寡核苷酸(在下文中也被称为“KrasEx4对照正向引物”或“KrasEx4_C‑F”)或与所述寡核苷酸大致上相同的寡核苷酸；
(l)由核苷酸序列：GTCCTGAGCCTGTTTTGTGTCTA(SEQ ID NO:12)组成的寡核苷酸(在下文中也被称为“KrasEx4对照反向引物”或“KrasEx4_C‑R”)或与所述寡核苷酸大致上相同的寡核苷酸；
(m)由核苷酸序列：6FAM‑TAGAAGGCAAATCACA(SEQ ID NO:13)组成的标记的寡核苷酸(在下文中也被称为“KrasEx4对照探针”或“KrasEx4_C‑M”)或与所述寡核苷酸大致上相同的寡核苷酸；
(n)由核苷酸序列：TGAATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGATA(SEQ ID NO:14)组成的寡核苷酸(在下文中也被称为“12SER正向引物”)或与所述寡核苷酸大致上相同的寡核苷酸；
(o)由核苷酸序列：AATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGGTC(SEQ ID NO:15)组成的寡核苷酸(在下文中也被称为“12ARG正向引物”)或与所述寡核苷酸大致上相同的寡核苷酸；
(p)由核苷酸序列：TGAATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGTTT(SEQ ID NO:16)组成的寡核苷酸(在下文中也被称为“12CYS正向引物”)或与所述寡核苷酸大致上相同的寡核苷酸；
(q)由核苷酸序列：AAACTTGTGGTAGTTGGAGCAGA(SEQ ID NO:17)组成的寡核苷酸(在下文中也被称为“12ASP正向引物”)或与所述寡核苷酸大致上相同的寡核苷酸；
(r)由核苷酸序列：AACTTGTGGTAGTTGGAGCAGC(SEQ ID NO:18)组成的寡核苷酸(在下文中也被称为“12ALA正向引物”)或与所述寡核苷酸大致上相同的寡核苷酸；
(s)由核苷酸序列：CACAAAATGATTCTGAATTAGCTGTATC(SEQ ID NO:19)组成的寡核苷酸(在下文中也被称为“C12共用反向引物”)或与所述寡核苷酸大致上相同的寡核苷酸；以及
(t)由核苷酸序列：6FAM‑TCAAGGCACTCTTGCCT(SEQ ID NO:20)组成的标记的寡核苷酸(在下文中也被称为“C12共用探针”)或与所述寡核苷酸大致上相同的寡核苷酸。
本发明的一个方面是一种试剂盒，所述试剂盒包括本发明的上述寡核苷酸引物和探针(a)至(t)中的至少一种。
本发明还提供一种检测DNA中的KRAS突变的方法，所述方法包括：
(1)用PCR，使用以下各项来扩增所述DNA：缺乏3’核酸外切酶活性的热稳定DNA聚合酶和
(I)用于对照分析的一对对照寡核苷酸引物，其中所述一对对照寡核苷酸引物是用于扩增所述KRAS基因的外显子4中的DNA区，并且其中所述一对对照寡核苷酸引物是：由SEQ ID NO:11所表示的核苷酸序列组成的KrasEx4对照正向引物或与所述KrasEx4对照正向引物大致上相同的寡核苷酸，和由SEQ ID NO:12所表示的核苷酸序列组成的KrasEx4对照反向引物或与所述KrasEx4对照反向引物大致上相同的寡核苷酸；以及
(II)用于突变分析的至少一对突变寡核苷酸引物，其中所述至少一对突变寡核苷酸引物是用于扩增在定位于KRAS基因的外显子2中的密码子12中具有突变的和/或密码子13中具有突变的所述DNA区，并且其中所述至少一对突变寡核苷酸引物是选自：
(A)第一对密码子13突变寡核苷酸引物，其具有：
(i)反向引物，其选自：(a)由SEQ ID NO:1所表示的核苷酸序列组成的13ASP反向引物(Kras38A_2GT‑R)或与所述13ASP反向引物大致上相同的寡核苷酸，或(b)由SEQ ID NO:4所表示的核苷酸序列组成的寡核苷酸(Kras38A_3TG‑R)或与所述寡核苷酸大致上相同的寡核苷酸，以及
(ii)正向引物，其选自：(a)由SEQ ID NO:2所表示的核苷酸序列组成的C13正向引物(KrasC13‑F4)或与所述C13正向引物大致上相同的寡核苷酸，或(b)由SEQ ID NO:5所表示的核苷酸序列组成的寡核苷酸(KrasC13‑F)或与所述寡核苷酸大致上相同的寡核苷酸；
(B)第二对密码子13突变寡核苷酸引物，其具有：
(i)由SEQ ID NO:7所表示的核苷酸序列组成的正向引物(13ASP正向引物)或与所述正向引物大致上相同的寡核苷酸；以及
(ii)由SEQ ID NO:19所表示的核苷酸序列组成的反向引物(C12共用反向引物)或与所述反向引物大致上相同的寡核苷酸；或
(C)至少一对密码子12突变的寡核苷酸引物，其具有：
(i)至少一种正向引物，其选自：(a)由SEQ ID NO:8所表示的核苷酸序列组成的寡核苷酸(12VAL正向引物)或与所述寡核苷酸大致上相同的寡核苷酸；(b)由SEQ ID NO:14所表示的核苷酸序列组成的寡核苷酸(12SER正向引物)或与所述寡核苷酸大致上相同的寡核苷酸；(c)由SEQ ID NO:15所表示的核苷酸序列组成的寡核苷酸(12ARG正向引物)或与所述寡核苷酸大致上相同的寡核苷酸；(d)由SEQ ID NO:16所表示的核苷酸序列组成的寡核苷酸(12CYS正向引物)或与所述寡核苷酸大致上相同的寡核苷酸；(e)由SEQ ID NO:17所表示的核苷酸序列组成的寡核苷酸(12ASP正向引物)或与所述寡核苷酸大致上相同的寡核苷酸；(f)由SEQ ID NO:18所表示的核苷酸序列组成的寡核苷酸(12ALA正向引物)或与所述寡核苷酸大致上相同的寡核苷酸；(g)由SEQ ID NO:9所表示的核苷酸序列组成的寡核苷酸(KrasM35T_1GA‑F)或与所述寡核苷酸大致上相同的寡核苷酸；或(h)由SEQ ID NO:10所表示的核苷酸序列组成的寡核苷酸(Kras35T_3CG‑F)或与所述寡核苷酸大致上相同的寡核苷酸；以及
