六六六农药残留降解菌及其生产的菌剂 一、技术领域
本发明一株六六六(HCH)农药残留降解菌及其生产的菌剂，属于生物高技术领域，是利用微生物的方法降解化学农药残留，适用于环境污染的治理和现代农业生产中绿色无公害农产品的生产与加工。
二、技术背景
六六六是有机氯农药的一种，是40年代中期出现的有机合成杀虫剂，由于它价廉，广谱，对农、林、牧、毛纺、储粮、卫生等害虫均有效，使用安全，从而得到广泛应用。自1962年发现它有残毒及污染环境后，1970年至今，绝大多数国家已宣布禁用，我国已于1983年4月1日起停止生产。90年代以后，六六六在农业上的使用仅限于印度等少数国家，但作为防治卫生害虫的有效化学药剂，目前在热带地区的一些国家仍然得以广泛施用，由此导致新六六六污染。
在有机氯农药曾经广泛使用的30年来，我国累计施用六六六约490万吨，平均每亩耕地投放六六六为2~3千克。同期，国际上累计用量分别为113万吨，我国六六六的总用量比国际上多3倍以上。六六六不易分解，难溶于水，能耐热耐酸，溶于脂肪和有机溶剂，因而在地上、水和物体中的残留时间长。甲体六六六在土壤中的半衰期为26年，丙体六六六为18年，乙体六六六是造成土壤污染的主要物，毒性最强，且在旱地中的持留量远高于水稻田。并且由于它们的衍生物、代谢物在环境中保持时间也特别长和疏水亲脂特性，因而在生物的每个营养级上都会发生富集作用。在人的母体中的有机氯农药不仅可以通过乳汁喂养间接转移给新生儿，而且可以通过胎盘进入胎儿体内，引起下一代发生慢性中毒。而有机氯农药长期蓄积于脂肪导致组织器官中不易被分解或排出，故随着体内蓄积量地增加，对人类的潜在威胁将愈大。
有机氯农药的残留以及对环境的污染，已严重危害着人类的健康。但目前对于已经施用过六六六的环境的综合治理，一直未见有比较成熟的技术。
三、发明内容
技术问题 本发明的目的在于针对生产实践中的实际问题和需求，开发研制出一种新型的农药残留降解菌剂，使用本菌剂可以使六六六农药的残留量降低99％以上，且费用较低。使用该降解菌剂既可以消除环境中特别是土壤中六六六农药的污染，又可在农作物的正常生长过程中正常使用六六六农药进行病虫害的防治，从而保证农产品中六六六农药残留含量符合绿色食品要求。
技术方案 下面为本发明的主要内容：
一株六六六(HCH)农药残留降解菌，其特征在于该微生物是革兰氏染色阴性的Sphingomonas sp.的菌株BHC-A，2004年9月22日寄存于中国微生物菌种保存管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为CGMCC NO.1223，经鉴定为鞘氨醇单胞菌Sphingomonas sp.，主要生物学特性为兼性好氧，有极生鞭毛，G-，直或弯杆菌，具有过氧化氢酶和氧化酶活性，V.P.反应为阳性，甲基红反应为阴性，产黄色色素，菌体周围产荚膜，能利用葡萄糖、甘氨酸和果糖氧化产酸，BHC-A菌株能以六六六的α-、β-、γ-、δ-四种异构体为唯一碳源和能源进行生长，在实验室条件下对六六六的降解率达99％以上。
用上述的六六六(HCH)农药残留降解菌生产的降解菌剂，是通过以下方法生产而成：
1.将试管种接种于发酵培养基中，振荡培养至对数期；
2.将上述培养好的菌种按1％的接种量接种入500升种子罐，培养至对数生长期，种子罐所用的培养基配方为：葡萄糖质量比为0.1％，NaCl1.0％，蛋白胨0.5％，酵母膏0.25％，pH7.2-7.5；
3.将种子液按10％的接种量接入生产罐培养，生产罐所用培养基与种子罐培养基相同；
在种子罐和生产罐的培养过程中无菌空气的通气量为1∶0.6-1.2，搅拌速度为180-240转/分，培养温度为30℃，全流程培养时间为48-60小时，发酵结束后菌体数量达到10亿个/ml以上，发酵完成后培养液出罐直接用塑料包装桶或包装瓶分装成液体剂。
