KRAS引物和探针.pdf

1、(10)申请公布号 CN 102869790 A (43)申请公布日 2013.01.09 CN 102869790 A *CN102869790A* (21)申请号 201180021900.9 (22)申请日 2011.04.12 61/323,114 2010.04.12 US C12Q 1/68(2006.01) (71)申请人 反应遗传有限公司 地址 美国加利福尼亚州 (72)发明人 C斯蒂芬斯 (74)专利代理机构 北京泛华伟业知识产权代理 有限公司 11280 代理人 刘丹妮 (54) 发明名称 KRAS 引物和探针 (57) 摘要 本发明提供用于检测 KRAS 基因的突变的寡

2、核苷酸引物或探针。本发明还提供一种用于使用 本发明中所公开的寡核苷酸引物或探针来检测 KRAS 基因中的突变的方法。此外， 本发明涵盖一 种用于预测患者体内的肿瘤对表皮生长因子受体 定向化疗的敏感度的方法， 所述方法包括 ： 从所 述肿瘤获取 DNA ； 以及使用一种利用本发明的寡 核苷酸引物和 / 或探针中的至少一种的方法来测 定所述DNA中的KRAS基因的外显子2中的密码子 12 是否存在突变和 / 或密码子 13 是否存在突变。 (30)优先权数据 (85)PCT申请进入国家阶段日 2012.10.30 (86)PCT申请的申请数据 PCT/US2011/032108 2011.04.1

3、2 (87)PCT申请的公布数据 WO2011/130265 EN 2011.10.20 (51)Int.Cl. 权利要求书 8 页 说明书 15 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 8 页 说明书 15 页 1/8 页 2 1. 一种寡核苷酸， 其选自 ： (a)由核苷酸序列 ： GTCAAGGCACTCTTGCCTAAGT(SEQ ID NO:1)组成的寡核苷酸或与所述 寡核苷酸大致上相同的寡核苷酸 ； (b)由核苷酸序列 ： GGCCTGCTGAAAATGACTGA(SEQ ID NO:2)组成的寡核苷酸或与所述寡 核苷酸大致上相同的寡核苷酸 ；

4、(c) 由核苷酸序列 ： 6FAM-CAACTACCACAAGTTT(SEQ ID NO:3) 组成的标记的寡核苷酸或 与所述标记的寡核苷酸大致上相同的寡核苷酸 ； (d)由核苷酸序列 ： AGGCACTCTTGCCTCCGT(SEQ ID NO:4)组成的寡核苷酸或与所述寡核 苷酸大致上相同的寡核苷酸 ； (e) 由核苷酸序列 ： GCCTGCTGAAAATGACTGAATAT(SEQ ID NO:5) 组成的寡核苷酸或与所 述寡核苷酸大致上相同的寡核苷酸 ； (f) 由核苷酸序列 ： 6FAM-CTCCAACTACCACAAGTT(SEQ ID NO:6) 组成的标记的寡核苷酸 或与所述标

5、记的寡核苷酸大致上相同的寡核苷酸 ； (g) 由核苷酸序列 ： CTTGTGGTAGTTGGAGCTGGTAA(SEQ ID NO:7) 组成的寡核苷酸或与所 述寡核苷酸大致上相同的寡核苷酸 ； (h)由核苷酸序列 ： AATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCTTT(SEQ ID NO:8)组成的寡核苷酸或 与所述寡核苷酸大致上相同的寡核苷酸 ； (i) 由核苷酸序列 ： GAATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCTAT(SEQ ID NO:9) 组成的寡核苷酸 或与所述寡核苷酸大致上相同的寡核苷酸 ； (j) 由核苷酸序列 ： TATAAACTTGTGGTAGTTGGAG

6、GTGT(SEQ ID NO:10) 组成的寡核苷酸或 与所述寡核苷酸大致上相同的寡核苷酸 ； (k) 由核苷酸序列 ： TGAAGATGTACCTATGGTCCTAGTAGGA(SEQ ID NO:11) 组成的寡核苷酸 或与所述寡核苷酸大致上相同的寡核苷酸 ； (l)由核苷酸序列 ： GTCCTGAGCCTGTTTTGTGTCTA(SEQ ID NO:12)组成的寡核苷酸或与所 述寡核苷酸大致上相同的寡核苷酸 ； (m)由核苷酸序列 ： 6FAM-TAGAAGGCAAATCACA(SEQ ID NO:13)组成的标记的寡核苷酸或 与所述标记的寡核苷酸大致上相同的寡核苷酸 ； (n)由核苷酸

7、序列 ： TGAATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGATA(SEQ ID NO:14)组成的寡核苷酸 或与所述寡核苷酸大致上相同的寡核苷酸 ； (o)由核苷酸序列 ： AATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGGTC(SEQ ID NO:15)组成的寡核苷酸或 与所述寡核苷酸大致上相同的寡核苷酸 ； (p)由核苷酸序列 ： TGAATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGTTT(SEQ ID NO:16)组成的寡核苷酸 或与所述寡核苷酸大致上相同的寡核苷酸 ； (q)由核苷酸序列 ： AAACTTGTGGTAGTTGGAGCAGA(SEQ ID NO:17)组成的寡核苷酸或

