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1、(10)申请公布号 CN 102942624 A (43)申请公布日 2013.02.27 CN 102942624 A *CN102942624A* (21)申请号 201210371948.9 (22)申请日 2012.09.28 CGMCC No.6250 2012.06.21 C07K 14/46(2006.01) C12N 15/70(2006.01) A61K 38/17(2006.01) A61P 31/04(2006.01) (71)申请人 中国科学院海洋研究所 地址 266071 山东省青岛市南海路 7 号 (72)发明人 孙黎 陈骋 (74)专利代理机构 沈阳科苑专利商标代。
2、理有限 公司 21002 代理人 周秀梅 李颖 (54) 发明名称 一种半乳糖凝集素 -3 结合蛋白及其制备和 应用 (57) 摘要 本发明涉及分子生物学领域， 具体的说是一 种半乳糖凝集素 -3 结合蛋白及其制备和应用。 半乳糖凝集素 -3 结合蛋白为序列表 SEQ I D No.1 中的氨基酸序列所示。制备方法 ： 以半滑舌 鳎 cDNA 为模板， 用引物 F1 和 R1 进行 PCR 扩增， PCR 产物连接表达载体后得质粒 pETG3BP， 将其转 化 BL21DE3)， 获得转化子 BL21/pETG3BP， 经异丙 基 -D- 硫代半乳糖苷诱导后， 利用亲和层析柱 纯化重组蛋白， 。
3、即为半乳糖凝集素 -3 结合蛋白。 所述半乳糖凝集素 -3 结合蛋白具有显著的结合 多种细菌的能力。 (83)生物保藏信息 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 4 页 序列表 3 页 附图 1 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 4 页 序列表 3 页 附图 1 页 1/1 页 2 1. 一种半乳糖凝集素 -3 结合蛋白， 其特征在于 ： 半乳糖凝集素 -3 结合蛋白为序列表 SEQ ID No.1 中的氨基酸序列所示。 2. 一种权利要求 1 所述半乳糖凝集素 -3 结合蛋白的制备， 其特征在于 ： 1） 质粒 pETG。
4、3BP 的构建 ： 以半滑舌鳎 cDNA 为模板， 用引物 F1 和 R1 进行 PCR 扩增， PCR 产物纯化后与 T-Simple 连接， 连接混合液转化大肠杆菌后在含安卡青霉素、 Xgal、 异丙基 -D- 硫代半乳糖苷的 LB 培养基上培养 2 8h, 筛选转化子提取质粒， 得重组质粒 pTSG3BP ； 将pTSG3BP用Sma I酶切， 回收1.6kb片段， 连接于pET259， 连接液转化入大肠杆菌， 在 含卡那霉素的 LB 培养基上培养 18 24 小时 , 筛选转化子提取质粒， 即为 pETG3BP ； 2） 半乳糖凝集素 -3 结合蛋白的制备 将上述步骤 1） 的质粒 p。
5、ETG3BP 转化 BL21(DE3)， 在含有卡那霉素的 LB 培养基上培养 , 筛选转化子即为 BL21/pETG3BP ； 将 BL21/pETG3BP 用终浓度为 1mM 的异丙基 -D- 硫代半 乳糖苷诱导表达后， 采用亲和层析柱纯化重组蛋白， 即为序列表SEQ ID No.1中的氨基酸序 列所示的半乳糖凝集素 -3 结合蛋白。 3.按权利要求2所述的半乳糖凝集素-3结合蛋白的制备， 其特征在于 ： 所述步骤1） 中 F1 为 5 -CCCGGGGCCACCATGGCTTTTACATTTGACCTGTTC-3 ； R1 为 5 -CCCGGGGACTCGGACGTACAC TGGTC。
6、T-3 。 4. 一种权利要求 1 所述的半乳糖凝集素 -3 结合蛋白的应用， 其特征在于 ： 所述半乳糖 凝集素 -3 结合蛋白能够结合细菌， 继而作为细菌的抑制剂。 5. 按权利要求 4 所述的半乳糖凝集素 -3 结合蛋白的应用， 其特征在于 ： 所述半乳糖凝 集素 -3 结合蛋白能够结合革兰氏阴性细菌或革兰氏阳性细菌。 6. 按权利要求 5 所述的半乳糖凝集素 -3 结合蛋白的应用， 其特征在于 ： 所述革兰氏 阴性细菌为荧光假单胞菌 （Pseudomonas fluorescens） 、 迟缓爱德华氏菌 （Edwardsiella tarda） 、 大肠杆菌 （Escherichia 。
