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1、(10)申请公布号 CN 102943062 A (43)申请公布日 2013.02.27 CN 102943062 A *CN102943062A* (21)申请号 201210474503.3 (22)申请日 2012.11.21 C12N 5/071(2010.01) (71)申请人 武汉大学 地址 430072 湖北省武汉市武昌区珞珈山武 汉大学 (72)发明人 翁小东 王磊 陈晖 刘修恒 陈志远 汪志顺 刑变枝 (74)专利代理机构 武汉科皓知识产权代理事务 所 ( 特殊普通合伙 ) 42222 代理人 汪俊锋 (54) 发明名称 一种大鼠肾小管上皮细胞缺血后处理的细胞 模型的建立方。
2、法 (57) 摘要 本发明公开了一种对大鼠肾小管上皮细胞缺 血再灌注损伤有保护作用的缺血后处理细胞模 型， 能最大限度的模拟动物体内缺血后处理。 利用 该缺血后处理细胞模型减轻大鼠肾小管上皮细胞 缺血再灌注损伤的方法， 以及经该缺血后处理细 胞模型在大鼠肾小管上皮细胞缺血再灌注损伤保 护中的应用均为世界首创。该模型可有效方便地 对大鼠肾小管上皮细胞缺血再灌注损伤进行保护 以及对细胞水平的缺血后处理保护机制进行探讨 研究。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 5 页 附图 1 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 5 页 附图。
3、 1 页 1/1 页 2 1. 一种大鼠肾小管上皮细胞缺血后处理的细胞模型的建立方法， 其特征在于， 包括如 下步骤 ： （1） 接种于 35mm 规格的培养皿的 NRK-52E 细胞同步化 24h 后， 将培养皿中的液体更换 为缺血缓冲液并置于含 0.5% O2和 5% CO2的三气培养箱中， 于饱和湿度、 37培养 3 小时， 模拟缺血过程 ； （2） 向培养皿中添加 0.5ml 新鲜的完全培养液， 置于含空气氧浓度、 5% CO2二氧化碳培 养箱中， 于饱和湿度、 37培养 10min， 模拟再灌注过程 ； 再将培养皿置于前述的三气培养 箱中培养 10min， 模拟缺氧过程 ； 此 20。
4、min 为一个循环， 记为 HP1 组， 完成两个循环记为 HP2 组， 完成三个循环记为 HP3 组 ； （3） 最后培养皿中的液体更换为完全培养液 2mL 在前述的二氧化碳培养箱中培养至指 定的时间点， 以完成整个缺血后处理的细胞模型。 2. 根据权利要求 1 所述的细胞模型的建立方法， 其特征是， 在每个再灌注开始之前， 保 留原有的缺血缓冲液， 在此基础上加入 0.5mL 新鲜完全培养液。 3. 根据权利要求 1 所述的细胞模型的建立方法， 其特征是， 缺血缓冲液应用 bicarbonateMES 缓冲的林格氏液， 每 1L 中含有 NaHCO3 0.378g， Na2HPO4 0.1。
5、14g， NaH2PO4 0.024g， NaCl 6.201g， KCl 0.402g， CaCl2 0.133g， MgCl2 0.076g， MES3.9g， 用 1 mmol/L 的 NaOH 调整 PH 至 6.6。 权 利 要 求 书 CN 102943062 A 2 1/5 页 3 一种大鼠肾小管上皮细胞缺血后处理的细胞模型的建立方 法 技术领域 0001 本发明涉及一种大鼠肾小管上皮细胞缺血后处理的细胞模型的建立方法， 适用于 大鼠肾小管上皮细胞缺血再灌注损伤的保护研究。 背景技术 0002 缺血再灌注损伤是指组织缺血一段时间， 当血流重新恢复后， 组织的损伤程度较 缺血时进一。
6、步加重、 器官功能进一步恶化的综合征。 在缺血性疾病抢救和治疗过程中， 医学 家们渐渐发现， 对组织造成损伤的主要因素， 不是缺血本身， 而是恢复血液供应后， 过量的 自由基攻击这部分重新获得血液供应的组织内的细胞造成的。 0003 缺血预处理是一种可以减轻组织缺血再灌注损伤的方法， 虽然这种方法对缺血再 灌注损伤有强力的保护作用， 但是由于在临床工作中， 患者组织器官发生缺血缺氧的不可 预见性， 使得其临床应用受到了很大的限制。 0004 近年来， 有研究者提出另外一种内源性肾脏保护形式缺血后处理， 是指在肾 脏较长时间缺血后再灌注时， 首先给予肾脏数次短时间的再灌注缺血循环， 然后才给予肾。