8、与所 述寡核苷酸大致上相同的寡核苷酸 ； (r) 由核苷酸序列 ： AACTTGTGGTAGTTGGAGCAGC(SEQ ID NO:18) 组成的寡核苷酸或与所 述寡核苷酸大致上相同的寡核苷酸 ； (s) 由核苷酸序列 ： CACAAAATGATTCTGAATTAGCTGTATC(SEQ ID NO:19) 组成的寡核苷酸 或与所述寡核苷酸大致上相同的寡核苷酸 ； 以及 权 利 要 求 书 CN 102869790 A 2 2/8 页 3 (t) 由核苷酸序列 ： 6FAM-TCAAGGCACTCTTGCCT(SEQ ID NO:20) 组成的标记的寡核苷酸 或与所述标记的寡核苷酸大致上相同

9、的寡核苷酸。 2. 如权利要求 1 所述的寡核苷酸， 其选自 ： 由核苷酸序列 ： GTCAAGGCACTCTTGCCTAAGT(SEQ ID NO:1) 组成的寡核苷酸或与所述寡 核苷酸大致上相同的寡核苷酸 ； 由核苷酸序列 ： GGCCTGCTGAAAATGACTGA(SEQ ID NO:2) 组成的寡核苷酸或与所述寡核 苷酸大致上相同的寡核苷酸 ； 由核苷酸序列 ： AGGCACTCTTGCCTCCGT(SEQ ID NO:4) 组成的寡核苷酸或与所述寡核苷 酸大致上相同的寡核苷酸 ； 由核苷酸序列 ： GCCTGCTGAAAATGACTGAATAT(SEQ ID NO:5)组成的寡核苷

10、酸或与所述寡 核苷酸大致上相同的寡核苷酸 ； 由核苷酸序列 ： CTTGTGGTAGTTGGAGCTGGTAA(SEQ ID NO:7)组成的寡核苷酸或与所述寡 核苷酸大致上相同的寡核苷酸 ； 由核苷酸序列 ： AATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCTTT(SEQ ID NO:8) 组成的寡核苷酸或与 所述寡核苷酸大致上相同的寡核苷酸 ； 由核苷酸序列 ： GAATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCTAT(SEQ ID NO:9)组成的寡核苷酸或与 所述寡核苷酸大致上相同的寡核苷酸 ； 由核苷酸序列 ： TATAAAC TTGTGGTAGTTGGAGGTGT(SEQ ID

11、 NO:10) 组成的寡核苷酸或与 所述寡核苷酸大致上相同的寡核苷酸 ； 由核苷酸序列 ： TGAAGATGTACCTATGGTCCTAGTAGGA(SEQ ID NO:11)组成的寡核苷酸或与 所述寡核苷酸大致上相同的寡核苷酸 ； 由核苷酸序列 ： GTCCTGAGCCTGTTTTGTGTCTA(SEQ ID NO:12) 组成的寡核苷酸或与所述 寡核苷酸大致上相同的寡核苷酸 ； 由核苷酸序列 ： TGAATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGATA(SEQ ID NO:14) 组成的寡核苷酸或 与所述寡核苷酸大致上相同的寡核苷酸 ； 由核苷酸序列 ： AATATAAACTTGTGGT

12、AGTTGGAGGTC(SEQ ID NO:15) 组成的寡核苷酸或与 所述寡核苷酸大致上相同的寡核苷酸 ； 由核苷酸序列 ： TGAATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGTTT(SEQ ID NO:16) 组成的寡核苷酸或 与所述寡核苷酸大致上相同的寡核苷酸 ； 由核苷酸序列 ： AAACTTGTGGTAGTTGGAGCAGA(SEQ ID NO:17) 组成的寡核苷酸或与所述 寡核苷酸大致上相同的寡核苷酸 ； 由核苷酸序列 ： AACTTGTGGTAGTTGGAGCAGC(SEQ ID NO:18)组成的寡核苷酸或与所述寡 核苷酸大致上相同的寡核苷酸 ； 以及 由核苷酸序列 ： C

13、ACAAAATGATTCTGAATTAGCTGTATC(SEQ ID NO:19)组成的寡核苷酸或与 所述寡核苷酸大致上相同的寡核苷酸。 3. 如权利要求 2 所述的寡核苷酸， 其选自 ： 由核苷酸序列 ： GTCAAGGCACTCTTGCCTAAGT(SEQ ID NO:1) 组成的寡核苷酸或与所述寡 核苷酸大致上相同的寡核苷酸 ； 由核苷酸序列 ： AGGCACTCTTGCCTCCGT(SEQ ID NO:4) 组成的寡核苷酸或与所述寡核苷 权 利 要 求 书 CN 102869790 A 3 3/8 页 4 酸大致上相同的寡核苷酸 ； 以及 由核苷酸序列 ： CTTGTGGTAGTTGG