7、coli） 或鳗弧菌 （Vibrio anguillarum） ； 革兰氏阳性细菌 为海豚链球菌 （Streptococcus iniae） 或枯草芽孢杆菌 （Bacillus subtilis） 。 权 利 要 求 书 CN 102942624 A 2 1/4 页 3 一种半乳糖凝集素 -3 结合蛋白及其制备和应用 技术领域 0001 本发明涉及分子生物学领域， 具体的说是一种半乳糖凝集素 -3 结合蛋白及其制 备和应用。 背景技术 0002 半乳糖凝集素 -3 结合蛋白 (galectin-3 binding protein,G3BP) 是一种分泌至 胞外的糖蛋白， 它能够结合半乳糖凝集素。
8、 -3（galectin-3） 以及其它胞外蛋白， 如胶原蛋白 （collagen） 、 纤维连接蛋白 （fibronectin） 、 1 整合蛋白 （1 integrins） 等。目前研究 最多的是人类G3BP， 发现它在分子结构上含有一个清道夫受体 （Scavenger receptor） 功能 域， 该功能域与靶分子结合有关。人类 G3BP 在免疫组织和细胞中表达， 并且在病毒感染以 及某些癌症病人血清中表达上调， 因此可能参与机体的免疫抵抗、 炎症反应、 肿瘤发生等过 程。迄今 G3BP 只在两种鱼类 （斑马鱼和大西洋鲑） 中发现， 但其功能则完全未知。 发明内容 0003 本发明目的。
9、在于提供一种半乳糖凝集素 -3 结合蛋白及其制备和应用。 0004 为实现上述目的， 本发明采用的技术方案为 ： 0005 一种半乳糖凝集素-3结合蛋白， 半乳糖凝集素-3结合蛋白为序列表SEQ ID No.1 中的氨基酸序列所示。 0006 半乳糖凝集素 -3 结合蛋白的制备， 0007 1） 质粒 pETG3BP 的构建 ： 0008 以半滑舌鳎 cDNA 为模板， 用引物 F1 和 R1 进行 PCR 扩增， PCR 产物纯化后与 T-Simple 连接， 连接混合液转化大肠杆菌后在含安卡青霉素、 Xgal、 异丙基 -D- 硫代半 乳糖苷的 LB 培养基上培养 2 8h, 筛选转化子提。
10、取质粒， 得重组质粒 pTSG3BP ； 0009 将 pTSG3BP 用 Sma I 酶切， 回收 1.6kb 片段， 连接于 pET259， 连接液转化入大肠杆 菌， 在含卡那霉素的 LB 培养基上培养 18 24 小时 , 筛选转化子提取质粒， 即为 pETG3BP ； 0010 2） 半乳糖凝集素 -3 结合蛋白的制备 0011 将上述步骤 1） 的质粒 pETG3BP 转化 BL21(DE3)， 在含有卡那霉素的 LB 培养基上培 养 , 筛选转化子即为 BL21/pETG3BP ； 将 BL21/pETG3BP 用终浓度为 1mM 的异丙基 -D- 硫 代半乳糖苷诱导表达后， 采用。
11、亲和层析柱纯化重组蛋白， 即为序列表SEQ ID No.1中的氨基 酸序列所示的半乳糖凝集素 -3 结合蛋白。 0012 所述步骤 1） 中 F1 为 5 -CCCGGGGCCACCATGGCTTTTACATTTGACCTGTTC -3 ； R1 为 5 -CCCGGGGACTCGGACGTACACTGGTCT-3 。 0013 半乳糖凝集素-3结合蛋白的应用， 所述半乳糖凝集素-3结合蛋白能够结合细菌， 继而作为细菌的抑制剂。 0014 所述半乳糖凝集素 -3 结合蛋白能够结合革兰氏阴性细菌或革兰氏阳性细菌。 0015 所述革兰氏阴性细菌为荧光假单胞菌 （Pseudomonas fluore。