有益效果 本发明提供一种消除六六六(HCH)农药α-、β-、γ-、δ(甲体、乙体、丙体、丁体)四种异构体残留的降解菌剂， BHC-A菌株能以六六六(HCH)为唯一碳源和能源进行生长，并可在短时间内完全高效降解α-、β-、γ-、δ-HCH四种异构体。β-异构体的有氧生物降解一直是世界环境污染物微生物降解研究的难题。BHC-A对β-异构体具有高效降解效率，可以在12小时内完全矿化5mg/L的β-异构体。
使用该发明生产的农药残留降解菌剂具有生产成本低，使用方便，去除效果好的优点，适合治理环境中六六六造成的污染和在全国粮油蔬菜生产出口基地或有绿色食品商标标志的地方大面积推广使用。本发明对于保护生态环境，保护人民的身体健康，提高农产品的附加值具有重要的意义。降解菌BHC-A能使六六六农药的残留量降低99％以上，降低了生产和使用过程中的工作量，使生产和使用成本降低。使用该降解菌剂既可以消除环境中特别是土壤中六六六农药的污染，又可在农作物的正常生长过程中正常使用六六六农药进行病虫害的防治，从而保证农产品中六六六农药残留含量符合绿色食品要求。并且该菌为革兰氏阴性菌，在田间的存活时间适当，不会影响以后农药使用效果。
降解菌产品直接施用可使土壤中农药六六六残留量降低95％以上，能够有效地消除土壤污染，缓解植株受药害症状，解决了农业生产中农药六六六残留超标问题，可生产出无毒无公害的绿色农产品。该降解菌剂可以用发酵工业通用发酵设备进行生产。本发明成功的解决了环境中特别是土壤中农药六六六农药的残留超标问题，既充分发挥化学农药六六六在植物病虫害防治中的高效快速的作用，生产出无毒无公害的绿色农产品，又可以修复环境中六六六农药的污染。
四、附图说明
图1 BHC-A菌落照片和电镜照片
图2 接种量对BHC-A降解六六六的影响
图3 初始pH对BHC-A降解六六六的影响
图4 温度对BHC-A降解六六六的影响
图5 通气量对BHC-A降解六六六的影响
图6 β-HCH对照与处理不同时间取样气相测定色谱图
a-β-HCH对照 b-4小时取样 c-12小时取样 d-20小时取样
图7 BHC-A菌株在黄瓜上的施用15天后效果图
五、具体实施方式
1 菌株的分离和鉴定
取污染土壤10g，置于100ml的无菌水中，振荡5分钟，即为土壤菌悬液。取5ml的菌悬液，加入到100ml的无机盐培养基中，添加HCH作为唯一碳源，于30℃，180rpm摇床培养获得富集液，连续稀释涂布添加HCH的LB平板，于是我们得到一株能在培养基上生长并降解HCH的菌(见图1)，命名为BHC-A，该菌经多次转接后，进一步纯化并鉴定为鞘氨醇单胞菌Sphingomonas sp.。其主要生物学特性为：兼性好氧，有极生鞭毛，G-，直或弯杆菌，具有过氧化氢酶和氧化酶活性，V.P.反应为阳性，甲基红反应为阴性，产黄色色素，菌体周围产荚膜，能利用葡萄糖、甘氨酸和果糖氧化产酸。BHC-A菌株能以六六六(HCH)为唯一碳源和能源进行生长，并可完全降解α-、β-、γ-、δ-HCH四种异构体。在实验室条件下对六六六的降解率达99％以上。该菌可以用发酵工业通用发酵设备进行生产。
2 实验室生物降解实验
2.1 接种量对BHC-A菌株降解HCH的影响
BHC-A在SM中培养至对数期，以2％、5％、10％、15％的接种量接入HCH为10mg/L的基础盐培养基中，30℃、180rpm摇床振荡培养，按一定的培养时间取样，立即用正己烷提取，气谱测定。如图2：2小时测定结果显示，2％、5％、10％、15％接种量的降解率分别为74.8％，99.1％，99.8％，100％，接种量越大，BHC-A降解γ-HCH的速率就越快。
2.2 初始pH对BHC-A菌株降解γ-HCH的影响