7、 脏充分的再灌注。虽然缺血后处理与缺血预处理能够取得相似的保护作用， 但与缺血预 处理不同的是， 缺血后处理具有更好的临床应用前景。国内外的许多研究结果显示， 缺血 后处理可以减轻大鼠 （Liu X, Chen H, Zhan B, et al. Attenuation of reperfusion injury by renal ischemic postconditioning: the role of NO. Biochem Biophys Res Commun. 2007; 359: 628-34.） 、 兔 （邹平 , 龚明 , 张春燕等 ； 缺血后处理对肾缺血 - 再灌 注损伤兔血。
8、液流变学及肾组织细胞凋亡的影响 . 2010, 37(19)） 、 犬 （Jiang BT, Liu XH, Chen H, Ischemic postconditioning attenuates renal ischemic/reperfusion injury in mongrel dogsJ.Urology,2010,76: 1519.e1-1519.e7.） 缺血再灌注动物模型的肾脏 损伤。 0005 目前， 关于肾脏缺血后处理的研究大部分是在动物模型上实现的。借助于动物模 型的研究， 可以有意识地改变那些在自然条件下不可能或不易排除的因素， 以便更准确地 观察模型的实验结果并与人类。
9、肾脏缺血再灌注的结果进行比较研究， 有助于更方便、 更有 效地认识人类肾脏缺血再灌注的发生发展规律， 研究防治措施。国外许多大鼠缺血后处 理的动物模型研究中发现， 单次后处理时间过长、 后处理循环次数过少都有可能限制其肾 脏保护作用的发挥。我们的前期研究结果显示， 缺血后处理对大鼠 （Chen H， Xing BZ， Liu XH, et al. Ischemic postconditioning inhibits apoptosis after renal ischemia/ reperfusion injury in ratJ. Transplant International, 2008。
10、,21:364-371.） 、 狗 （Jiang BT, Liu XH, Chen H, Ischemic postconditioning attenuates renal ischemic/ reperfusion injury in mongrel dogsJ.Urology,2010,76: 1519.e1-1519.e7.） 的肾脏 缺血再灌注均有保护作用。结果还显示， 采用反复 6 次恢复血供 10 s - 阻断血供 10 s 的 后处理方法， 与其他相比， 其肾功能指标明显改善， 细胞凋亡明显降低。 说 明 书 CN 102943062 A 3 2/5 页 4 0006 由于很多。
11、因素的限制， 动物模型很难精确地模拟临床上肾脏缺血后处理的情况。 缺血后处理的细胞模型与动物模型相比有许多优势， 其中最突出的是， 细胞模型提供了一 个单一的环境， 在这个环境里特定的刺激可以被分离、 控制， 同时我们可以评价它们对于缺 血再灌注损伤病理生理方面的贡献和作用。国外研究报道关于心肌细胞 （Sun HY, Wang NP, Halkos M, et al. Postconditioning attenuates cardiomyocyte apoptosis via inhibition of JNK and p38 mitogen-activated protein kinase。