12、scens） 、 迟缓爱 说 明 书 CN 102942624 A 3 2/4 页 4 德 华 氏 菌 （Edwardsiella tarda） 、 大 肠 杆 菌 （Escherichia coli）或 鳗 弧 菌 （Vibrio anguillarum） ； 革兰氏阳性细菌为海豚链球菌 （Streptococcus iniae）或枯草芽孢杆菌 （Bacillus subtilis） 。 0016 本发明具有如下优点 ： 本发明的半乳糖凝集素 -3 结合蛋白能够与多种革兰氏阴 性细菌和革兰氏阳性细菌显著性结合。本发明所得自半滑舌鳎中克隆获得了 G3BP， 其与多 种细菌具有显著性结合能力， 。
13、本发明乳糖凝集素 -3 结合蛋白能够与多种革兰氏阴性细菌 和革兰氏阳性细菌显著性结合 ； 因此该蛋白具有在抗细菌感染中应用的潜能。 附图说明 0017 图 1 为本发明实施例提供的纯化得到的半乳糖凝集素 -3 结合蛋白电泳图谱 （其 中， 纯化得到的半乳糖凝集素 -3 结合蛋白为泳道 2 ； 泳道 1 ： 分子量 marker） 。 0018 图 2 为本发明实施例提供的半乳糖凝集素 -3 结合蛋白与各种细菌的结合能力检 测结果。 具体实施方式 0019 下面结合实施例对本发明作进一步说明。实施例旨在对本发明进行举例描述， 而 非以任何形式对本发明进行限制。 0020 在本发明实施例中所涉及到。
14、的常规性实验方法均采用如下方法 ： 0021 1. 质粒提取、 DNA(PCR) 产物纯化、 DNA 片段从凝胶中回收皆使用 “天根生化科技 ( 北京 ) 有限公司” 的相应试剂盒。 0022 2. 大 肠 杆 菌 用 Hanahan 方 法 （Sambrook and Russell:Molecular Cloning:A Laboratory Mannual.Cold Spring Harbor Laboratory Press2001） ；酵 母 转 化 按 Invitrogen 公司的方法 （Catalog no.V175-20） ； 聚丙烯酰胺凝胶电泳 （SDS PAGE） 按照 S。
15、ambrook and Russell:Molecular Cloning:A Laboratory Mannual.Cold Spring Harbor Laboratory Press2001。 0023 3. 所有限制性内切酶和连接酶皆购自于 “纽英伦生物技术有限公司” ， 北京。 0024 实施例 1 0025 本发明的半乳糖凝集素 -3 结合蛋白为序列表 SEQ ID No.1 中的氨基酸序列。 0026 序列表 SEQ ID No.1 为 ： 0027 MQTHQNFCRIWVLLLLLHVADGAFTFDLFENIAAPKEGDVRLAGSRSSSEGRVEVYHDGRWGTVC。
16、DDGW DIAEAQVVCRQLRFSGAKGVQVGQPYGEATGPIWMDDMICQGTEKHLLNCAFKSWGVTDCTHKEDVGIICENNDNNS KNAIYSLDHSFSLSDELGQLFDSEVGCDFLIILRSPTGHRFEYETEEMICAHKMILLLVPRFNASQGVSNITVDISQ SCKPYFPTFLRYIYTRQIDVDLSSIHCLHWMASMFEVKHLMEGTARLFSEVLPEDTLFHTQVSIYNYAVETEDLVLQ ENCLQYLSWNFQNLTNSPAWPDISVKLLRAILVRSDLVVPNEYFVLQSVENWITDKDEAIS。
17、LEDQALILNCLRFPMI PVEKLYVLETNSSLYNNHSKLYSEKILKAFQFNVLLFSDLLTNPKFDREERDYHPRLYVDYPWSVTISPSYSSRSLS TPSHNSLIFRSKTINWEANIYRSHYDCSNRRLQCKSLPMARLASHSHYHGNNIVYQNQLLLSCQGKYICHIQDFKSD LAYVTKNATHGLTYPCPDSQYTYQFVVRPVYVRV 0028 （a） 序列特征 ： 0029 长度 ： 565 说 明 书 CN 102942624 A 4 3/4 页 5 0030 类型 ： 氨基酸序列 0031 链型 ： 单链 00。