BHC-A在SM中培养至对数期以2％的接种量接入初始pH为4.0，5.0，6.0，7.0，8.0 HCH为10mg/L的基础盐培养基中，30℃，180rpm摇床振荡培养，按一定的培养时间，隔2小时、6小时、12小时用无菌移液管取样，立即用正己烷提取，气谱测定。如图3：2小时测定结果显示：初始pH越高，BHC-A降解HCH的速率越快。当培养基初始pH为4时，BHC-A对HCH的降解率即使经过12小时也只有46％。这可能是因为HCH在酸性条件下很稳性，而BHC-A在pH小于5时生物增长量小，从而抑制了它的降解能力。
2.3 温度对BHC-A菌株降解HCH的影响
BHC-A在SM中培养至对数期，以2％的接种量接入HCH为10mg/L的基础盐培养基中，分别于25℃、30℃、37℃、40℃，180rpm摇床振荡培养，按一定的培养时间取样，立刻用正己烷提取，气谱测定培养基中残余的γ-HCH。如图4所示：2小时后测定结果显示，20℃时，BHC-A对的降解率为44.2％；在20~30℃范围内，随着温度的升高BHC-A的降解性能明显上升；在30℃时，降解能力最强。
2.4 通气量对BHC-A菌株降解γ-HCH的影响
BHC-A在SM中培养至对数期，以2％的接种量接入250mL分别装有30，50，70，100，120，150mL基础盐培养基的三角瓶中，HCH终浓度为10mg/L，30℃、180rpm摇床振荡培养，按一定的培养时间，用无菌移液管取样，立即用正己烷提取，气谱测定。如图5：2小时测定结果显示，70mL装液量的降解率最低，只有66％，其他的都在70％以上。装液量不同对BHC-A降解γ-HCH速率的影响不大。
2.5 BHC-A菌株对β-HCH的降解
BHC-A菌株在SM中培养至对数期，以2％的接种量接入到β-HCH为5mg/L的无机盐培养基中，30℃、180rpm摇床振荡培养，每隔2小时取一次样，立即用正己烷提取后，取1μL气谱测定培养基中残留的β-HCH。测定结果如图6。从图中可以看出，BHC-A菌株能够降解β-HCH，12小时内，培养基中5mg/L的β-HCH全部被降解。在降解的2~12小时过程中，气相色谱图上一直有一个显著的产物色谱峰出现(RTβ-HCH＝2.232min；RT产物＝3.632min)(如图7a、b、c、d)，12小时以内，随着培养基中β-HCH的减少该产物的峰面积逐渐增加，到12小时时峰面积值达到最高，然后随着时间的延长该峰渐渐消失。对此产物结构的鉴定还有待于进一步研究。国内外有关于微生物对β-HCH的降解的报道很少，这是由于在六六六的四种异构体中，β-HCH具有独特的化学结构，它的化学性质最稳定，半衰期最长，毒性也最大。BHC-A菌株能够完全矿化β-HCH，对菌体本身而言，降解途径是独特的；对于环境中六六六污染的修复具有重要的理论和实践意义。
3 BHC-A菌株在土壤中对六六六的降解试验
从校园里采取菜园土作为供试土样。将土样过2-mm筛，取一定量的γ-HCH及六六六粉剂分别溶于10ml丙酮中，然后浸泡硅藻土，使农药被完全吸附。浸泡后的硅藻土置于通风橱中吹干，将其拌入土壤中，使土壤中γ-HCH的浓度为10mg/kg，六六六粉剂的理论浓度为30mg/kg。新鲜的BHC-A培养液5,000rpm离心5min后，收集菌体，用无菌去离子水洗涤3次后再用无菌水悬浮，以10％的接种量接入到上述两种土样中。每一种土样各取30g于30℃恒温培养箱中培养，不接菌的作为对照，期间土壤的持水量保持在60％。培养7天后，GC测定残留量。土壤中残留的γ-HCH及六六六总量的检测方法参照前面所述。测定结果如表1。
从表1可以得出，在实验室条件下，经过7天的培养后，BHC-A对10mg/Lγ-HCH的降解率达到96.9％，对α-HCH、β-HCH、δ-HCH的降解率分别为90.1％，80.7％和88.6％。以上结果说明，BHC-A菌株在施入土壤中后，没有出现不产生降解作用或降解率急剧下降的现象，它的降解性能仍然稳定和优良，这就为BHC-A菌株作为受六六六污染的土壤修复剂提供了科学的试验依据。
