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1、(10)申请公布号 CN 102851361 A (43)申请公布日 2013.01.02 CN 102851361 A *CN102851361A* (21)申请号 201210237946.0 (22)申请日 2012.07.10 C12Q 1/68(2006.01) C12Q 1/10(2006.01) C12N 15/11(2006.01) (71)申请人 许龙岩 地址 510623 广东省广州市珠江新城花城大 道 66 号 B1405 室 申请人 袁慕云 曹际娟 相大鹏 唐勤 (72)发明人 许龙岩 袁慕云 曹际娟 相大鹏 唐勤 (74)专利代理机构 广州科粤专利商标代理有限 公司 。
2、44001 代理人 刘明星 (54) 发明名称 沙门氏菌肠炎沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌 PCR 焦磷酸法的检测引物试剂盒和检测方法 (57) 摘要 本发明公开了一种沙门氏菌肠炎沙门氏 菌和鼠伤寒沙门氏菌 PCR 焦磷酸法的检测引 物试剂盒和检测方法。本发明根据沙门氏 菌 aceA 基因、 肠炎沙门氏菌特异序列、 鼠伤寒 沙 门 氏 菌 的 STM4599 序 列 中 的 保 守 区 域， 分 别设计扩增引物和测序引物， 对目标片段进 行 PCR 扩增， 再用扩增产物制备单链模板， 进 行焦磷酸测序， 测序引物后前 30 个碱基序列 为 GCCTGTGGGTACTTCTCCTGCCAGTATAAT。
3、 判 断 样 品中含有沙门氏菌， 测序引物后前 30 个碱基 序 列 为 CCTGTTGTCTGCTCACCATTCGCCAGCCAC 和 TACAACCGGAGTGCACATTAATCCCGCAGC 则分别判断 含有肠炎沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌。 (51)Int.Cl. 权利要求书 2 页 说明书 10 页 序列表 3 页 附图 3 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 2 页 说明书 10 页 序列表 3 页 附图 3 页 1/2 页 2 1. 一种沙门氏菌、 肠炎沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌 PCR- 焦磷酸法的检测引物， 其特征 在于包括 PCR 引物。
4、和测序引物 ： 针对沙门氏菌的 PCR 引物 ： 5 -TCACCGAAAGACCAACAGAA-3 ； 5 -GGTGGAACTCGCTGAAATGA-3 ； 测序引物 ： 5 -CGAAAGACCAACAGAAG-3 ； 针对肠炎沙门氏菌的 PCR 引物 ： 5 -GCATGTTCTGGAAAGCCTCTTTAT-3 ； 5 -TCGTTCTTCTGGTACTTACGATGA-3 ； 测序引物 ： 5 -AAAAAGGTTTAGTAAATCAG-3 ； 针对鼠伤寒沙门氏菌的 PCR 引物 ： 5 -AAGCTAAGTGTGGGGGCTAGTAT-3 ； 5 -GGGTTTGTTTTTGAT。
5、GATACAGG-3 ； 测序引物 ： 5 -AGTATTGATAAATAATGGTT-3 。 2. 一种沙门氏菌、 肠炎沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌 PCR- 焦磷酸法的检测试剂盒， 包括 DNA 提取试剂， PCR 反应试剂， 单链模板制备试剂， 焦磷酸测序试剂， PCR 引物和测序引物， 其 特征在于， 所述的 PCR 引物和测序引物为 ： 针对沙门氏菌的 PCR 引物 ： 5 -TCACCGAAAGACCAACAGAA-3 ； 5 -GGTGGAACTCGCTGAAATGA-3 ； 测序引物 ： 5 -CGAAAGACCAACAGAAG-3 ； 针对肠炎沙门氏菌的 PCR 引物 ： 5 -。