18、32 拓扑结构 ： 线性 0033 （b） 分子类型 ： 蛋白质 0034 （c） 假设 ： 否 0035 （d） 反义 ： 否 0036 （e） 最初来源 ： 半滑舌鳎 0037 结构特点 ： 该蛋白含有一个清道夫受体功能域 （由氨基酸 40 140 组成） 。 0038 实施例 2 0039 半乳糖凝集素 -3 结合蛋白 G3BP 的制备方法 ： 0040 1） 质粒 pETG3BP 的构建 ： 0041 以 半 滑 舌 鳎 cDNA 为 模 板， 用 引 物 F1 和 R1 进 行 PCR 扩 增。PCR 条 件 为 ： 94 60s 预 变 性 模 板 DNA, 然 后 94 40s,。
19、60 60s,72 60s,5 个 循 环 后 改 为 94 40s,65 60s,72 60s,30 个循环后再在 72延伸反应 7 10min。PCR 产物用天 根的 PCR 产物纯化试剂盒纯化后与质粒 T-Simple( 购于北京全式金生物技术有限公司 ) 于室温连接 2 8 小时， 连接混合液转化大肠杆菌 DH5 后在含安卡青霉素 (100ug/ml)、 Xgal(40ug/ml)、 异丙基 -D- 硫代半乳糖苷 (24ug/ml) 的 LB 培养基上培养 18 24 小 时 , 筛选转化子提取质粒， 得重组质粒 pTSG3BP。 0042 将pTSG3BP用Sma I酶切， 回收1.。
20、6kb片段。 将表达载体pET259 （pET259构建过程 参见 Zheng,W.J.,Hu,Y.H.,Sun,L.,2010.Cloning and analysis of a ferritin subunit from turbot(Scophthalmus maximus).Fish.Shellfish.Immunol.28,829-836） 用Swa I酶 切后回收 5.4kb 片段， 将其与回收的 1.6kb 片段用 T4DNA 连接酶连接， 连接液转化入大肠杆 菌 DH5， 在含卡那霉素 （30ug/ml） 的 LB 培养基上培养 18 24 小时 , 筛选转化子提取质 粒， 即。
21、为 pETG3BP。 0043 所述 LB 组成成分按重量百分比计 ： 1.0蛋白胨 ,0.5酵母粉 ,1.0 氯化 钠 ,97.5蒸馏水。所述 F1 为 5 -CCCGGGGCCACCATGGCTTTTACATTTGACCTGTTC-3 ； R1 为 5 -CCCGGGGACTCGGACGTACACTGGTCT-3 。 0044 2） 重组半乳糖凝集素 -3 结合蛋白 G3BP 的表达和制备 0045 将步骤 1）的质粒 pETG3BP 转化 BL21(DE3)（购于 “天根生化科技 ( 北京 ) 有限 公司” ） ， 在含有卡那霉素 （30ug/ml） 的 LB 培养基上培养 , 筛选转化。
22、子即为 BL21/pETG3BP。 将 BL21/pETG3BP 在含有卡那霉素的 LB 培养基中于 37培养至 OD600为 0.6, 加入异丙 基 -D- 硫代半乳糖苷使其终浓度达到 1mM， 37继续摇动培养 4-5 小时， 而后用 GE Healthcare（美国） 公司的 Ni-NTA 金属亲和层析填料 （nickel-nitrilotriacetic acid） 亲和层析柱纯化重组蛋白 （层析条件 ： 用 4 5ml 洗涤液洗柱两次， 随后用 0.5 1ml 洗脱 缓冲液洗柱， 收集所有洗脱液） 。将重组蛋白用聚丙烯酰胺凝胶电泳 （SDS PAGE） 分析， 发 现其分子量与表 S。
23、EQ ID No.1 中序列的 G3BP 分子量一致 （参见图 1） 。 0046 上述洗涤液成分为 ： 50mM NaH2PO4,300mM NaCl,20mM imidazole,pH8.0;上述洗脱 缓冲液成分为 ： 50mM NaH2PO4,300mM NaCl,250mM imidazole,pH8.0. 0047 实施例 3 说 明 书 CN 102942624 A 5 4/4 页 6 0048 半乳糖凝集素 -3 结合蛋白 G3BP 的细菌结合作用 0049 1）细菌悬液制备。在 LB 培养基中分别培养革兰氏阴性细菌荧光假单胞菌 （Pseudomonas fluorescens）。