14、AGCTGGTAA(SEQ ID NO:7)组成的寡核苷酸或与所述寡 核苷酸大致上相同的寡核苷酸。 4. 如权利要求 2 所述的寡核苷酸， 其选自 ： 由核苷酸序列 ： GGCCTGCTGAAAATGACTGA(SEQ ID NO:2) 组成的寡核苷酸或与所述寡核 苷酸大致上相同的寡核苷酸 ； 以及 由核苷酸序列 ： GCCTGCTGAAAATGACTGAATAT(SEQ ID NO:5)组成的寡核苷酸或与所述寡 核苷酸大致上相同的寡核苷酸。 5. 如权利要求 2 所述的寡核苷酸， 其选自 ： 由核苷酸序列 ： AATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCTTT(SEQ ID NO:8)

15、 组成的寡核苷酸或与 所述寡核苷酸大致上相同的寡核苷酸 ； 由核苷酸序列 ： TGAATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGATA(SEQ ID NO:14) 组成的寡核苷酸或 与所述寡核苷酸大致上相同的寡核苷酸 ； 由核苷酸序列 ： AATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGGTC(SEQ ID NO:15) 组成的寡核苷酸或与 所述寡核苷酸大致上相同的寡核苷酸 ； 由核苷酸序列 ： TGAATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGTTT(SEQ ID NO:16) 组成的寡核苷酸或 与所述寡核苷酸大致上相同的寡核苷酸 ； 由核苷酸序列 ： AAACTTGTGGTAGTTGG

16、AGCAGA(SEQ ID NO:17) 组成的寡核苷酸或与所述 寡核苷酸大致上相同的寡核苷酸 ； 由核苷酸序列 ： AACTTGTGGTAGTTGGAGCAGC(SEQ ID NO:18)组成的寡核苷酸或与所述寡 核苷酸大致上相同的寡核苷酸 ； 以及 由核苷酸序列 ： CACAAAATGATTCTGAATTAGCTGTATC(SEQ ID NO:19)组成的寡核苷酸或与 所述寡核苷酸大致上相同的寡核苷酸。 6. 如权利要求 2 所述的寡核苷酸， 其选自 ： 由核苷酸序列 ： GAATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCTAT(SEQ ID NO:9)组成的寡核苷酸或与 所述寡核苷酸大

17、致上相同的寡核苷酸 ； 以及 由核苷酸序列 ： TATAAAC TTGTGGTAGTTGGAGGTGT(SEQ ID NO:10) 组成的寡核苷酸或与 所述寡核苷酸大致上相同的寡核苷酸。 7. 如权利要求 2 所述的寡核苷酸， 其选自 ： 由核苷酸序列 ： TGAAGATGTACCTATGGTCCTAGTAGGA(SEQ ID NO:11)组成的寡核苷酸或与 所述寡核苷酸大致上相同的寡核苷酸 ； 以及 由核苷酸序列 ： GTCCTGAGCCTGTTTTGTGTCTA(SEQ ID NO:12) 组成的寡核苷酸或与所述 寡核苷酸大致上相同的寡核苷酸。 8. 一种试剂盒， 其包括根据权利要求 1

18、所述的寡核苷酸 (a) 至 (t) 中的至少一种。 9. 如权利要求 8 所述的试剂盒， 其包括寡核苷酸 (a)、 (b)、 (d)、 (e)、 (g)、 (h)、 (i)、 (j)、 (k)、 (l)、 (n)、 (o)、 (p)、 (q)、 (r) 以及 (s) 中的至少一种， 以及寡核苷酸 (c)、 (f)、 (m) 以及 (t) 中的至少一种。 10. 一种检测 DNA 中的 KRAS 突变的方法， 所述方法包括 ： (1) 用 PCR， 使用以下各项来扩增所述 DNA ： 缺乏 3 核酸外切酶活性的热稳定 DNA 聚合 权 利 要 求 书 CN 102869790 A 4 4/8 页

19、 5 酶和 (I) 用于对照分析的一对对照寡核苷酸引物， 其中所述一对对照寡核苷酸引物是用于 扩增所述 KRAS 基因的外显子 4 中的 DNA 区， 并且其中所述一对对照寡核苷酸引物是 ： 根据 权利要求 1 所述的由 SEQ ID NO:11 所表示的核苷酸序列组成的 KrasEx4 对照正向引物或 与所述 KrasEx4 对照正向引物大致上相同的寡核苷酸， 和根据权利要求 1 所述的由 SEQ ID NO:12 所表示的核苷酸序列组成的 KrasEx4 对照反向引物或与所述 KrasEx4 对照反向引物 大致上相同的寡核苷酸 ； 以及 (II) 用于突变分析的至少一对突变寡核苷酸引物，