(ii)由SEQ ID NO:19所表示的核苷酸序列组成的寡核苷酸反向引物(所述C12共用反向引物)或与所述寡核苷酸反向引物大致上相同的寡核苷酸；
(2)测定步骤(1)(I)的产物是否包含用所述一对对照寡核苷酸引物扩增的外显子4的所述DNA区的扩增产物，例如从所述一对对照寡核苷酸引物的一员跨越至所述一对对照寡核苷酸引物的另一员，或从与所述一对对照寡核苷酸引物的一员互补的区域跨越至与所述一对对照寡核苷酸引物的另一员互补的区域的外显子4的所述DNA区，其中检测到所述扩增产物表明：所述DNA中存在所述KRAS基因；以及
(3)测定步骤(1)(II)的产物是否包含用所述一对突变寡核苷酸引物扩增的外显子2的所述DNA区的扩增产物，例如从所述至少一对突变寡核苷酸引物的一员跨越至所述至少一对突变寡核苷酸引物的另一员，或从与所述至少一对突变寡核苷酸引物的一员互补的区域跨越至与所述至少一对突变寡核苷酸引物的另一员互补的区域的外显子2的所述DNA区，其中
(a)当在步骤(1)(II)中使用至少一对密码子13突变寡核苷酸引物时，检测到所述扩增产物表明：所述DNA中的所述KRAS基因的外显子2中的密码子13中存在突变；和/或
(b)当在步骤(1)(II)中使用至少一对密码子12突变寡核苷酸引物时，检测到所述扩增产物表明：所述DNA中的所述KRAS基因的外显子2中的密码子12中存在突变。
本发明还提供一种预测患者体内的肿瘤对表皮生长因子受体定向化疗的敏感度的方法，所述方法包括：
(1)从所述肿瘤获取DNA；以及
(2)使用本文所公开的用于检测DNA中的KRAS突变的本发明的方法，来测定在所述DNA中的所述KRAS基因的外显子2中的密码子12中是否存在突变和/或密码子13中是否存在突变，其中在密码子12中检测到突变和/或密码子13中检测到突变预示：与密码子12和密码子13中没有突变的同一类型的肿瘤相比，所述肿瘤对表皮生长因子受体定向化疗具有降低的敏感度。
发明详述
KRAS基因中突变的存在可高度预测出肿瘤患者对EGFR定向化疗的无反应性，所述EGFR定向化疗例如使用EGFR抑制剂如西妥昔单抗和帕尼单抗的肿瘤治疗。本发明提供了可以在PCR中用作引物或探针以精确和可靠地检测DNA中的KRAS突变的寡核苷酸。本发明还提供了使用这些寡核苷酸作为引物或探针来检测DNA中的KRAS突变的方法。本文公开的寡核苷酸可以通过本领域已知的方法(包括化学合成)来制备。
如本文所使用，除非另外说明，否则术语“KRAS”指的是人的Kirsten ras致癌基因。KRAS的核苷酸序列是众所周知的。KRAS有两个同种型，并且这两个同种型的核苷酸序列可以在基因库中以NM_033360和NM_004985找到，所述核苷酸序列的公开内容以引用的方式并入本文。
如本文所使用，术语“寡核苷酸”指的是一系列连接的核苷酸残基，所述寡核苷酸具有足够数量的核苷酸残基以在PCR中用作引物或探针。可修饰本发明的寡核苷酸以包含标记，例如荧光标记。
如本文所使用，寡核苷酸与主题寡核苷酸“大致上相同”，所述主题寡核苷酸由通过以下所表示的核苷酸序列组成：SEQ ID NO:1(13ASP反向引物)、2(C13正向引物)、4(Kras38A_3TC‑R)、5(KrasC13‑F)、7(13ASP正向引物)、8(12VAL正向引物)、9(KrasM35T_1GA‑F)、10(Kras35G_3CG‑F)、11(KrasEx4对照正向引物)、12(KrasEx4对照反向引物)、14(12SER正向引物)、15(12ARG正向引物)、16(12CYS正向引物)、17(12ASP正向引物)、18(12ALA正向引物)或19(C12共用反向引物)，其中所述大致上相同的寡核苷酸具有与主题寡核苷酸至少85%，优选至少90%，更优选至少95％，以及更优选至少98%的序列同一性，并且其中3’端上五个核苷酸中无错配。
与主题寡核苷酸大致上相同的寡核苷酸包括从所述主题寡核苷酸的5’端上除去1、2或3个核苷酸的寡核苷酸，所述主题寡核苷酸由通过以下所表示的核苷酸序列组成：SEQ ID NO:1(13ASP反向引物)、2(C13正向引物)、4(Kras38A_3TC‑R)、5(KrasC13‑F)、7(13ASP正向引物)、8(12VAL正向引物)、9(KrasM35T_1GA‑F)、10(Kras35G_3CG‑F)、11(KrasEx4对照正向引物)、12(KrasEx4对照反向引物)、14(12SER正向引物)、15(12ARG正向引物)、16(12CYS正向引物)、17(12ASP正向引物)、18(12ALA正向引物)或19(C12共用反向引物)。
与主题寡核苷酸大致上相同的寡核苷酸包括在所述主题寡核苷酸的5’端添加1、2或3个核苷酸的寡核苷酸，所述主题寡核苷酸由通过以下所表示的核苷酸序列组成：SEQ ID NO:1(13ASP反向引物)、2(C13正向引物)、4(Kras38A_3TC‑R)、5(KrasC13‑F)、7(13ASP正向引物)、8(12VAL正向引物)、9(KrasM35T_1GA‑F)、10(Kras35G_3CG‑F)、11(KrasEx4对照正向引物)、12(KrasEx4对照反向引物)、14(12SER正向引物)、15(12ARG正向引物)、16(12CYS正向引物)、17(12ASP正向引物)、18(12ALA正向引物)或19(C12共用反向引物)。
与由通过SEQ ID NO:1(13ASP反向引物)所表示的核苷酸序列组成的主题寡核苷酸大致上相同的寡核苷酸的实例可以是CGTCAAGGCACTCTTGCCTAAGT(SEQ ID NO:21)、TCGTCAAGGCACTCTTGCCTAAGT(SEQ ID NO:22)以及ATCGTCAAGGCACTCTTGCCTAAGT(SEQ ID NO:23)。