24、 （保存于 CGMCC， 保藏日期 2008 年 1 月 9 日， 编号为 CGMCC 2329） 、 迟缓爱德华氏菌 （Edwardsiella tarda）（保存于 CGMCC， 保藏日期 2008 年 1 月 9 日， 编号为 CGMCC 2330） 、 大肠杆菌 （Escherichia coli） （DH5, 购于 “天根生化科技 ( 北京 ) 有限公司” ） 、 鳗弧菌 （Vibrio anguillarum）（保存于 CGMCC， 保藏日期 2012 年 6 月 21 日， 编 号为 CGMCC 6250, 保藏单位 ： 中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心 ； 保藏单位 。
25、地址 ： 北京市朝阳区北辰西路1号院3号） 以及革兰氏阳性细菌海豚链球菌 （Streptococcus iniae） ( 保存于 CGMCC， 编号为 CGMCC1984, 保藏日 2007 年 3 月 22）和枯草芽孢杆菌 （Bacillus subtilis） （购买自 CGMCC， 编号为 CGMCC 1.460） 至 OD600为 0.8, 离心 （5000g， 4C离心10min） 收集菌体， 重新悬于包被液(包被液为0.159Na2CO3,0.293NaHCO3,pH 9.6) 至 108CFU/ml。 0050 2） 酶联免疫吸附试验 （enzyme-linked immunos。
26、orbent assay， ELISA)。将 96 孔 ELISA 板用包被液处理 1h， 随后用 PBS 洗三次。将上述步骤 1） 的各种细菌悬液加入 ELISA 板 （每孔 100ul） 。将 ELISA 板于 4保温 15h， 每孔加入 200ul3 （重量 / 体积比） 的脱脂奶 粉， 于 37保温 1h。将 ELISA 板用 PBS 洗三次， 随后每孔加入 100ul 上述实施例 2 步骤 2） 制备的半乳糖凝集素 -3 结合蛋白 G3BP 或者 PBS（对照） 。将 ELISA 板用 PBS 洗三次， 随后 每孔加入 100ul 鼠抗 His 抗体 （购于 “天根生化科技 ( 北京。
27、 ) 有限公司” ） ， 于 37保温 1h。 将 ELISA 板用 PBS 洗三次， 随后每孔加入 100ul 羊抗鼠 IgG HRP 抗体 （购于 “天根生化科 技 ( 北京 ) 有限公司” ） ， 于 37保温 1h。将 ELISA 板用 PBS 洗三次， 用 TMB 试剂盒 （购于北 京 “天根生化科技有限公司” ） 显色， 随后在 450nm 测定吸光值。半乳糖凝集素 -3 结合蛋白 G3BP 与细菌的结合指数 （Binding index） 计算如下 ： ELISA 反应中含有 G3BP 的细菌的吸光 值/含有PBS的细菌的吸光值。 通常Binding index大于2即被认为是有。
28、意义的 （positive reading） 。 0051 结果表明， 半乳糖凝集素 -3 结合蛋白 G3BP 与所检测的细菌的 Binding index 皆 大于 5 （参见图 2） ， 说明 G3BP 能够与多种革兰氏阴性细菌和革兰氏阳性细菌发生显著结合。 因此 G3BP 可望在细菌性疾病的防控中应用。 0052 所 述 PBS 组 成 成 分 按 重 量 百 分 比 计 ： 0.8 NaCl,0.02 KCl,0.358 Na2HPO4.12H2O,0.024 NaH2PO4， 余量为水。 说 明 书 CN 102942624 A 6 1/3 页 7 0001 0002 序 列 表 CN 102942624 A 7 2/3 页 8 0003 序 列 表 CN 102942624 A 8 3/3 页 9 序 列 表 CN 102942624 A 9 1/1 页 10 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 102942624 A 10 。