6、GCATGTTCTGGAAAGCCTCTTTAT-3 ； 5 -TCGTTCTTCTGGTACTTACGATGA-3 ； 测序引物 ： 5 -AAAAAGGTTTAGTAAATCAG-3 ； 针对鼠伤寒沙门氏菌的 PCR 引物 ： 5 -AAGCTAAGTGTGGGGGCTAGTAT-3 ； 5 -GGGTTTGTTTTTGATGATACAGG-3 ； 测序引物 ： 5 -AGTATTGATAAATAATGGTT-3 。 3. 一种非诊断目的的沙门氏菌、 肠炎沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌的检测方法， 其特征 在于， 包括以下步骤 ： （1） 对样品进行增菌培养， 提取增菌液中菌体的基因组 DNA 。
7、作为模板 ； （2）分 别 使 用 权 利 要 求 1 所 述 的 PCR 引 物 分 别 进 行 PCR 反 应， 回 收 PCR 产 物， 制备单链模版， 然后应用权利要求 1 所述的测序引物对相应的 PCR 产物进行 焦磷酸测序， 自测序引物 3 端后的第一个碱基开始测序， 当前 30 个碱基序列为 GCCTGTGGGTACTTCTCCTGCCAGTATAAT 时， 判断样品中含有沙门氏菌， 当前 30 个碱基序列为 CCTGTTGTCTGCTCACCATTCGCCAGCCAC 时， 判断样品中含有肠炎沙门氏菌， 当前 30 个碱基序列 为 TACAACCGGAGTGCACATTAATC。
8、CCGCAGC 时， 判断样品中含有鼠伤寒沙门氏菌。 4. 根据权利要求 3 所述的检测方法， 其特征在于， 所述的样品为食品或海鲜。 权 利 要 求 书 CN 102851361 A 2 2/2 页 3 5. 根据权利要求 4 所述的检测方法， 其特征在于， 所述的食品为肉制品。 6. 根据权利要求 5 所述的检测方法， 其特征在于， 所述的肉制品为猪肉。 7. 根据权利要求 4 所述的检测方法， 其特征在于， 所述的海鲜为售卖的对虾。 8. 根据权利要求 3 所述的检测方法， 其特征在于， 所述的 PCR 反应， 其扩增体系为 50L， PCR Mix Buffer 25l， Taq酶5l。
9、， MgCl2 1l， 10M上、 下游引物各2l， DNA模 板 1l， 去离子水 14l， PCR 反应条件为预变性 95 5min ； 95 15s， 65 30s,， 72 30s， 45 个循环 ； 72 12min。 权 利 要 求 书 CN 102851361 A 3 1/10 页 4 沙门氏菌肠炎沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌 PCR 焦磷酸法的 检测引物试剂盒和检测方法 技术领域 0001 本发明属于生物工程技术领域， 具体涉及沙门氏菌、 肠炎沙门氏菌和鼠伤寒沙门 氏菌 PCR- 焦磷酸法的检测引物、 试剂盒和检测方法。 背景技术 ： 0002 沙门氏菌 （Salmonella， 。
10、Sa.） 是重要的食源性致病菌之一， 在世界各国细菌性食物 中毒病例中， Sa 引起的食物中毒案例常列榜首或第二位。随着分子生物学的发展， 已有针 对沙门氏菌 invA、 16s rRNA、 SpvC、 invB、 fimA、 agfA、 SEFl4、 sefA、 sdf、 ssaQ、 fimY 等基因 为目标基因， 用普通 PCR 或荧光 PCR 检测沙门氏菌的报道， 虽然这些方法可达到快速、 高通 量的目的， 但却无法获得分子诊断的黄金标准 - 基因序列， 因此有出现假阳性的可能。 0003 焦磷酸测序 （pyrosequencing） 技术是近年来发明的一项实时地进行短片段 DNA 测序。
11、技术， 该技术在 DNA 序列分析时不需要电泳和荧光标记， 直接测定引物后面的碱基序 列， 通过提供可靠的序列信息来确认 PCR 产物， 同时由于主要分析 PCR 产物双链中的一条 链的序列， 避免了由于 DNA 链的二级结构造成的人工假象， 使测序结果更加准确， 目前应用 于基因表达病毒检测、 SNP 分析、 耐药基因检测、 真菌鉴定、 DNA 甲基化分析等多个领域。焦 磷酸测序是一种基于合成的新型 DNA 测序技术， 在特异引物的引导下， 根据待测序列分别 加入四种核苷酸， 在延伸的过程中释放焦磷酸， 后者在 ATP 硫酸化酶和荧光酶的偶联反应 中释放荧光， 通过检测器检测相应的荧光强度，。