与由通过SEQ ID NO:2(C13反向引物)所表示的核苷酸序列组成的主题寡核苷酸大致上相同的寡核苷酸的实例可以是AGGCCTGCTGAAAATGACTGA(SEQ ID NO:24)、AAGGCCTGCTGAAAATGACTGA(SEQ ID NO:25)以及TAAGGCCTGCTGAAAATGACTGA(SEQ ID NO:26)。
与由通过SEQ ID NO:4(Kras38A_3TG‑R)所表示的核苷酸序列组成的主题寡核苷酸大致上相同的寡核苷酸的实例可以是AAGGCACTCTTGCCTCCGT(SEQ ID NO:27)、CAAGGCACTCTTGCCTCCGT(SEQ ID NO:28)以及TCAAGGCACTCTTGCCTCCGT(SEQ ID NO:29)。
与由通过SEQ ID NO:5(KrasC13‑F)所表示的核苷酸序列组成的主题寡核苷酸大致上相同的寡核苷酸的实例可以是GGCCTGCTGAAAATGACTGAATAT(SEQ ID NO:30)、AGGCCTGCTGAAAATGACTGAATAT(SEQ ID NO:31)以及AAGGCCTGCTGAAAATGACTGAATAT(SEQ ID NO:32)。
与由通过SEQ ID NO:7(13ASP正向引物)所表示的核苷酸序列组成的主题寡核苷酸大致上相同的寡核苷酸的实例可以是ACTTGTGGTAGTTGGAGCTGGTAA(SEQ ID NO:33)、AACTTGTGGTAGTTGGAGCTGGTAA(SEQ ID NO:34)以及AAACTTGTGGTAGTTGGAGCTGGTAA(SEQ ID NO:35)。
与由通过SEQ ID NO:8(12VAL正向引物)所表示的核苷酸序列组成的主题寡核苷酸大致上相同的寡核苷酸的实例可以是GAATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCTTT(SEQ ID NO:36)、TGAATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCTTT(SEQ ID NO:37)以及CTGAATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCTTT(SEQ ID NO:38)。
与由通过SEQ ID NO:9(KrasM35T_1GA‑F)所表示的核苷酸序列组成的主题寡核苷酸大致上相同的寡核苷酸的实例可以是TGAATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCTAT(SEQ ID NO:39)、CTGAATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCTAT(SEQ ID NO:40)以及ACTGAATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCTAT(SEQ ID NO:41)。
与由通过SEQ ID NO:10(Kras35T_3CG‑F)所表示的核苷酸序列组成的主题寡核苷酸大致上相同的寡核苷酸的实例可以是ATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGGTGT(SEQ ID NO:42)、AATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGGTGT(SEQ ID NO:43)以及GAATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGGTGT(SEQ ID NO:44)。
与由通过SEQ ID NO:14(12SER正向引物)所表示的核苷酸序列组成的主题寡核苷酸大致上相同的寡核苷酸的实例可以是CTGAATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGATA(SEQ ID NO:45)、ACTGAATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGATA(SEQ ID NO:46)以及GACTGAATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGATA(SEQ ID NO:47)。
与由通过SEQ ID NO:15(12ARG正向引物)所表示的核苷酸序列组成的主题寡核苷酸大致上相同的寡核苷酸的实例可以是GAATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGGTC(SEQ ID NO:48)、TGAATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGGTC(SEQ ID NO:49)以及CTGAATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGGTC(SEQ ID NO:50)。
与由通过SEQ ID NO:16(12CYS正向引物)所表示的核苷酸序列组成的主题寡核苷酸大致上相同的寡核苷酸的实例可以是CTGAATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGTTT(SEQ ID NO:51)、ACTGAATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGTTT(SEQ ID NO:52)以及GACTGAATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGTTT(SEQ ID NO:53)。
与由通过SEQ ID NO:17(12ASP正向引物)所表示的核苷酸序列组成的主题寡核苷酸大致上相同的寡核苷酸的实例可以是TAAACTTGTGGTAGTTGGAGCAGA(SEQ ID NO:54)、ATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCAGA(SEQ ID NO:55)以及TATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCAGA(SEQ ID NO:56)。