12、 signaling pathways. Apoptosis. 2006; 11: 1583-93） （Sun HY, Wang NP, Kerendi F, et al. Hypoxic postconditioning reduces cardiomyocyte loss by inhibiting ROS generation and intracellular Ca2+ overload. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2005; 288: H1900-8） （Wang HC, Zhang HF, Guo WY, et al. Hypoxic pos。
13、tconditioning enhances the survival and inhibits apoptosis of cardiomyocytes following reoxygenation: role of peroxynitrite formation. Apoptosis. 2006; 11: 1453-60.） 单纯缺氧后处理 模型的应用， 其缺点是单纯考虑缺氧复氧导致的损伤， 不能模拟缺血再灌注损伤过程中除 缺氧外还有 PH 值、 二氧化碳分压、 血清、 糖等能量供给， 因而不能全面模拟体内缺血过程， 更不能较好模拟后处理过程中各种养分的缓慢恢复的过程。 关于肾小管上皮细胞。
14、缺血再灌 注损伤的细胞模型， 已有国外学者实现 （Sauvant C, Schneider R, Holzinger H, et al. Implementation of an in vitro Model System for Investigation of Reperfusion Damage after Renal Ischemia J. Cellular Physiology and Biochemistry, 2009,24:567-576.） ， 但是在此基础上的缺血后处理细胞模型， 国内外暂无相关报道。近年 来， 国内外学者都在积极寻求发展一种模拟肾脏缺血后处理的体外细胞模型。
15、， 这个模型可 以让科学家在没有混杂因素影响的情况下研究肾小管上皮细胞缺血后处理的保护机制。 此 模型同样适用于其它易受缺血再灌注损伤器官如肝、 脑及心的相应细胞系的研究。 发明内容 0007 本发明所要解决的技术问题在于提供一种大鼠肾小管上皮细胞缺血后处理的细 胞模型的建立方法， 该细胞模型适用于所有关于大鼠缺血后处理对再灌注损伤的研究， 能 清楚的显示在细胞水平下特定处理对于缺血再灌注损伤的直接作用与影响。 0008 为了实现上述目的， 本发明采用以下技术方案。 0009 一种大鼠肾小管上皮细胞缺血后处理的细胞模型的建立方法， 是通过二氧化碳培 养箱、 三气培养箱、 完全培养液、 对照缓冲。
16、液、 缺血缓冲液、 CO2及 N2模拟动物体内实验的缺 血后处理过程， 依次包括如下步骤 ： （1） 接种于 35mm 规格的培养皿的 NRK-52E 细胞同步化 24h 后， 将培养皿中的液体更换 为缺血缓冲液并置于含 0.5% O2和 5% CO2的三气培养箱中， 于饱和湿度、 37培养 3 小时， 模拟缺血过程 ； （2） 向培养皿中添加 0.5ml 新鲜的完全培养液， 置于二氧化碳培养箱 （空气氧浓度、 5% CO2、 饱和湿度、 37） 中培养 10min， 模拟再灌注过程 ； 再将培养皿置于三气培养箱 （0.5% O2、 5% CO2、 饱和湿度、 37） 中培养 10min， 模。
17、拟缺氧过程 ； 此 20min 为一个循环， 记为 HP1 组， 完成两个循环记为 HP2 组， 完成三个循环记为 HP3 组 ； 说 明 书 CN 102943062 A 4 3/5 页 5 （3） 最后培养皿中的液体更换为完全培养液 2mL 在二氧化碳培养箱中 （空气氧浓度、 5% CO2、 饱和湿度、 37） 培养至指定的时间点， 以完成整个缺血后处理的细胞模型。 0010 在本发明的一个优选方案中， 在每个再灌注开始之前， 保留原有的缺血缓冲液， 在 此基础上加入 0.5mL（少于原有缺血缓冲液） 的新鲜完全培养液， 使缺血缓冲液缓慢变换为 接近正常的完全培养液。 0011 在本发明的。