12、 从而获得检测样本中的核苷酸序列， 是一种 非常实用的短序列实时检测技术， 定量准确、 易于自动化、 能实现高通量的大样本的快速检 测， 具有 DNA 测序法无法比拟的优势， 已应用于临床微生物的分型鉴定及耐药监测。李秀娟 等以 fimy 为目的基因 用 PCR- 焦磷酸测序法从属的水平上检测 159 株不同来源的沙门氏 菌， 但该方法不能区分不同血清型沙门氏菌， 文章中也未说明检测的 159 株沙门氏菌血清 型， 其特异性有待进一步验证 （李秀娟， 田会方） 。 发明内容 ： 0004 本发明的目的是提供简便、 快捷、 准确性高、 特异性强的沙门氏菌、 肠炎沙门氏菌 和鼠伤寒沙门氏菌 PCR。
13、- 焦磷酸法的检测引物、 试剂盒和检测方法。 0005 本 发 明 根 据 沙 门 氏 菌 aceA 基 因 （GenBank:U43344.1） 、肠 炎 沙 门 氏 菌 （SE）特 异 序 列 （GenBank:AF370707.1） 、鼠 伤 寒 沙 门 氏 菌 （ST）的 STM4599 序 列 （GenBank:AERV01000023.1） ， 分别设计扩增引物和测序引物， 建立了结合 PCR- 焦磷酸测序 从 DNA 序列水平上检测沙门氏菌、 肠炎沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌的方法， 从而实现了本 发明的目的。 0006 本发明的沙门氏菌、 肠炎沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌 PCR- 焦。
14、磷酸法的检测引物， 其特征在于包括 PCR 引物和测序引物 ： 0007 针对沙门氏菌的 PCR 引物 ： 说 明 书 CN 102851361 A 4 2/10 页 5 0008 5 -TCACCGAAAGACCAACAGAA-3 ；（如 SEQ ID NO.1 所示） 0009 5 -GGTGGAACTCGCTGAAATGA-3 ；（如 SEQ ID NO.2 所示） 0010 测序引物 ： 5 -CGAAAGACCAACAGAAG-3 ；（如 SEQ ID NO.3 所示） 0011 针对肠炎沙门氏菌的 PCR 引物 ： 0012 5 -GCATGTTCTGGAAAGCCTCTTTAT-。
15、3 ；（如 SEQ ID NO.4 所示） 0013 5 -TCGTTCTTCTGGTACTTACGATGA-3 ；（如 SEQ ID NO.5 所示） 0014 测序引物 ： 5 -AAAAAGGTTTAGTAAATCAG-3 ；（如 SEQ ID NO.6 所示） 0015 针对鼠伤寒沙门氏菌的 PCR 引物 ： 0016 5 -AAGCTAAGTGTGGGGGCTAGTAT-3 ；（如 SEQ ID NO.7 所示） 0017 5 -GGGTTTGTTTTTGATGATACAGG-3 ；（如 SEQ ID NO.8 所示） 0018 测序引物 ： 5 -AGTATTGATAAATAATG。
16、GTT-3 ；（如 SEQ ID NO.9 所示） 。 0019 本发明的第二个目的是提供沙门氏菌、 肠炎沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌 PCR- 焦 磷酸法的检测试剂盒， 包括 DNA 提取试剂， PCR 反应试剂， 单链模板制备试剂， 焦磷酸测序试 剂， PCR 引物和测序引物， 其特征在于， 所述的 PCR 引物和测序引物为 ： 0020 针对沙门氏菌的 PCR 引物 ： 0021 5 -TCACCGAAAGACCAACAGAA-3 ；（如 SEQ ID NO.1 所示） 0022 5 -GGTGGAACTCGCTGAAATGA-3 ；（如 SEQ ID NO.2 所示） 0023 测序引物 。
17、： 5 -CGAAAGACCAACAGAAG-3 ；（如 SEQ ID NO.3 所示） 0024 针对肠炎沙门氏菌的 PCR 引物 ： 0025 5 -GCATGTTCTGGAAAGCCTCTTTAT-3 ；（如 SEQ ID NO.4 所示） 0026 5 -TCGTTCTTCTGGTACTTACGATGA-3 ；（如 SEQ ID NO.5 所示） 0027 测序引物 ： 5 -AAAAAGGTTTAGTAAATCAG-3 ；（如 SEQ ID NO.6 所示） 0028 针对鼠伤寒沙门氏菌的 PCR 引物 ： 0029 5 -AAGCTAAGTGTGGGGGCTAGTAT-3 ；（如 。