与由通过SEQ ID NO:18(12ALA正向引物)所表示的核苷酸序列组成的主题寡核苷酸大致上相同的寡核苷酸的实例可以是AAACTTGTGGTAGTTGGAGCAGC(SEQ ID NO:57)、TAAACTTGTGGTAGTTGGAGCAGC(SEQ ID NO:58)以及ATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCAGC(SEQ ID NO:59)。
与由通过SEQ ID NO:19(C12共用反向引物)所表示的核苷酸序列组成的主题寡核苷酸大致上相同的寡核苷酸的实例可以是CCACAAAATGATTCTGAATTAGCTGTATC(SEQ ID NO:60)、TCCACAAAATGATTCTGAATTAGCTGTATC(SEQ ID NO:61)以及GTCCACAAAATGATTCTGAATTAGCTGTATC(SEQ ID NO:62)。
如本文所使用，寡核苷酸与主题寡核苷酸“大致上相同”，所述主题寡核苷酸由通过以下所表示的核苷酸序列组成：SEQ ID NO:3(C13探针)、6(KrasC13_Mc)或13(KrasEx4对照探针)，其中大致上相同的寡核苷酸具有与主题寡核苷酸至少85%，优选至少90%，更优选至少95%的序列同一性。
如本文所使用，“序列同一性百分比(%)”是通过正确对准各个寡核苷酸区段或其互补链并适当考虑核苷酸插入和缺失来测定。当所比较的序列不具有相同长度时，“序列同一性百分比(%)”指的是所比较的序列之间的相同核苷酸残基数目与较长序列中核苷酸残基总数的百分比。
如本文所使用，术语“探针”指的是各种长度的寡核苷酸，所述寡核苷酸将与靶DNA序列缔合，并且用信号指示样本中靶序列的存在和/或水平。举例来说，探针可携带荧光标记并且在适合的条件下发射荧光以用信号指示靶DNA序列存在和/或水平。
如本文所使用，“6FAM”指的是6‑羧基荧光素。
如本文所使用，“PCR”通常指的是聚合物链反应(polymer chain reaction)，它是一种用于扩增DNA序列的方法，该方法使用热稳定聚合酶和两种寡核苷酸引物，一种引物与要扩增的序列一端上的(+)链互补，而另一种引物与另一端上的(‑)链互补。因为新合成的DNA链随后可以起到额外模板的作用，所以引物退火、链延伸以及解离的连续循环会产生所需DNA序列的快速和高特异性的扩增。
在用于检测DNA中的KRAS突变的本发明方法的步骤(1)中，主题DNA可以用如实时PCR的PCR方法来扩增。
PCR可通过本领域已知的任何方法来进行。举例来说，PCR可包括制备要分析的DNA的混合物、寡核苷酸引物、dNTP、Mg++、热稳定DNA聚合酶以及适合的缓冲溶液；对混合物进行初步加热，例如，加热至95℃的温度进行10分钟，然后进行适合的温度循环来扩增DNA。举例来说，每次温度循环可包括将PCR混合物加热至95C进行30秒，然后将PCR混合物冷却至60C进行1分钟。在某些实施方案中，PCR可以是ARMS PCR，其中使用了缺乏3’核酸外切酶活性的聚合酶(例如，Taq聚合酶)，并且一个引物的3’末端符合要检测的靶KRAS突变。ARMS PCR与如荧光标记探针的其它技术的组合允许在实时PCR反应中检测突变。
在荧光标记探针的情况下，可使用基于荧光的实时检测方法,如通过ABIPRISM 7700或7900序列检测系统(Applied Biosystems,FosterCity,California)或如Heid等(Genome Res 1996；6:986‑994)和Gibson等(Genome Res 1996；6:995‑1001)所描述的类似系统来完成对DNA中的KRAS突变存在的检测。ABI 7700或ABI 7900的输出用“Ct”或“循环阈值”表达，所述输出指的是在报告基因荧光大于阈值时的PCR循环数，所述阈值是任意水平的荧光，所检测到的高于所述阈值的信号被视为实时信号。阈值可根据基线变化性来选择，并且可以针对每次实验做出调整。样本中高数目的靶分子以较少的PCR循环(低Ct)产生信号，而样本中低数目的靶分子以更多的PCR循环(高Ct)产生信号。
如本文所使用，“引物”指的是短的寡核苷酸链，该链将与要扩增的DNA模板片段的一条链的端部杂交，其中DNA聚合酶通过延伸引物的3’端来结合和合成新的DNA链。
如本文所使用，“表皮生长因子受体定向化疗”或“EGFR定向化疗是经由施用可以破坏或干扰涉及EGFR的信号途径的物质的化疗。EGFR定向化疗可以涉及施用EGFR抑制剂。EGFR抑制剂的实例包括：小分子酪氨酸激酶抑制剂，如吉非替尼(gefitinib)和厄洛替尼(erlotinib)；或抗EGFR抗体，如西妥昔单抗和帕尼单抗。
本发明的一个方面针对一种预测患者体内的肿瘤对EGFR定向化疗的敏感度的方法，所述方法包括使用本文所公开的用于检测DNA中的KRAS突变的本发明的方法，来测定从肿瘤获取的DNA中的KRAS基因的外显子2中的密码子12中是否存在突变和/或密码子13中是否存在突变。在密码子12中检测到突变和/或密码子13中检测到突变预示：与密码子12和密码子13中没有突变的同一类型的肿瘤相比，肿瘤对EGFR定向化疗具有降低的敏感度。在本发明的预测方法的一些实施方案中，肿瘤是肺肿瘤，例如非小细胞肺癌和肺腺癌，如有吸烟史，具体来讲严重吸烟史的患者体内的肺腺癌。在本发明的预测方法的一些实施方案中，肿瘤是胰腺癌，或优选结肠直肠癌。如果在肿瘤中检测到在KRAS基因的外显子2的密码子12中的突变和/或密码子13的突变，那么使用不利用EGFR定向化疗的肿瘤治疗将是有益的。