20、其中所述至少一对突变寡核苷酸引 物是用于扩增在定位于所述 KRAS 基因的外显子 2 中的密码子 12 中具有突变的和 / 或密码 子 13 中具有突变的 DNA 区， 并且其中所述至少一对突变寡核苷酸引物是选自 ： (A) 第一对密码子 13 突变寡核苷酸引物， 其具有 ： (i) 反向引物， 其选自 ： (a) 根据权利要求 1 所述的由 SEQ ID NO:1 所表示的核苷酸序 列组成的 13ASP 反向引物或与所述 13ASP 反向引物大致上相同的寡核苷酸， 或 (b) 根据权 利要求 1 所述的由 SEQ ID NO:4 所表示的核苷酸序列组成的寡核苷酸 (Kras38A_3TG-R

21、) 或 与所述寡核苷酸大致上相同的寡核苷酸， 以及 (ii)正向引物， 其选自 ： (a)根据权利要求1所述的由SEQ ID NO:2所表示的核苷酸序 列组成的 C13 正向引物或与所述 C13 正向引物大致上相同的寡核苷酸， 或 (b) 根据权利要 求 1 所述的由 SEQ ID NO:5 所表示的核苷酸序列组成的寡核苷酸 (KrasC13-F) 或与所述寡 核苷酸大致上相同的寡核苷酸 ； (B) 第二对密码子 13 突变寡核苷酸引物， 其具有 ： (i) 根据权利要求 1 所述的由 SEQ ID NO:7 所表示的核苷酸序列组成的正向引物 (13ASP 正向引物 ) 或与所述正向引物大致上

22、相同的寡核苷酸 ； 以及 (ii) 根据权利要求 1 所述的由 SEQ ID NO:19 所表示的核苷酸序列组成的反向引物 (C12 共用反向引物 ) 或与所述反向引物大致上相同的寡核苷酸 ； 或 (C) 至少一对密码子 12 突变寡核苷酸引物， 其包含 ： (i) 至少一种正向引物， 其 ： (a) 根据权利要求 1 所述的由 SEQ ID NO:8 所表示的核苷 酸序列组成的寡核苷酸 (12VAL 正向引物 ) 或与所述寡核苷酸大致上相同的寡核苷酸 ； (b) 根据权利要求 1 所述的由 SEQ ID NO:14 所表示的核苷酸序列组成的寡核苷酸 (12SER 正 向引物 ) 或与所述寡核

23、苷酸大致上相同的寡核苷酸 ； (c) 根据权利要求 1 所述的由 SEQ ID NO:15 所表示的核苷酸序列组成的寡核苷酸 (12ARG 正向引物 ) 或与所述寡核苷酸大致上 相同的寡核苷酸 ； (d) 根据权利要求 1 所述的由 SEQ ID NO:16 所表示的核苷酸序列组成的 寡核苷酸 (12CYS 正向引物 ) 或与所述寡核苷酸大致上相同的寡核苷酸 ； (e) 根据权利要 求 1 所述的由 SEQ ID NO:17 所表示的核苷酸序列组成的寡核苷酸 (12ASP 正向引物 ) 或 与所述寡核苷酸大致上相同的寡核苷酸 ； (f) 根据权利要求 1 所述的由 SEQ ID NO:18 所

24、 表示的核苷酸序列组成的寡核苷酸 (12ALA 正向引物 ) 或与所述寡核苷酸大致上相同的寡 核苷酸 ； (g) 根据权利要求 1 所述的由 SEQ ID NO:9 所表示的核苷酸序列组成的寡核苷酸 (KrasM35T_1GA-F) 或与所述寡核苷酸大致上相同的寡核苷酸 ； 或 (h) 根据权利要求 1 所述 的由 SEQ ID NO:10 所表示的核苷酸序列组成的寡核苷酸 (Kras35T_3CG-F) 或与所述寡核 苷酸大致上相同的寡核苷酸 ； 以及 权 利 要 求 书 CN 102869790 A 5 5/8 页 6 (ii) 根据权利要求 1 所述的由 SEQ ID NO:19 所表示

25、的核苷酸序列组成的寡核苷酸反 向引物 ( 所述 C12 共用反向引物 ) 或与所述寡核苷酸反向引物大致上相同的寡核苷酸 ； (2) 测定步骤 (1)(I) 的产物， 所述产物包含用所述一对对照寡核苷酸引物来扩增的外 显子4的所述DNA区的扩增产物， 其中检测到所述扩增产物表明 ： 所述DNA中存在所述KRAS 基因 ； 以及 (3) 测定步骤 (1)(II) 的产物， 所述产物包含用所述一对突变寡核苷酸引物来扩增的 外显子 2 的所述 DNA 区的扩增产物， 其中 (a) 当在步骤 (1)(II) 中使用至少一对密码子 13 突变寡核苷酸引物时， 检测到所述扩 增产物表明 ： 所述 DNA 中