18、SEQ ID NO.7 所示） 0030 5 -GGGTTTGTTTTTGATGATACAGG-3 ；（如 SEQ ID NO.8 所示） 0031 测序引物 ： 5 -AGTATTGATAAATAATGGTT-3 ；（如 SEQ ID NO.9 所示） 。 0032 本发明的第三个目的是提供一种非诊断目的的沙门氏菌、 肠炎沙门氏菌和鼠伤寒 沙门氏 菌的检测方法， 其特征在于， 包括以下步骤 ： 0033 （1） 对样品进行增菌培养， 提取增菌液中菌体的基因组 DNA 作为模板 ； 0034 （2） 分别使用上述 PCR 引物分别进行 PCR 反应， 回收 PCR 产物， 制备单链模版， 然后。
19、 应用上述测序引物对相应的PCR产物进行焦磷酸测序， 自测序引物3端后的第一个碱基开 始测序， 当前30个碱基序列为GCCTGTGGGTACTTCTCCTGCCAGTATAAT时， 判断样品中含有沙门 氏菌， 当前30个碱基序列为CCTGTTGTCTGCTCACCATTCGCCAGCCAC时， 判断样品中含有肠炎沙 门氏菌， 当前30个碱基序列为TACAACCGGAGTGCACATTAATCCCGCAGC时， 判断样品中含有鼠伤 寒沙门氏菌。 0035 所述的样品可以为食品， 肉制品， 如猪肉， 和海鲜， 如售卖的对虾。 0036 优选， 所述的PCR反应， 其扩增体系为50L， PCR Mi。
20、x Buffer 25l， Taq酶5l， MgCl2 1l， 10M 上、 下游引物各 2l， DNA 模板 1l， 去离子水 14l， PCR 反应条件为预 变性 95 5min ； 95 15s， 65 30s,， 72 30s， 45 个循环 ； 72 12min。 说 明 书 CN 102851361 A 5 3/10 页 6 0037 本发明根据沙门氏菌 （Sa） aceA 基因、 肠炎沙门氏菌 （SE） 特异序列、 鼠伤寒沙门氏 菌 （ST） 的 STM4599 序列中的保守区域， 分别设计扩增引物和测序引物， 建立了 PCR- 焦磷酸 测序， 从 DNA 碱基序列水平上检测 S。
21、a、 SE 和 ST 的方法。本发明先对目标片段进行 PCR 扩 增， 保证扩增片段的特异性， 再用扩增产物制备单链模板， 在测序引物的引导下进行焦磷酸 测序。检测的所得碱基序列与已知序列比对判断结果， 即测序引物后前 30 个碱基序列为 GCCTGTGGGTACTTCTCCTGCCAGTATAAT， 判断样品中含有沙门氏菌， 测序引物后前 30 个碱基序 列为为 CCTGTTGTCTGCTCACCATTCGCCAGCCAC 和 TACAACCGGAGTGCACATTAATCCCGCAGC， 则分别 判断含有肠炎沙门氏菌 （SE） 和鼠伤寒沙门氏菌 （ST） 。PCR 扩增实验结果， aceA。
22、、 SE 和 ST 扩增引物具有较好的特异性， 24株不同血清型Sa、 16株SE和6株ST分别扩增出大小81bp、 176bp 和 131bp 的 DNA 片段， 而其他对照菌株未扩增出 DNA 条带。焦磷酸测序结果显示， 24 株 Sa、 16 株 SE 和 6 株 ST 的测序有效 DNA 碱基数分别为 31bp-36bp、 31bp-39bp、 34bp-36bp， 均超过需检测的 30bp DNA 碱基序列， 而其他对照菌株未测出 DNA 碱基序列。模拟样品检测 结果， 焦磷酸测序法与传统检测方法一致， 但在检测周期上， 传统方法需要培养、 划线分离、 生化鉴定、 血清分型等， 需要。
23、 5d-6d， 而焦磷酸测序方法 BP 第一次增菌 10h， TTB 第二次增菌 18h， 核酸提取、 PCR 扩增和焦磷酸测序 3h， 整个试验 31h 完成， 简便快捷， 而且可通过 DNA 碱 基序列从属的水平上检测沙门氏菌的同时可对其分型， 判定所检测 Sa 是否为 SE 和 ST 血清 型， 避免了单纯 PCR 扩增检测易污染造成的假阳性结果， 准确性高。因此本发明具有较好的 应用前景。 附图说明 ： 0038 图 1 是 24 株 Sa 的 aceA 扩增产物电泳图， 其中 M ： 50bp marker， 1 ： SE ATCC13076， 2 ： ST ATCC14028， 3。