本发明提供了本文公开的检测DNA中的KRAS突变的方法。步骤(1)中所扩增的主题DNA可以是从人的组织中获取的基因组DNA或cDNA。可以使用本领域已知的许多方法来获取基因组DNA或cDNA。例如，将组织中的细胞(例如)用洗涤剂溶解，并且通过使用高浓度的乙酸铵或乙酸钾盐析出蛋白质和其它污染物，接着通过离心来获取DNA，其中DNA经由用醇的沉淀来获取。在另一种DNA分离方法中，细胞溶解产物中的DNA用乙醇沉淀，然后经由以氯化铯梯度的离心来纯化。细胞溶解产物中的DNA也可以用固相阴离子交换色谱法来纯化。可商购的试剂盒，例如，来自Invitrogen的Dynabeads DNA Direct试剂盒或来自Qiagen的DNeasy Tissue试剂盒。基因组DNA可以是用美国专利号6,248,535和6,610,488中公开的方法，从福尔马林固定的石蜡包埋(FFPE)组织中分离的DNA，这些专利的公开内容以引用的方式并入本文。用于获取基因组的方法可包括将组织样本与如苯酚/氯仿/异戊醇(isoamyl alsohol)(10:1.93:0.036)的有机溶剂以及如异硫氰酸胍的适合离液剂混合；然后通过离心将混合物分成三相，即下层有机相(含有DNA)、中间相(含有DNA)以及上层水相(含有RNA)；除去中间相；用冷乙醇或异丙醇沉淀中间相中的DNA，然后离心；用冷乙醇洗涤所得的DNA团块，并且再次离心；干燥DNA团块；在如Tris或TE(Tris‑EDTA)的缓冲液中重新溶解DNA。
利用反转录，如使用反转录酶PCR和适当的引物如聚dT寡核苷酸，可以从组织中分离的mRNA中获取cDNA。举例来说，RT‑PCR可通过在适合缓冲液中将mRNA与dNTP、牛血清白蛋白(BSA)、RNA酶抑制剂、随机六聚体以及莫洛尼鼠白血病病毒(Moloney‑Murine Leukemia Virus)反转录酶混合，并且对混合物进行热循环。每次热循环可包括在26℃下8分钟、在42℃下45分钟以及在95℃下5分钟。mRNA可以用美国专利号6,248,535和6,610,488中公开的方法从FFPE组织中分离。mRNA也可以从不是体液的水性样本的组织中分离，如美国专利号6,428,963中所公开，该专利的公开内容以引用的方式并入本文。基因组DNA或mRNA可以从中分离的组织可以是肿瘤组织，如结肠直肠癌，例如转移性结肠直肠癌、胰腺癌或肺癌，例如肺腺癌和非小细胞肺癌。
一种从石蜡包埋组织样本中分离mRNA的示例性方法包括：a)用有机溶剂使样本脱蜡，例如，通过将样本与二甲苯剧烈混合，接着在足以使组织在管中形成团块的速度下离心，通常在约10,000至约20,000×g下离心；b)将脱蜡的样本与低级醇的水溶液再水合，所述低级醇如甲醇、乙醇、丙醇以及丁醇；c)任选使用机械、声波或其它均质化手段来使样本均质化；d)在包含如硫氰酸胍的离液剂的离液溶液中加热样本至约50℃至约100℃范围内的温度进行约30至约60分钟；以及e)通过包括以下的许多方法中的任何方法从离液溶液中回收RNA：用有机溶剂的萃取，例如氯仿萃取、苯酚‑氯仿萃取；用乙醇或异丙醇或任何其它低级醇的沉淀；色谱法，包括离子交换色谱法、体积排阻色谱法、硅胶色谱法以及逆相色谱法；或电泳法，包括聚丙烯酰胺凝胶电泳法和琼脂糖凝胶电泳法。举例来说，RNA可如下回收：1)用pH 4.0的2M乙酸钠和新鲜制备的苯酚/氯仿/异戊醇(10:1.93:0.036)，通过剧烈摇晃约10秒来萃取样本，然后在冰上冷却约15分钟；2)在最大速度下离心溶液约7分钟，并且将上层(水)相转移至新的管中；3)用糖原和异丙醇在‑20℃下沉淀RNA 30分钟；4)通过在最大速度下，在台式离心机中离心约7分钟来使RNA形成团块；倾析并废除上清液；并且用约70%至75%乙醇洗涤团块；以及5)在最大速度下将样本再次离心7分钟。倾析上清液，并且使团块风干。然后将团块溶解在适当的缓冲液(例如50μL 5mM Tris氯化物，pH 8.0)中。
本发明的方法适用于广范围的组织和肿瘤类型，因此可以用于评价包括乳癌、头颈癌、肺癌、食道癌、结肠直肠癌、胰腺癌以及其它癌症的一系列癌症的预后。优选地，本发明方法适用于非小细胞肺癌(NSCLC)和结肠直肠癌(CRC)的预后。癌症中的KRAS基因的外显子2中的密码子12中的突变和/或密码子13中的突变表明了癌症对EGFR定向化疗的敏感度降低。癌症可以是如肺腺癌和NSCLC的肺癌以及结肠直肠癌。
在用于检测DNA中的KRAS突变的本发明的方法的步骤(1)中使用的DNA聚合酶是缺乏3’核酸外切酶活性的热稳定DNA聚合酶。由于缺乏3’核酸外切酶活性，DNA聚合酶难于延伸寡核苷酸引物，该寡核苷酸引物具有与要在引物的3’端上扩增的DNA的错配。缺乏3’核酸外切酶活性的热稳定DNA聚合酶的实例包括从嗜热脂肪芽胞杆菌(Bacillus stearothermophilus)分离的热稳定Bst DNA聚合酶I(Alitotta等，Genetic Analysis ：Biomolecular Engineering 1996，第12卷，第185‑195页)；等温DNA聚合酶(可从Epicentre Technologies，Madison，Wisconin得到)；经由氧化核酸外切酶活性所必需的氨基酸残基来除去3’至5’核酸外切酶活性的T7DNA聚合酶(测序酶型式(Sequenase Vertion)1)或在基因上通过缺失所述3’至5’核酸外切酶活性所必需的28种氨基酸来除去3’至5’核酸外切酶活性的T7DNA聚合酶(测序酶型式2)；VentR(exo‑)DNA聚合酶以及优选地，Taq聚合酶。
在用于检测DNA中的KRAS突变的本发明的方法的步骤(2)中，可以用本领域已知的适当程序测定步骤(1)(I)的产物是否包含外显子4的DNA区的扩增产物，所述扩增产物从所述一对对照寡核苷酸引物的一员跨越至所述一对对照寡核苷酸引物的另一员，或从与所述一对对照寡核苷酸引物的一员互补的区域跨越至与所述一对对照寡核苷酸引物的另一员互补的区域。例如，可以用步骤(1)(I)产物的DNA测序以及将获得的核苷酸序列与KRAS基因的外显子4的核苷酸序列比较来测定步骤(1)(I)的产物是否包含外显子4的DNA区的扩增产物，所述KRAS基因的外显子4的核苷酸序列从所述一对对照寡核苷酸引物的一员跨越至所述一对对照寡核苷酸引物的另一员。