26、的所述 KRAS 基因的外显子 2 中的密码子 13 中存在突变 ； 和 / 或 (b) 当在步骤 (1)(II) 中使用至少一对密码子 12 突变寡核苷酸引物时， 检测到所述扩 增产物表明 ： 所述 DNA 中的所述 KRAS 基因的外显子 2 中的密码子 12 中存在突变。 11. 如权利要求 10 所述的方法， 其中在步骤 (1)(II) 中， 步骤 (1)(II) 中使用的所述 至少一对突变寡核苷酸引物是用于扩增在定位于所述 KRAS 基因的外显子 2 中的密码子 12 中具有突变的所述 DNA 区， 针对密码子 12 的所述至少一对突变寡核苷酸引物包含 ： (i) 至少一种正向引物，

27、 其选自 ： (a) 根据权利要求 1 所述的由 SEQ ID NO:8 所表示的 核苷酸序列组成的寡核苷酸(12VAL正向引物)或与所述寡核苷酸大致上相同的寡核苷酸 ； (b) 根据权利要求 1 所述的由 SEQ ID NO:14 所表示的核苷酸序列组成的寡核苷酸 (12SER 正向引物 ) 或与所述寡核苷酸大致上相同的寡核苷酸 ； (c) 根据权利要求 1 所述的由 SEQ ID NO:15 所表示的核苷酸序列组成的寡核苷酸 (12ARG 正向引物 ) 或与所述寡核苷酸大致 上相同的寡核苷酸 ； (d) 根据权利要求 1 所述的由 SEQ ID NO:16 所表示的核苷酸序列组成 的寡核苷

28、酸 (12CYS 正向引物 ) 或与所述寡核苷酸大致上相同的寡核苷酸 ； (e) 根据权利要 求 1 所述的由 SEQ ID NO:17 所表示的核苷酸序列组成的寡核苷酸 (12ASP 正向引物 ) 或 与所述寡核苷酸大致上相同的寡核苷酸 ； (f) 根据权利要求 1 所述的由 SEQ ID NO:18 所 表示的核苷酸序列组成的寡核苷酸 (12ALA 正向引物 ) 或与所述寡核苷酸大致上相同的寡 核苷酸 ； (g) 根据权利要求 1 所述的由 SEQ ID NO:9 所表示的核苷酸序列组成的寡核苷酸 (KrasM35T_1GA-F) 或与所述寡核苷酸大致上相同的寡核苷酸 ； 或 (h) 根据

29、权利要求 1 所述 的由 SEQ ID NO:10 所表示的核苷酸序列组成的寡核苷酸 (Kras35T_3CG-F) 或与所述寡核 苷酸大致上相同的寡核苷酸 ； 以及 (ii) 根据权利要求 1 所述的由 SEQ ID NO:19 所表示的核苷酸序列组成的寡核苷酸反 向引物 ( 所述 C12 共用反向引物 ) 或与所述寡核苷酸反向引物大致上相同的寡核苷酸。 12. 如权利要求 10 所述的方法， 其中在步骤 (1)(II) 中， 步骤 (1)(II) 中使用的所述 至少一对突变寡核苷酸引物是用于扩增在定位于所述 KRAS 基因的外显子 2 中的密码子 13 中具有突变的所述 DNA 区， 针对

30、密码子 13 的所述至少一对突变的寡核苷酸引物是选自 ： (A) 第一对密码子 13 突变寡核苷酸引物， 其包含 ： (i) 反向引物， 其选自 ： (a) 根据权利要求 1 所述的由 SEQ ID NO:1 所表示的核苷酸序 列组成的 13ASP 反向引物或与所述 13ASP 反向引物大致上相同的寡核苷酸， 或 (b) 由 SEQ ID NO:4 所表示的核苷酸序列组成的寡核苷酸 (Kras38A_3TG-R) 或与所述寡核苷酸大致上 相同的寡核苷酸， 以及 (ii) 正向引物， 其选自 ： (a) 根据权利要求 1 所述的由 SEQ ID NO:2 所表示的核苷酸 权 利 要 求 书 CN

31、 102869790 A 6 6/8 页 7 序列组成的 C13 正向引物或与所述 C13 正向引物大致上相同的寡核苷酸， 或 (b) 由 SEQ ID NO:5 所表示的核苷酸序列组成的寡核苷酸 (KrasC13-F) 或与所述寡核苷酸大致上相同的 寡核苷酸 ； 以及 (B) 第二对密码子 13 突变寡核苷酸引物， 其包含 ： (i)由SEQ ID NO:7所表示的核苷酸序列组成的正向引物(13ASP正向引物)或与所述 正向引物大致上相同的寡核苷酸 ； 以及 (ii)由SEQ ID NO:19所表示的核苷酸序列组成的反向引物(C12共用反向引物)或与 所述反向引物大致上相同的寡核苷酸。 13