24、-24 ： Sa1-Sa22 ； 0039 图 2 是 Sa 的 aceA 特 异 性 实 验 扩 增 产 物 电 泳 图， 其 中 M ： 50bp maker， 1 ： SE ATCC13076， 2 ： ST ATCC14028， 3 ： 阪崎肠杆菌 ATCC29544， 4 ： 大肠杆菌 ATCC25922， 5 ： 小肠结 肠炎耶尔森氏菌 CMCC52221， 6 ： 金黄色葡萄球菌 ATCC6538， 7 ： 痢疾志贺氏菌 NICPBP51252， 8 ： 单增李斯特菌 ATCC19115， 9 ： 肺炎克雷伯氏菌 CMCC46102， 10: 去离子水 ； 0040 图 3 是 。
25、SE 的 扩 增 产 物 电 泳 图，其 中 M ： 50bpmaker， 1 ： SE ATCC13076， 2-16 ： SE1-SE15， 17 ： 去离子水 ； 0041 图 4 是 SE 特异性实验扩增产物电泳图， 其中 M ： 50bp maker， 1 ： SE ATCC13076， 2 ： ST ATCC14028， 3 ： 阪崎肠杆菌ATCC29544， 4 ： 大肠杆菌ATCC25922， 5 ： 小肠结肠炎耶尔森氏 菌 CMCC52221， 6 ： 金黄色葡萄球菌 ATCC6538， 7 ： 痢疾志贺氏菌 NICPBP51252， 8 ： 单增李斯特 菌 ATCC1911。
26、5， 9 ： 肺炎克雷伯氏菌 CMCC46102， 10: 去离子水 ； 0042 图 5 是 SE 特异性实验扩增产物电泳图， 其中 M ： 50bp maker， 1 ： SE ATCC13076， 2-23 ： Sa1-Sa22， 24 ： 去离子水 ； 0043 图 6 是 ST 扩增产物电泳图， 其中 M ： 50bp maker， 1 ： ST ATCC14028， 2-6 ： ST1-ST5， 7 ： 去离子水 ； 0044 图 7 是 ST 特异性实验扩增产物电泳图， 其中 M ： 50bp maker， 1 ： ST ATCC14028， 2 ： SE ATCC13076， 。
27、3 ： 阪崎肠杆菌 ATCC29544， 4 ： 大肠杆菌 ATCC25922， 5 ： 小肠结肠炎耶尔森氏 菌 CMCC52221， 6 ： 金黄色葡萄球菌 ATCC6538， 7 ： 痢疾志贺氏菌 NICPBP51252， 8 ： 单增李斯特 说 明 书 CN 102851361 A 6 4/10 页 7 菌 ATCC19115， 9 ： 肺炎克雷伯氏菌 CMCC46102， 10 ： 副溶血性弧菌 ATCC33847,11 ： 去离子水 ； 0045 图 8 是 ST 特异性实验扩增产物电泳图， 其中 M ： 50bp maker， 1 ： ST ATCC14028， 2-23 ： Sa。
28、1-Sa22， 24 ： 去离子水 ； 0046 图 9 是 Sa3 焦磷酸测序结果图 ； 0047 图 10 是阴性对照 （单增李斯特氏菌） 焦磷酸测序结果图 ； 0048 图 11 是 SE2 焦磷酸测序结果图 ； 0049 图 12 是 ST2 焦磷酸测序结果图 ； 具体实施方式 ： 0050 以下实施例是对本发明的进一步说明， 而不是对本发明的限制。 0051 实施例 1 ： 0052 1、 材料和方法 0053 1.1 菌株来源 0054 24 种不同血清型沙门氏菌 44 株， 其中 SE、 ST 标准菌株各 1 株， 不同食品中分离 的非 SE、 非 ST 不同血清型 Sa25 株。
29、， SE 分离株 15 株， ST 分离株 5 株， 菌株信息见表 1。阴 性对照菌株 8 株， 分别为单增李斯特菌 ATCC19115、 金黄色葡萄球菌 ATCC6538、 阪崎肠杆 菌 ATCC29544、 大肠杆菌 ATCC25922、 痢疾志贺氏菌 NICPBP51252、 小肠结肠炎耶尔森氏菌 CMCC52221、 肺炎克雷伯氏菌 CMCC46102、 副溶血性弧菌 ATCC33847。上述菌株来自中国普通 微生物菌种保藏管理中心、 广东省疾病预防控制中心、 中国检验检疫科学研究院、 广东出入 境检验检疫局技术中心。所有菌株均经 VITEK2 和 API 试剂条以及血清学实验进行确证。