或者，在用于检测DNA中的KRAS突变的本发明的方法的步骤(2)中，可以通过使用用于KRAS基因的外显子4序列的适当区段的寡核苷酸探针来测定步骤(1)(I)的产物是否包含外显子4的DNA区的扩增产物，所述扩增产物从所述一对对照寡核苷酸引物的一员跨越至所述一对对照寡核苷酸引物的另一员，或从与所述一对对照寡核苷酸引物的一员互补的区域跨越至与所述一对对照寡核苷酸引物的另一员互补的区域，所述KRAS基因的外显子4序列的适当区段从所述一对对照寡核苷酸引物的一员跨越至所述一对对照寡核苷酸引物的另一员。例如，本方法的步骤(2)可以包括将步骤(1)(I)的PCR产物与对外显子4的DNA区特异的寡核苷酸探针混合，所述外显子4的DNA区位于(a)KrasEx4对照正向引物和与KrasEx4对照反向引物互补的区域之间，或(b)KrasEx4对照反向引物和与KrasEx4对照正向引物互补的区域之间，其中寡核苷酸探针与外显子4的DNA区的杂交证明步骤(1)(I)的产物包含外显子4的DNA区的扩增产物，从而表明主题DNA包含KRAS基因。寡核苷酸探针的实例是由核苷酸序列SEQ ID NO:13组成的KrasEx4对照探针或与所述KrasEx4对照探针大致上相同的寡核苷酸。
类似地，在用于检测DNA中的KRAS突变的本发明的方法的步骤(3)中，可以用本领域已知的适当方法来测定步骤(1)(II)的产物是否包含含有突变密码子12和/或突变密码子13的外显子2的DNA区的扩增产物，其中所述扩增产物从所述至少一对突变寡核苷酸引物的一员跨越至所述至少一对突变寡核苷酸引物的另一员，或从与所述至少一对突变寡核苷酸引物的一员互补的区域跨越至与所述至少一对突变寡核苷酸引物的另一员互补的区域。例如，可以用步骤(1)(II)的产物的DNA测序以及将获得的核苷酸序列与KRAS基因的外显子2的核苷酸序列比较来测定步骤(1)(II)的产物是否包含外显子2中含有突变密码子12和/或突变密码子13的DNA区的扩增产物，所述KRAS基因的外显子2的核苷酸序列从所述至少一对突变寡核苷酸引物的一员跨越至所述至少一对突变寡核苷酸引物的另一员。
或者，在用于检测DNA中的KRAS突变的本发明的方法的步骤(3)中，可以通过使用用于KRAS基因的外显子2序列的适当区段的寡核苷酸探针来测定步骤(1)(II)的产物是否包含含有突变密码子12和/或突变密码子13的外显子2的DNA区的扩增产物，其中所述扩增产物从所述至少一对突变寡核苷酸引物的一员跨越至所述至少一对突变寡核苷酸引物的另一员，或从与所述至少一对突变寡核苷酸引物的一员互补的区域跨越至与所述至少一对突变寡核苷酸引物的另一员互补的区域，所述KRAS基因的外显子2序列的适当区段从所述至少一对突变寡核苷酸引物的一员跨越至所述至少一对突变寡核苷酸引物的另一员。
例如，当在用于检测KRAS突变的本发明的方法的步骤(1)(II)中使用第一对密码子13突变寡核苷酸引物时，如步骤(1)(II)(A)中所述，所述方法的步骤(3)可以包括将步骤(1)(II)的PCR产物与对外显子2的DNA区特异的寡核苷酸探针混合，所述外显子2的DNA区位于(a)步骤(1)(II)(A)(i)中所述的反向引物和与步骤(1)(II)(A)(ii)中所述的正向引物互补的区域之间，或(b)步骤(1)((II)(A)(ii)中所述的正向引物和与步骤(1)(II)(A)(i)中所述的反向引物互补的区域之间，其中寡核苷酸探针与外显子2的DNA区的杂交证明步骤(1)(II)的产物包含含有外显子2的密码子13的DNA区的扩增产物，从而表明主题DNA包含KRAS基因的外显子2的密码子13中的突变。寡核苷酸探针的实例是(a)由核苷酸序列SEQ ID NO:3组成的C13探针或与所述C13探针大致上相同的寡核苷酸，以及(b)由通过SEQ ID NO:6表示的核苷酸序列组成的KrasC13_Mc或与所述KrasC13_Mc大致上相同的寡核苷酸。
例如，当在用于检测KRAS突变的本发明的方法的步骤(1)(II)中使用第二对密码子13突变寡核苷酸引物时，如步骤(1)(II)(B)中所述，所述方法的步骤(3)可以包括将步骤(1)(II)的PCR产物与对外显子2的DNA区特异的寡核苷酸探针混合，所述外显子2的DNA区位于(a)步骤(1)(II)(B)(i)中所述的正向引物和与步骤(1)(II)(B)(ii)中所述的反向引物互补的区域之间，或(b)步骤(1)((II)(B)(ii)中所述的反向引物与步骤(1)(II)(B)(i)中所述的正向引物互补的区域之间，其中寡核苷酸探针与外显子2的DNA区的杂交证明步骤(1)(II)的产物包含含有外显子2的密码子13的DNA区的扩增产物，从而表明主题DNA包含KRAS基因的外显子2的密码子13中的突变。寡核苷酸探针的实例是由核苷酸序列SEQ ID NO:20组成的C12共用探针或与所述C12共用探针大致上相同的寡核苷酸。
例如，当在用于检测KRAS突变的本发明的方法的步骤(1)(II)中使用至少一对密码子12突变寡核苷酸引物时，如在步骤(1)(II)(C)中所述，所述方法的步骤(3)可以包括将步骤(1)(II)的PCR产物与对外显子2的DNA区特异的寡核苷酸探针混合，所述外显子2的DNA区位于(a)步骤(1)(II)(C)(i)中所述的至少一个正向引物和与步骤(1)(II)(C)(ii)中所述的至少一个反向引物的互补的区域之间，或(b)步骤(1)((II)(C)(ii)中所述的至少一个反向引物和与步骤(1)(II)(C)(i)中所述的至少一个正向引物的互补的区域之间，其中寡核苷酸探针与外显子2的DNA区的杂交证明步骤(1)(II)的产物包含含有外显子2的密码子12的DNA区的扩增产物，从而表明主题DNA包含KRAS基因的外显子2的密码子12中的突变。寡核苷酸探针的实例是由核苷酸序列SEQ ID NO:20组成的C12共用探针或与所述C12共用探针大致上相同的寡核苷酸。