18、一个优选方案中， 缺血缓冲液应用 bicarbonateMES 缓冲的林格 氏液， 每 1L 中含有 NaHCO3 0.378g， Na2HPO4 0.114g， NaH2PO4 0.024g， NaCl 6.201g， KCl 0.402g， CaCl2 0.133g， MgCl2 0.076g， MES3.9g， 用 1 mmol/L 的 NaOH 调整 pH 至 6.6。 0012 本发明与现有的动物模型技术相比具有以下优点和效果 ： 1、 更加精确的模拟缺血后处理的微环境 ； 2、 造模速度快， 缺血后处理三个循环的时间为一个小时， 加上模拟缺血的时间三小时， 整个缺血及后处理的时间仅。
19、为四个小时 ； 3、 方法步骤简单， 易于操作 ； 4、 可同时进行高层次的机制研究 ； 5、 可同样适用于其它易受缺血再灌注损伤器官的细胞水平研究。 附图说明 0013 图 1 Hoechst 检测结果， 其中 A ： 正常组 ， B ： 缺血再灌注组 ， C ： 缺血后 处理组。 0014 图 2 BAX、 BCL-2 的 western 表达结果。 0015 图 3 Cleaved-Caspase3、 Caspase-3、 Caspase-8 的 western 表达结果。 具体实施方式 0016 下面结合具体实施例， 进一步阐述本发明。 应当理解， 这些实施例仅用于说明本发 明而不用于。
20、限制本发明要求保护的范围， 下列实施例中未注明具体实验条件和方法， 通常 按照常规条件如 ： D.L. 斯佩克特等， 科学出版社， 2001， 细胞实验指南。 0017 实施例 1 大鼠肾小管上皮细胞缺血后处理细胞模型所需条件的组成 A). 仪器及耗材 ： 二氧化碳培养箱 （Thermo Forma） 、 三气培养箱 （长沙华曦电子科技有 限公司） 、 培养瓶 （表面积 25cm2， Costar） 、 培养皿 （直径 35mm， Costar） B). 试剂组成 ： 胎牛血清 （赛默飞世尔生物化学制品有限公司） 、 DMEM高糖培养基 （杭州 吉诺生物医药技术有限公司） 、 青链霉素 （杭州。
21、吉诺生物医药技术有限公司） 、 凋亡检测试剂 盒 （联科生物） 、 Hoechst 33258（碧云天） 、 Caspase-3 抗体 （Cell Signaling Technology） 、 Caspase-8抗体 （Cell Signaling Technology） 、 Cleaved-Caspase-3抗体 （Cell Signaling Technology） 、 BAX 抗 体 （Cell Signaling Technology） 、 BCL -2 抗 体 （Cell Signaling Technology） ； C). 实验细胞 ： 大鼠肾小管上皮细胞株 （NRK-52E）。
22、 来自于中国科学院上海生命科学研 究院细胞资源中心。 0018 D). 对照缓冲液 ： bicarbonateHEPES 缓冲的林格氏液， 每 1L 中含有 NaHCO3 2.016g， Na2HPO4 0.114g， NaH2PO4 0.024g， NaCl 5.06g， KCl 0.402g， CaCl2 0.133g， MgCl2 说 明 书 CN 102943062 A 5 4/5 页 6 0.076g， HEPES 4.76g， Glucose0.9g， 用 1 mmol/L 的 NaOH 调整 pH 至 7.4， 在 37、 正常氧分 压下保存。 0019 E). 缺血缓冲液 ： 。
23、bicarbonateMES 缓冲的林格氏液， 每 1L 中含有 NaHCO3 0.378g， Na2HPO4 0.114g， NaH2PO4 0.024g， NaCl 6.201g， KCl 0.402g， CaCl2 0.133g， MgCl2 0.076g， MES3.9g， 用 1 mmol/L 的 NaOH 调整 pH 至 6.6， 在 37、 低于 1%O2的条件下保存。 0020 F). 自备试剂及气体 ： PBS、 氮气、 二氧化碳。 0021 G). 实验分组 ： 正常组， 缺血再灌注组， 后处理组 1， 后处理组 2， 后处理组 3。 0022 实施例 2 用大鼠肾小管上皮。