32、.如权利要求12所述的方法， 其中在步骤(1)(II)中， 所述至少一对突变寡核苷酸引 物包含 ： (i) 反向引物， 其选自 ： (a) 根据权利要求 1 所述的由 SEQ ID NO:1 所表示的核苷酸序 列组成的 13ASP 反向引物或与所述 13ASP 反向引物大致上相同的寡核苷酸， 或 (b) 由 SEQ ID NO:4 所表示的核苷酸序列组成的寡核苷酸 (Kras38A_3TG-R) 或与所述寡核苷酸大致上 相同的寡核苷酸， 以及 (ii) 正向引物， 其选自 ： (a) 根据权利要求 1 所述的由 SEQ ID NO:2 所表示的核苷酸 序列组成的 C13 正向引物或与所述 C1

33、3 正向引物大致上相同的寡核苷酸， 或 (b) 由 SEQ ID NO:5 所表示的核苷酸序列组成的寡核苷酸 (KrasC13-F) 或与所述寡核苷酸大致上相同的 寡核苷酸。 14. 如权利要求 13 所述的方法， 其中步骤 (1)(II) 中使用的所述至少一对突变寡核苷 酸引物包含 ： (i) 由 SEQ ID NO:1 所表示的核苷酸序列组成的 13ASP 反向引物或与所述 13ASP 反向 引物大致上相同的寡核苷酸 ； 以及 (ii)由SEQ ID NO:2所表示的核苷酸序列组成的C13正向引物或与所述C13正向引物 大致上相同的寡核苷酸。 15. 如权利要求 13 所述的方法， 其中步

34、骤 (1)(II) 中使用的所述至少一对突变的寡核 苷酸引物包含 ： (i) 由 SEQ ID NO:4 所表示的核苷酸序列组成的反向引物寡核苷酸 (Kras38A_3TG-R) 或与所述反向引物寡核苷酸大致上相同的寡核苷酸， 以及 (ii)由SEQ ID NO:5所表示的核苷酸序列组成的正向引物寡核苷酸(KrasC13-F)或与 所述正向引物寡核苷酸大致上相同的寡核苷酸。 16. 如权利要求 11 所述的方法， 其中在步骤 (1)(II) 中， 针对密码子 13 的所述至少一 对突变寡核苷酸引物包含 ： (i)由SEQ ID NO:7所表示的核苷酸序列组成的正向引物(13ASP正向引物)或与

35、所述 正向引物大致上相同的寡核苷酸 ； 以及 (ii)由SEQ ID NO:19所表示的核苷酸序列组成的反向引物(C12共用反向引物)或与 所述反向引物大致上相同的寡核苷酸。 17.如权利要求10所述的方法， 其中在步骤(2)中， 用所述一对对照寡核苷酸引物来扩 增的外显子 4 的所述 DNA 区的所述扩增产物由以下组成 ： 从所述一对对照寡核苷酸引物的 一员跨越至所述一对对照寡核苷酸引物的另一员的所述 DNA 区， 或从与所述一对对照寡核 权 利 要 求 书 CN 102869790 A 7 7/8 页 8 苷酸引物的一员互补的区域跨越至与所述一对对照寡核苷酸引物的另一员互补的区域的 所述

36、DNA 区。 18.如权利要求10所述的方法， 其中在步骤(3)中， 用所述一对突变寡核苷酸引物来扩 增的外显子 2 的所述 DNA 区的所述扩增产物由以下组成 ： 从所述至少一对突变寡核苷酸引 物的一员跨越至所述至少一对突变寡核苷酸引物的另一员的所述 DNA 区， 或从与所述至少 一对突变寡核苷酸引物的一员互补的区域跨越至与所述至少一对突变寡核苷酸引物的另 一员互补的区域的所述 DNA 区。 19. 如权利要求 10 所述的方法， 其中步骤 (1) 中使用的缺乏 3 核酸外切酶活性的所 述热稳定 DNA 聚合酶是选自 ： 从嗜热脂肪芽胞杆菌分离的热稳定 Bst DNA 聚合酶 I、 等温 D

37、NA 聚合酶、 经由氧化所述核酸外切酶活性所必需的氨基酸残基来除去 3 至 5 核酸外切酶 活性的 T7DNA 聚合酶 ( 测序酶型式 1) 或在基因上通过缺失所述 3 至 5 核酸外切酶活性 所必需的 28 种氨基酸来除去 3 至 5 核酸外切酶活性的 T7DNA 聚合酶 ( 测序酶型式 2)、 VentR(exo-)DNA 聚合酶以及 Taq 聚合酶。 20. 如权利要求 19 所述的方法， 其中缺乏 3 核酸外切酶活性的所述热稳定 DNA 聚合酶 是 Taq 聚合酶。 21. 如权利要求 17 所述的方法， 其中在步骤 (2) 中， 用由 SEQ ID NO:13 所表示的核苷 酸序列组