在用于检测DNA的KRAS突变的本发明的方法的一些实施方案中，步骤(1)(II)使用至少一对突变寡核苷酸引物，其包含
(A)第一对密码子13突变寡核苷酸引物，其具有
(i)作为反向引物的由SEQ ID NO:1所表示的核苷酸序列组成的13ASP反向引物，或与所述13ASP反向引物大致上相同的寡核苷酸，以及
(ii)作为正向引物的由SEQ ID NO:2所表示的核苷酸序列组成的C13正向引物，或与所述C13正向引物大致上相同的寡核苷酸；或
(B)第二对密码子13突变寡核苷酸引物，其具有
(i)作为正向引物的由SEQ ID NO:7所表示的核苷酸序列组成的13ASP正向引物，或与所述13ASP正向引物大致上相同的寡核苷酸；以及
(ii)作为反向引物的由SEQ ID NO:19所表示的核苷酸序列组成的C12共用反向引物，或与所述C12共用反向引物大致上相同的寡核苷酸。
在用于检测DNA的KRAS突变的本发明的方法的一些实施方案中，步骤(1)(II)使用至少一对突变寡核苷酸引物，其包含
(A)第一对密码子13突变寡核苷酸引物，其具有
(i)作为反向引物的由SEQ ID NO:1所表示的核苷酸序列组成的13ASP反向引物，或与所述13ASP反向引物大致上相同的寡核苷酸，以及
(ii)作为正向引物的由SEQ ID NO:2所表示的核苷酸序列组成的C13正向引物，或与所述C13正向引物大致上相同的寡核苷酸；以及
(B)第二对密码子13突变寡核苷酸引物，其具有
(i)作为正向引物的由SEQ ID NO:7所表示的核苷酸序列组成的13ASP正向引物，或与所述13ASP正向引物大致上相同的寡核苷酸；以及
(ii)作为反向引物的由SEQ ID NO:19所表示的核苷酸序列组成的C12共用反向引物，或与所述C12共用反向引物大致上相同的寡核苷酸。
在用于检测DNA的KRAS突变的本发明的方法的一些实施方案中，步骤(1)(II)使用至少一对突变寡核苷酸引物，其包含
(C)至少一对密码子12突变寡核苷酸引物，其具有
(i)作为正向引物的以下引物：(a)由SEQ ID NO:8所表示的核苷酸序列组成的寡核苷酸(12VAL正向引物)或与所述寡核苷酸大致上相同的寡核苷酸；(b)由SEQ ID NO:14所表示的核苷酸序列组成的寡核苷酸(12SER正向引物)或与所述寡核苷酸大致上相同的寡核苷酸；(c)由SEQ ID NO:15所表示的核苷酸序列组成的寡核苷酸(12ARG正向引物)或与所述寡核苷酸大致上相同的寡核苷酸；(d)由SEQ ID NO:16所表示的核苷酸序列组成的寡核苷酸(12CYS正向引物)或与所述寡核苷酸大致上相同的寡核苷酸；(e)由SEQ ID NO:17所表示的核苷酸序列组成的寡核苷酸(12ASP正向引物)或与所述寡核苷酸大致上相同的寡核苷酸；(f)由SEQ ID NO:18所表示的核苷酸序列组成的寡核苷酸(12ALA正向引物)或与所述寡核苷酸大致上相同的寡核苷酸；(g)由SEQ ID NO:9所表示的核苷酸序列组成的寡核苷酸(KrasM35T_1GA‑F)或与所述寡核苷酸大致上相同的寡核苷酸；或(h)由SEQ ID NO:10所表示的核苷酸序列组成的寡核苷酸(Kras35T_3CG‑F)或与所述寡核苷酸大致上相同的寡核苷酸；以及
(ii)由SEQ ID NO:19所表示的核苷酸序列组成的寡核苷酸反向引物(所述C12共用反向引物)或与所述寡核苷酸反向引物大致上相同的寡核苷酸。
在用于检测DNA的KRAS突变的本发明的方法的一些实施方案中，步骤(1)(II)使用至少一对突变寡核苷酸引物，其包含
(C)密码子12突变寡核苷酸引物，其具有
(i)作为正向引物的以下引物：(a)由SEQ ID NO:8所表示的核苷酸序列组成的寡核苷酸(12VAL正向引物)或与所述寡核苷酸大致上相同的寡核苷酸；(b)由SEQ ID NO:14所表示的核苷酸序列组成的寡核苷酸(12SER正向引物)或与所述寡核苷酸大致上相同的寡核苷酸；(c)由SEQ ID NO:15所表示的核苷酸序列组成的寡核苷酸(12ARG正向引物)或与所述寡核苷酸大致上相同的寡核苷酸；(d)由SEQ ID NO:16所表示的核苷酸序列组成的寡核苷酸(12CYS正向引物)或与所述寡核苷酸大致上相同的寡核苷酸；(e)由SEQ ID NO:17所表示的核苷酸序列组成的寡核苷酸(12ASP正向引物)或与所述寡核苷酸大致上相同的寡核苷酸；(f)由SEQ ID NO:18所表示的核苷酸序列组成的寡核苷酸(12ALA正向引物)或与所述寡核苷酸大致上相同的寡核苷酸；(g)由SEQ ID NO:9所表示的核苷酸序列组成的寡核苷酸(KrasM35T_1GA‑F)或与所述寡核苷酸大致上相同的寡核苷酸；以及(h)由SEQ ID NO:10所表示的核苷酸序列组成的寡核苷酸(Kras35T_3CG‑F)或与所述寡核苷酸大致上相同的寡核苷酸；以及
(ii)由SEQ ID NO:19所表示的核苷酸序列组成的寡核苷酸反向引物(所述C12共用反向引物)或与所述寡核苷酸反向引物大致上相同的寡核苷酸。
在用于检测DNA的KRAS突变的本发明的方法的一些实施方案中，步骤(1)(II)中使用的至少一对突变寡核苷酸引物包含
(A)第一对密码子13突变寡核苷酸引物，其具有
(i)作为反向引物的由SEQ ID NO:1所表示的核苷酸序列组成的13ASP反向引物，或与所述13ASP反向引物大致上相同的寡核苷酸，以及
(ii)作为正向引物的由SEQ ID NO:2所表示的核苷酸序列组成的C13正向引物，或与所述C13正向引物大致上相同的寡核苷酸；
(B)第二对密码子13突变寡核苷酸引物，其具有
(i)作为正向引物的由SEQ ID NO:7所表示的核苷酸序列组成的13ASP正向引物，或与所述13ASP正向引物大致上相同的寡核苷酸；以及
(ii)作为反向引物的由SEQ ID NO:19所表示的核苷酸序列组成的C12共用反向引物，或与所述C12共用反向引物大致上相同的寡核苷酸；以及