表1 BHC-A菌株在土壤中对六六六异构体的降解
土壤中六六六异
构体的残留量 CK 处理 降解率
/mg/kg
0.04007±
α-HCH 0.4067±0.04440 90.1％
0.02259
β-HCH 0.5715±0.3515 0.1101±0.04445 80.7％
γ-HCH 7.197±0.1267 0.2245±0.1129 96.9％
δ-HCH 0.8867±0.1207 0.1006±0.05562 88.6％
4 BHC-A菌株用于黄瓜上的盆栽试验
选择籽粒饱满均匀的黄瓜种子(蔬春牌津研四号)，先在室温下用水浸泡12小时，然后在30℃催芽12小时。
称取30mg的六六六农药，溶于10mL的丙酮中，然后浸泡5.0g的硅藻土，使农药被完全吸附。浸泡后的硅藻土置于通风橱中吹干，将其拌入1000g的过筛风干土中，理论上六六六总量的浓度为30mg/kg。将处理好的土样置于花盆中，空白对照不加六六六农药，浇足水后放置36小时待用。共设添加菌液(BHC-A1，BHC-A2，BHC-A3)，不加菌液(CK1，CK2，CK3)和空白对照(空1，空2，空3)三个处理。在每个花盆中播种已发芽的黄瓜种子10粒，在BHC-A1，BHC-A2，BHC-A3处理中加入20mL新鲜的BHC-A培养液，其他的处理则加20mL的水补齐，置于室外培养。于15天拍照看黄瓜生长情况，并于15天时取样测定土壤中残留的六六六农药的量。从表2中可以看出，与不加菌液的CK相比，在BHC-A花盆中添加菌液后，经过半月后，土壤中的六六六已降为0.33mg/kg，降解率达到84.3％。
表2 15天后BHC-A菌株对土壤中六六六总量的降解
CK BHC-A 空白 降解率
土壤中残留
2.099± 0.3309±
的六六六 0 84.3％
0.1872 0.1579
/mg/kg
从图7a中可以看出，不施加BHC-A菌液的CK中黄瓜秧苗产生严重的六六六药害，生长受到明显抑制。叶片墨绿，小而且卷曲，伸展度少，植株矮小瘦弱，从茎底部产生黄色枯斑，逐渐萎缩，严重的到15天后甚至死亡。而施加了BHC-A菌液的盆钵中，黄瓜植株健壮生长，茎直立而叶片完全伸展，这说明施用BHC-A菌液能够消除污染土壤中的六六六农药，可以有效地缓解植株受害的症状。从15天的空白处理中和施加BHC-A菌液处理中的黄瓜生长照片(图7b)相比较而言，施加BHC-A菌液的处理长势略好，说明BHC-A菌株对黄瓜植株没有不利生长的影响。
使用上述六六六农药残留降解菌生产菌剂的工艺为：斜面种一摇瓶种子液一种子罐一产品(包装剂型为液体菌剂)。
本发明的详细实施步骤为：
1)将试管种接种于发酵培养基中，振荡培养至对数期；
2)将上述培养好的菌种按10％的接种量接种入500升种子罐，培养至对数生长期，种子罐所用的培养基配方为：葡萄糖0.1％(质量比，下文同)，蛋白胨0.5％，酵母膏0.25％，pH7.2-7.5；
3)将种子液按10％的接种量接入生产罐培养，生产罐所用培养基与种子罐培养基相同；
4)在种子罐和生产罐的培养过程中无菌空气的通气量为1∶0.6-1.2，搅拌速度为180-240转/分，培养温度为30℃，全流程培养时间为48-60小时，发酵结束后菌体数量达到10亿个/ml以上，发酵完成后培养液出罐直接用塑料包装桶或包装瓶分装成液体剂。
降解菌产品直接施用可使土壤中农药六六六残留量降低95％以上，能够有效地消除土壤污染，缓解植株受药害症状，解决了农业生产中农药六六六残留超标问题，可生产出无毒无公害的绿色农产品。该降解菌剂可以用发酵工业通用发酵设备进行生产。