24、细胞缺血后处理细胞模型观察后处理对再灌注损伤 的保护效果。 0023 A).NRK-52E 培养于培养瓶中， 待细胞长到一定数量后平均接种于培养皿， 实验前 用无血清培养液培养 24h， 使细胞同步化， 然后将细胞培养皿随机分为 5 组 ： 正常组， 缺血再 灌注组， 后处理组 1（HP1） ， 后处理组 2（HP2） ， 后处理组 3（HP3） 。 0024 B). 正常组 ： 同步化 24h 后换对照缓冲液 1mL， 3h 后再次更换完全培养液 1mL， 后 常规培养 24h。 0025 C). 缺血再灌注组 ： 同步化 24h 后， 用 pH 7.4 的无血清 DMEM 培养液 1mL 。
25、冲洗已汇 合成片的大鼠肾小管上皮细胞， 接着用 pH 7.4 的无糖 DMEM 培养液 1mL 冲洗细胞， 再用无血 清、 无糖的缺血培养液 1mL 在缺氧条件下 （0.5%O2+5 C02+94.5 N2、 37） 培养 3h， 再灌注 时换用完全培养液 1mL， 在正常条件下 （5 CO2+95空气、 37） 培养至指定的时间点。 0026 D). 缺血后处理组 ： 同步化 24h 后， 更换缺血缓冲液 1mL， 并在缺氧条件下 （0.5% 的 O2、 5% 的 CO2、 饱和湿度） 条件下培养 3h。然后添加 0.5ml 新鲜的完全培养液， 在正常条 件下 （空气氧浓度、 5%CO2、 。
26、饱和湿度、 37） 培养 10min， 模拟再灌注环境， 再在缺血条件下 （0.5% 的 O2、 5% 的 CO2、 饱和湿度） 培养 10min， 模拟缺氧环境， 此 20min 为一个循环， 记为 HP1 组， 若完成两个循环记为 HP2 组， 三个循环记为 HP3 组。最后添加完全培养液 2mL 在正常条 件下 （空气氧浓度、 5%CO2、 饱和湿度、 37） 培养至指定的时间点。 0027 E). 培养结束后， 用流式细胞仪、 hoechst 检测细胞凋亡， Western Blot 检测凋亡 相关基因 BCL-2、 BAX、 Cleaved-Caspase 3、 Caspase 3、。
27、 Caspase 8。 0028 流式细胞仪检测 4 次， 检测结果见表 1。SPSS17.0 统计分析显示， 正常组与缺血再 灌注组、 HP1 组相比， 差异有统计学意义，P 0.05。缺血再灌注组与 HP1 组、 HP2 组、 HP3 组相比， 差异有统计学意义，P 0.05。HP1、 HP2、 HP3 三组相比， HP3 凋亡率显著低于 HP1， P 0.05。说明三个循环的后处理对于缺血再灌注损伤的保护效果较好。 0029 表 1 流式细胞仪检测凋亡结果 分组检测 1 检测 2 检测 3 检测 4 正常组4.5%12.0% 10.0% 8.9% 缺血再灌注组 *37.2% 23.1% 。
28、27.7% 28.6% HP1 组 *#20.1% 21.1% 17.3% 21.3% HP2 组 #13.1% 9.8%15.0% 14.0% HP3 组 # 10.2% 8.9%11.3% 9.5% * ：P 0.05 vs 正常组 # ：P 0.05 vs 缺血再灌注组 ：P 0.05 vs HP1 组 说 明 书 CN 102943062 A 6 5/5 页 7 Hoechst 结果显示， 与正常组相比， 缺血再灌注组与缺血后处理组的凋亡细胞数量增 多 ； 同时， 缺血后处理组与缺血再灌注组相比， 凋亡细胞数量明显降低， 如图 1 所示。 0030 Western Blot 的结果见图 2 和图 3。结果显示缺血后处理组 BAX、 Caspase-3、 Caspase-8 表达明显低于再灌注损伤组 ； 同时缺血后处理组 BCL-2 表达强于再灌注损伤组。 说明缺血后处理组的凋亡较缺血再灌注损伤组轻， 同时有可能通过降低BAX /BCL-2基因表 达的比值实现。 0031 从以上结果可知， 后处理组与缺血再灌注组相比， 能够显著减轻缺血再灌注损伤 产生的细胞凋亡， 且 HP3 组的保护效果最好。 说 明 书 CN 102943062 A 7 1/1 页 8 图 1 图 2 图 3 说 明 书 附 图 CN 102943062 A 8 。