(C)密码子12突变寡核苷酸引物，其具有
(i)作为正向引物的以下引物：(a)由SEQ ID NO:8所表示的核苷酸序列组成的寡核苷酸(12VAL正向引物)或与所述寡核苷酸大致上相同的寡核苷酸；(b)由SEQ ID NO:14所表示的核苷酸序列组成的寡核苷酸(12SER正向引物)或与所述寡核苷酸大致上相同的寡核苷酸；(c)由SEQ ID NO:15所表示的核苷酸序列组成的寡核苷酸(12ARG正向引物)或与所述寡核苷酸大致上相同的寡核苷酸；(d)由SEQ ID NO:16所表示的核苷酸序列组成的寡核苷酸(12CYS正向引物)或与所述寡核苷酸大致上相同的寡核苷酸；(e)由SEQ ID NO:17所表示的核苷酸序列组成的寡核苷酸(12ASP正向引物)或与所述寡核苷酸大致上相同的寡核苷酸；(f)由SEQ ID NO:18所表示的核苷酸序列组成的寡核苷酸(12ALA正向引物)或与所述寡核苷酸大致上相同的寡核苷酸；(g)由SEQ ID NO:9所表示的核苷酸序列组成的寡核苷酸(KrasM35T_1GA‑F)或与所述寡核苷酸大致上相同的寡核苷酸；以及(h)由SEQ ID NO:10所表示的核苷酸序列组成的寡核苷酸(Kras35T_3CG‑F)或与所述寡核苷酸大致上相同的寡核苷酸；以及
(ii)由SEQ ID NO:19所表示的核苷酸序列组成的寡核苷酸反向引物(所述C12共用反向引物)或与所述寡核苷酸反向引物大致上相同的寡核苷酸。
在用于检测DNA中的KRAS突变的本发明的方法的一些实施方案中，在步骤(1)中，DNA、所述一对对照寡核苷酸引物以及至少一对突变寡核苷酸引物与反应混合物A混合，所述反应混合物A是来自Applied Biosystems的TaqMan 1000反应金(Reaction Gold)/缓冲液A Pack与总共100mM dNTP的混合物，所述dNTP可以从Applied Biosystems或GE Healthcare获得。
在用于检测主题DNA中的KRAS突变的本发明的方法的一些实施方案中，除主题DNA之外，所述方法也适用于DNA阴性对照，该阴性对照也被称为无模板对照(NTC)。所述方法适用于主题DNA，并且所述方法的单独操作也可以平行方式大致上同时适用于NTC，其中在步骤(1)中，在NTC中使用不含有DNA的液体样本来代替主题DNA。换句话说，使用缺乏3’核酸外切酶活性的热稳定DNA聚合酶步骤(1)中所述的引物对不含DNA的液体样本进行PCR。当使用不含DNA的液体样本来代替主题DNA时，所述方法应在步骤(2)和(3)中不产生扩增产物。不含DNA的液体样本应该是相同的液体介质，例如，用以保持主题DNA的适当的缓冲液，如pH 8.0的5mM Tris，例外情况是液体介质中不存在DNA。例如，如果主题DNA是从FFPE组织中获取，那么用于DNA阴性对照或NTC操作的不含DNA的液体样本可以是含有异硫氰酸胍而无DNA的pH 8.0的5mM Tris缓冲液。
在用于检测DNA中的KRAS突变的本发明的方法的某些实施方案中，可使用实时PCR，其中实时PCR可以用以下循环参数来进行：
阶段1：50℃进行15秒，循环一次；
阶段2：95℃进行10分钟，循环一次；以及
阶段3：95℃进行15秒和60℃进行1分钟，循环42次。
在使用实时PCR来检测DNA中的KRAS突变的本发明的方法的一些实施方案中，在对照分析和突变分析中(分别在用于测定本发明KRAS突变的方法的步骤(1)(I)和步骤(1)(II)中)用PCR来扩增DNA，并且扩增产物可以使用荧光标记寡核苷酸探针来识别，然后方法进一步包括测定突变Ct、对照Ct以及ΔCt的值，并且通过将ΔCt值与表2中公开的预定ΔCt值比较来测定DNA中的KRAS突变的存在。
如本文所使用，“突变Ct”指的是突变分析的Ct，其中DNA是用如用于检测KRAS突变的本发明的方法的步骤(1)(II)中所述至少一对突变寡核苷酸引物来扩增，其中所述至少一对突变寡核苷酸引物对外显子2的密码子12或13中的突变是特异的。“突变Ct”是来自突变分析的报告基因荧光大于阈值时的PCR循环数。如本文所使用，术语“对照Ct”指的是对照分析的Ct，其中DNA是用如用于检测KRAS突变的本发明的方法的步骤(1)(I)中所述的一对对照寡核苷酸引物来扩增。对照Ct是来自对照分析的报告基因荧光大于阈值时的PCR循环数。可以将阈值设定在一个点以便在步骤(1)(I)中使用KrasEx4正向对照和KrasEx4反向对照引物的情况下，为gDNA对照分析提供27.0至29.0之间的Ct值，其中在步骤(1)中，使用可在商业上从Promega获得的gDNA(#G3041)代替主题或测试DNA。
如本文所使用，“差值Ct(ΔCt)”指的是突变Ct与对照Ct之间的差，也就是，
ΔCt=[突变Ct]–[对照Ct]。
在用于检测DNA中的KRAS突变的本发明的方法的一些实施方案中，所述方法适用于主题DNA的测试样本，并且所述方法也可单独地以平行方式适用于DNA阴性对照(NTC)样本。NTC样本和主题DNA的测试样本中的每一个可以操作两次，并且计算对于NTC样本和测试样本中的每一个进行两次操作的突变Ct的平均值和对照Ct的平均值，并且也从平均突变Ct和平均对照Ct来计算NTC样本和测试样本中的每一个的ΔCt。当对主题DNA的测试样本使用实时PCR并对NTC进行平行操作时，所述方法应该得出大约或等于表1中针对NTC所列的验收标准的平均Ct值。
表1
NTC样本的平均Ct的验收标准

在用于检测DNA中的KRAS突变的本发明的方法的这些实施方案中，如果NTC的平均Ct值大于或等于表1中所列的Ct验收标准，如果主题DNA的测试样本的平均Ct值小于或等于表2中所列的针对所使用的特定引物的最大Ct值，那么对主题DNA的测试样本进行的方法的结果被视为可接受的。
表2
针对测试样本的Ct验收标准

在这些实施方案中，当ΔCt值低于表2中所列的针对所使用的特定突变引物的最大ΔCt值时，将测定出KRAS突变存在于对应于所使用的特定突变引物的密码子中的主题DNA的测试样本中。