30、。 0055 表 1 ： 沙门氏菌 （Sa） 菌株信息 0056 说 明 书 CN 102851361 A 7 5/10 页 8 0057 0058 1.2 主要仪器和试剂 0059 焦磷酸测序 PyroMark lD 系统 - 瑞典 Biotage 公司 ； PCR 扩增仪 - 美国伯乐 2400 型 ； 核酸提取仪 - 日本 PSS 公司 ； PCR 用 Buffer、 dNTP、 琼脂糖、 PCR 分子量标记 （50-500bp） Taq 酶 - 宝生物工程 ( 大连 ) 有限公司 ； 缓冲蛋白胨水 （BP） 、 TTB 增菌液 - 北京陆桥有限公 司。 0060 1.3 引物和探针设计。
31、 0061 根据 GenBank 公布的 Sa aceA gene（序列号 :GenBank:U43344.1） ， SE 特异序列 （GenBank:AF370707.1） ， ST 的 STM4599 序列 （GenBank:AERV01000023.1） 中的保守区域， 用 PyroMark Assay Design2.0 软件设计 PCR 引物和测序引物， 每对下游引物 5/ 端标记生物 素， 委托大连宝生物有限公司合成。沙门氏菌 (Sa)aceA 基因、 SE 和 ST 扩增 PCR 引物和测 序引物设计见表 2。 0062 表 2 ： 沙门氏菌引物和测序引物序列 0063 说 明 。
32、书 CN 102851361 A 8 6/10 页 9 0064 1.4 模板制备 0065 所有菌株均用 BP 缓冲蛋白胨水 37培养 10h， 取 10ml 接种于 TTB 增菌液， 44.5 培养 18h， 取 1ml 菌悬液移入离心管， 12000r/min 离心 8min 去上清， 用 1ml 去离子水漂浮沉 淀， 12000r/min 离心 5min 去上清， 重复两次， 最后加 200l 去离子水在核酸提取仪上提取 DNA， 用于 PCR 扩增。 0066 1.5PCR 扩增体系及电泳参数 0067 扩增体系 50L， PCR Mix Buffer 25l， Taq 酶 5l， 。
33、MgCl2 1l， 10M 上、 下游 引物各 2l（每个细菌或者样品分别应用上述针对 Sa aceA gene、 SE 和 ST 的 PCR 引物分 别进行PCR扩增） ， DNA模板1l， 去离子水14l。 循环参数为预变性955min ； 9515s， 65 30s,， 72 30s， 45 个循环 ； 72 12min， 4保存。PCR 产物一部分在 2% 琼脂糖凝胶上 电泳， 另一部分用于焦磷酸测序。 0068 1.6 单链模板制备及焦磷酸测序 0069 将 15l PCR 产物转移至 96 孔 PCR 板中， 加入 2l 磁珠 （sepharose beads） ， 20l 结合缓。
34、冲液 (Binding Buffer) 和 43l 纯水， 常温震荡混 20min ； 打开真空泵， 将真 空预装工具 prep tool 在高纯水中清洗 30 秒， 然后将 prep tool 移到 96 孔 PCR 板中， 抓取 其中的磁珠， 待磁珠基本抓取完毕后将携带有磁珠的prep tool放入70乙醇中5秒， 再分 别在变性缓冲液Denaturation Buffer和洗涤缓冲液Washing Buffer中各清洗20s30s。 再 prep tool 放在装有退火预混液 PSQ96( 预先加入 43l 退火缓冲液 Annealing Buffer 和 2l 10M 测序引物， 相对。
35、应的 PCR 产物用相对应的测序引物） 板的上方， 关掉真空泵， 轻轻摇动释放磁珠， 将 PSQ96 板在 80放置 5min， 自然冷却至室温。测序程序采用 SQA 模 式， 按ATCG的碱基排列顺序， 依次循 环加入15次， 根据软件给出的剂量在试剂仓中加入底 物混合物、 酶混合物和 4 种脱氧核糖核苷酸， 将 PSQ96 孔板和试剂仓放入 PyroMark lD 系统 中进行焦磷酸测序。 0070 1.7 模拟样品检测 0071 用均质袋分别秤取 25g 猪肉、 对虾， 每份样品中加入 225ml 缓冲蛋白冻水， 分别加 说 明 书 CN 102851361 A 9 7/10 页 10 。