38、成的寡核苷酸探针或与所述寡核苷酸探针大致上相同的标记的寡核苷酸来测定 用所述一对对照寡核苷酸引物来扩增的外显子 4 的所述 DNA 区的所述扩增产物。 22.如权利要求18所述的方法， 其中在步骤(2)中， 用由SEQ ID NO:3或6所表示的核 苷酸序列组成的寡核苷酸探针或与所述寡核苷酸探针大致上相同的标记的寡核苷酸来测 定用所述至少一对突变寡核苷酸引物来扩增的外显子 2 的所述 DNA 区的所述扩增产物。 23.如权利要求22所述的方法， 其中在步骤(2)中， 用由SEQ ID NO:3所表示的核苷酸 序列组成的寡核苷酸探针或与所述寡核苷酸探针大致上相同的标记的寡核苷酸来测定用 所述至少

39、一对突变寡核苷酸引物来扩增的外显子 2 的所述 DNA 区的所述扩增产物。 24.如权利要求22所述的方法， 其中在步骤(2)中， 用由SEQ ID NO:6所表示的核苷酸 序列组成的寡核苷酸探针或与所述寡核苷酸探针大致上相同的标记的寡核苷酸来测定用 所述至少一对突变寡核苷酸引物来扩增的外显子 2 的所述 DNA 区的所述扩增产物。 25.如权利要求14所述的方法， 其中在步骤(2)中， 用由SEQ ID NO:3所表示的核苷酸 序列组成的寡核苷酸探针或与所述寡核苷酸探针大致上相同的标记的寡核苷酸来测定用 所述至少一对突变寡核苷酸引物来扩增的外显子 2 的所述 DNA 区的所述扩增产物。 26

40、.如权利要求15所述的方法， 其中在步骤(2)中， 用由SEQ ID NO:6所表示的核苷酸 序列组成的寡核苷酸探针或与所述寡核苷酸探针大致上相同的标记的寡核苷酸来测定用 所述至少一对突变寡核苷酸引物来扩增的外显子 2 的所述 DNA 区的所述扩增产物。 27.如权利要求1所述的方法， 其中步骤(1)中使用的所述DNA是基因组DNA或从组织 获取的 cDNA。 28. 如权利要求 27 所述的方法， 其中步骤 (1) 中使用的所述 DNA 是从组织获取的互补 cDNA。 29. 一种预测患者体内的肿瘤对表皮生长因子受体定向化疗的敏感度的方法， 所述方 法包括 ： 权 利 要 求 书 CN 10

41、2869790 A 8 8/8 页 9 (1) 从所述肿瘤获取 DNA ； 以及 (2) 使用如权利要求 10 至 28 中的一项所述的用于检测 DNA 中的 KRAS 突变的方法来 测定所述 DNA 中的所述 KRAS 基因的外显子 2 中的密码子 12 中突变的存在和 / 或密码子 13 中突变的存在， 其中在密码子 12 中检测到所述突变和 / 或密码子 13 中检测到所述突变预 示 ： 与密码子12和密码子13中没有突变的同一类型的肿瘤相比， 所述肿瘤对表皮生长因子 受体定向化疗具有降低的敏感度。 30.如权利要求29所述的方法， 其中步骤(2)测定所述KRAS基因的外显子2中的密码

42、子 12 中的突变。 31.如权利要求29所述的方法， 其中步骤(2)测定所述KRAS基因的外显子2中的密码 子 13 中的突变。 32.如权利要求29所述的方法， 其中步骤(2)测定所述KRAS基因的外显子2中的密码 子 12 中的突变和密码子 13 中的突变。 权 利 要 求 书 CN 102869790 A 9 1/15 页 10 KRAS 引物和探针 0001 本申请要求 2010 年 4 月 12 号提交的美国临时专利申请号 61/323,114 的权益， 该 临时专利申请的公开内容据此以引用的方式并入。 发明领域 0002 本发明涉及用于检测 DNA 中的 KRAS 突变的 PCR

43、 引物和探针及使用所述 PCR 引物 和探针来检测 KRAS 突变的方法， 以及预测癌症对表皮生长因子受体定向化疗的敏感度。 0003 背景信息 0004 表皮生长因子受体 (EGFR) 是在癌症发展中起重要作用的酪氨酸激酶。举例来说， 在患有转移性结肠直肠癌 (CRC) 的患者的多于 85% 的肿瘤中可以看到 EGFR 的过度表达。 参见 Lee JJ 和 Chu E， Clin Colorectal Cancer 2007 ； 6 增刊 2 ： S42-6。已经开发了靶向 EGFR 的抗癌药物。西妥昔单抗 (cetuximab) 和帕尼单抗 (panitumumab) 是两种 EGFR 抑