36、入 1ml 已调好浓度的 102 cfu/ml SE ATCC13076 和 ST ATCC14028 菌悬液， 用拍打器拍打 20min， 37培养 10h， 取 10ml 移入 90ml TTB 增菌液， 44.5培养 18h， 然后取一部分按上述 步骤提取 DNA 进行 PCR- 焦磷酸法检测， 另一部分按 GB4789.4-2010食品卫生微生物检验 沙门氏菌 继续进行检测。 0072 2 结果与分析 0073 2.1PCR 扩增结果 0074 Sa aceA基因的PCR扩增结果， 24株不同血清型沙门氏菌， 即SE、 ST标准株各1株、 22 株不同血清型沙门氏菌 Sa1-Sa22 。
37、均扩增出 81bp 大小的 DNA 片段 （图 1） ， 而单增李斯特 菌 ATCC19115、 金黄色葡萄球菌 ATCC6538、 阪崎肠杆菌 ATCC29544、 大肠杆菌 ATCC25922、 痢 疾志贺氏菌 NICPBP51252、 小肠结肠炎耶尔森氏菌 CMCC52221、 肺炎克雷伯氏菌 CMCC46102 7 株对照菌株未见扩增条带 （图 2） ； SE 的 PCR 扩增结果， 1 株 SE 标准株和 SE1-SE15， 共 16 株 SE 均扩增出 176bp 大小的 DNA 片段 （图 3） ， 而 ST ATCC14028、 单增李斯特菌 ATCC19115、 金黄色葡萄球。
38、菌 ATCC6538、 阪崎肠杆菌 ATCC29544、 大肠杆菌 ATCC25922、 痢疾志贺氏菌 NICPBP51252、 小肠结肠炎耶尔森氏菌 CMCC52221、 肺炎克雷伯氏菌 CMCC46102 7 株对照 菌株以及 Sa1-Sa22 均未出见扩增条带 （图 4， 图 5） ； ST 的 PCR 扩增结果， 1 株 ST 标准株和 ST1-ST5， 6 株 ST 均扩增出 131bp 大小的 DNA 片段 （图 6） ， 而 SE ATCC13076、 单增李斯特菌 ATCC19115、 金黄色葡萄球菌 ATCC6538、 阪崎肠杆菌 ATCC29544、 大肠杆菌 ATCC25。
39、922、 痢疾 志贺氏菌 NICPBP51252、 小肠结肠炎耶尔森氏菌 CMCC52221、 肺炎克雷伯氏菌 CMCC46102、 副 溶血性弧菌ATCC33847 8株对照株以及Sa1-Sa22均未见扩增带 （图7， 图8） ， 表明Sa aceA、 SE 及 ST 的 PCR 引物具有较好的特异性。 0075 2.2 焦磷酸测序结果 0076 24株Sa焦磷酸测序结果， 即SE、 ST标准株各1株和Sa1-Sa25， 分别测出33bp-36bp 大小的 DNA 碱基序列 （表 3、 图 9， 本发明只列出 Sa3 的焦磷酸测序结果图） ， 而单增李斯特 菌 ATCC19115、 金黄色葡。
40、萄球菌 ATCC6538、 阪崎肠杆菌 ATCC29544、 大肠杆菌 ATCC25922、 痢 疾志贺氏菌 NICPBP51252、 小肠结肠炎耶尔森氏菌 CMCC52221、 肺炎克雷伯氏菌 CMCC46102 7 株对照株未测出 DNA 碱基序列 （图 10， 只列出单增李斯特氏菌测序图） 。SE 焦磷酸测序 结果测出 39bp-43bp 大小的 DNA 碱基序列 （表 4， 图 11， 只列出 SE2 的焦磷酸测序结果图） ； ST 焦磷酸测序结果测出 36bp-38bp 大小的 DNA 碱基序列 （表 5、 图 12， 只列出 ST2 的焦磷 酸测序结果图） ， 而在 SE 和 ST。
41、 焦磷酸测序中发现， 23 株不同血清型 Sa 和单增李斯特菌 ATCC19115、 金黄色葡萄球菌 ATCC6538、 阪崎肠杆菌 ATCC29544、 大肠杆菌 ATCC25922、 痢疾 志贺氏菌 NICPBP51252、 小肠结肠炎耶尔森氏菌 CMCC52221、 肺炎克雷伯氏菌 CMCC46102、 副 溶血性弧菌 ATCC33847 8 株对照株均未测出 DNA 序列。Sa、 SE、 ST 测序 DNA 碱基序列分别 与表 3、 图 4、 图 5 中测序引物后的 DNA 序列比对， 发现比对结果完全吻合的 DNA 碱基数分 别为 31bp-36bp、 31bp-39bp、 34bp。
42、-36bp， 所有测序结果均超过 30 个碱基， 表明 3 条测序引 物的特异性均较好， 并且可用测序引物序列后的 GCCTGTGGGT A CTTCTCCTG CCAGTATAAT、 CCTGTTGTCTGCTCACCATTCGCCAGCCAC和TACAACCGGA GTGCACATTA AT CCCGCAGC碱基序列特异 性地检测 Sa、 SE 和 ST。 0077 焦磷酸测序是测序引物 3 端后的第一个碱基开始测序， 用 NCBI 的 BLAST 功能反 复比对时发现， Sa aceA、 SE 和 ST 测序引物后的 30 个 DNA 碱基序列可分别鉴定 Sa、 SE 和 说 明 书 C。
43、N 102851361 A 10 8/10 页 11 ST。判断原则为 ： 碱基序列为 GCCTGTGGGTACTTCTCCTGCCAGTATAAT 则判断为 Sa， 碱基序列为 CCTGTTGTCTGCTCACCATTCGCCAGCCAC 和 TACAACCGGA GTGCACATTA ATCCCGCAGC， 判断为 SE 和 ST。 0078 表 3 ： 沙门氏菌测序检测结果 0079 0080 说 明 书 CN 102851361 A 11 9/10 页 12 0081 表 4 ： SE 焦磷酸测序结果 0082 0083 说 明 书 CN 102851361 A 12 10/10 页 。
44、13 0084 表 5 ： ST 焦磷酸测序结果 0085 0086 2.3 模拟样品焦磷酸测序检测结果， 添加 SE ATCC13076、 ST ATCC14028 的 猪 肉、 对 虾 样 品， 分 别 用 针 对 沙 门 氏 菌 的 PCR 引 物 ： 5 -TCACCGAAAGACCAACAGAA-3 ； 5 -GGTGGAACTCGCTGAAATGA-3 ； 测序引物 ： 5 -CGAAAGACCAACAGAAG-3 。针对肠炎沙门氏 菌的 PCR 引物 ： 5 -GCATGTTCTGGAAAGCCTCTTTAT-3 ； 5 -TCGTTCTTCTGGTACTTACGATGA-3 ；。
45、 测 序 引 物 ： 5 -AAAAAGGTTTAGTAAATCAG-3 。 针 对 鼠 伤 寒 沙 门 氏 菌 的 PCR 引 物 ： 5 -AAGCTAAGTGTGGGGGCTAGTAT-3 ； 5 -GGGTTTGTTTTTGATGATACAGG-3 ； 测序引物 ： 5 -AGTATTGATAAATAATGGTT-3 。分别按照上述方法进行 PCR- 焦磷酸反应。结果显示， 添 加 SE ATCC13076 的样品 （猪肉和对虾样品） 扩增出 CCTGTTGTCT GCTCACCATT CGCCAGCCAC CACCTCGAG（针对 SE） 和 GCCTGTGGGT ACTTCTCCT。
46、G CCAGTATAAT TTCAGG（针对 Sa） ， 添加 ST 14028 的样品 （猪肉和对虾样品） 扩增出 TACAACCGGA GTGCACATTA ATCCCGCAGC GTAAAGAC （针对 ST） 和 GCCTGTGGGT ACTTCTCCTG CCAGTATAAT TTCAGG（针对 Sa） 。由此可见， 样品中 检测出与预期相符的 SE 和 ST 的 DNA 碱基序列， 即 CCTGTTGTCTGCTCACCATTCGCCAGCCAC 和 TACAACCGGA GTGCACATTA AT CC CGCAGC， 同时 4 份样品中也检测出 Sa aceA 基因 DNA 碱。
47、基 序列， GCCTGTGGGT ACTTCTCCTG CCAGTATAAT。按照 GB4789.4-2010食品微生物学检验沙 门氏菌检验 检测的模拟样品， 均分离鉴定出与添加的菌株相符的 SE、 ST， 结果与本发明的 PCR- 焦磷酸法的结果一致。 说 明 书 CN 102851361 A 13 1/3 页 14 0001 序 列 表 CN 102851361 A 14 2/3 页 15 0002 0003 序 列 表 CN 102851361 A 15 3/3 页 16 序 列 表 CN 102851361 A 16 1/3 页 17 图 1 图 2 图 3 图 4 说 明 书 附 图 CN 102851361 A 17 2/3 页 18 图 5 图 6 图 7 图 8 说 明 书 附 图 CN 102851361 A 18 3/3 页 19 图 9图 10 图 11图 12 说 明 书 附 图 CN 102851361 A 19 。