44、制 剂， 这两种抑制剂已经在用于转移性 CRC 的二线使用和与基于奥沙利铂 (oxaliplatin) 和 伊立替康 (irinotecan) 的疗法组合的一线使用中展示有前景的治疗作用。参见 Lee JJ 和 Chu E， Clin Colorectal Cancer.2007 ； 6 增刊 2 ： S42-6 ； Zhang W 等， Ann Med.2006 ； 38 ： 545-51。然而， 不是所有的患者都对西妥昔单抗和帕尼单抗有反应。 0005 Ras 基因、 H-ras、 K-ras(KRAS) 以及 N-ras 编码在 EGFR 信号传导途径中涉及的 小 GTP 酶。外显子 2

45、 中的关键密码子 12、 13 或 61 中的一个密码子上的 KRAS 基因中的 点突变可促进肿瘤发展。KRAS 突变发生在约 37% 的结肠直肠腺癌中。参见 Brink M 等， Carcinogenesis 2003 ； 24 ： 703-10。已经展示出突变的 K-ras 基因与缺乏对西妥昔单抗和 帕尼单抗疗法的反应性以及缺乏西妥昔单抗和帕尼单抗疗法带来的短暂存活之间的强相 关性。因为 KRAS 突变的存在可高度预测出对西妥昔单抗和帕尼单抗的无反应性， 所以带有 突变 KRAS 的患者应该考虑前述使用这些 EGFR 抑制剂的化疗。 0006 KRAS突变可以通过许多方法来检测。 举例来说

46、， DNA可例如通过标准的蛋白酶K消 化和苯酚-氯仿萃取而从冷冻组织样本中提取， 并且通过聚合酶链反应(PCR)来扩增， 其中 KRAS 突变然后可以通过 PCR 产物的测序来检测。参见 Tam IY 等， Clin Cancer Res.2006 ； 2(5) ： 1647-53。 0007 KRAS 突变也可以用扩增受阻突变系统 PCR(ARMS PCR) 检测。ARMSPCR 也称为等位 基因特异性PCR(ASP)或特异性等位基因的PCR扩增(PASA)， 是一种能够检测单个碱基突变 的以 PCR 为基础的方法。参见 Newton 等， Nucleic Acids Res.1989 ；

47、17(7) ： 2503-16。在 ARMS PCR 中， 一个 PCR 引物的 3 端符合靶突变。因为 ARMS PCR 采用了错配修复所需要的 缺乏 3 核酸外切酶活性的聚合酶 ( 通常是 Taq 聚合酶 )， 原则上 ARMS PCR 将只扩增带有靶 突变的 DNA 模板。ARMS 可允许仅通过检查反应混合物， 例如通过琼脂糖凝胶电泳来检测突 变， 因为扩增产物的存在表明具体突变的存在。参见 Newton 等， Nucleic Acids Res.1989 ； 17(7) ： 2503-16 ； Bottema,CD 等， Methods Enzymol.1993 ； 218 ： 388

48、-402。 0008 发明概述 0009 本发明提供寡核苷酸引物和探针， 其选自 ： 说 明 书 CN 102869790 A 10 2/15 页 11 0010 (a)由核苷酸序列 ： GTCAAGGCACTCTTGCCTAAGT(SEQ ID NO:1)组成的寡核苷酸(在 下文中也被称为 “13ASP 反向引物” 或 “Kras38A_2GT-R” ) 或与所述寡核苷酸大致上相同的 寡核苷酸 ； 0011 (b)由核苷酸序列 ： GGCCTGCTGAAAATGACTGA(SEQ ID NO:2)组成的寡核苷酸(在下 文中也被称为 “C13 正向引物” 或 “KrasC13-F4” ) 或与

49、所述寡核苷酸大致上相同的寡核苷 酸 ； 0012 (c) 由核苷酸序列 ： 6FAM-CAACTACCACAAGTTT(SEQ ID NO:3) 组成的标记的寡核苷 酸 ( 在下文中也被称为 “C13 探针” 或 “C13-Mc2“) 或与所述寡核苷酸大致上相同的寡核苷 酸 ； 0013 (d)由核苷酸序列 ： AGGCACTCTTGCCTCCGT(SEQ ID NO:4)组成的寡核苷酸(在下文 中也被称为 “Kras38A_3TG-R” ) 或与所述寡核苷酸大致上相同的寡核苷酸 ； 0014 (e) 由核苷酸序列 ： GCCTGCTGAAAATGACTGAATAT(SEQ ID NO:5) 组成的寡核苷酸 ( 在下文中也被称为” KrasC13-F” ) 或与所述寡核苷酸大致上相同的寡核苷酸 ； 0015 (f) 由核苷酸序列 ： 6FAM-CTCCAACTACCACAAGTT(SEQ ID NO:6) 组成的标记的寡核 苷酸 ( 在下文中也被称为 “KrasC13_Mc” ) 或与所述寡核苷酸大致上相同的寡核苷酸 ； 0016 (g) 由核苷酸序列 ： CTTGTGGTAGTTGGAGCTGGTAA(SEQ ID NO:7) 组成的寡核苷酸 ( 在下文中也被称为 “13ASP 正向引物”