汉防己碱在制备防治肝脏损伤的药物中的用途.pdf

本发明公开了一种汉防己碱的用途，用于制备抑制趋化因子表达的组合物以及防治肝损伤。本发明首次发现了汉防己碱在防治肝炎或肝损伤方面的新用途，其药理作用强，且没有毒副作用，具有极好的药用前景。并且，所述的汉防己碱可以直接提取自植物中，在毒性低，服用方便的同时，还具有来源丰富，价格低廉，制备工艺简单的优点。

权利要求书
1.  一种汉防己碱的用途，其特征在于，用于制备抑制趋化因子表达的组合物。

2.  如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的趋化因子是干扰素诱导蛋白10或巨噬细胞炎性蛋白1-α。

3.  如权利要求1或3所述的用途，其特征在于，所述的趋化因子的高表达导致肝损伤。

4.  如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的组合物用于抑制NF-κB的活性。

5.  如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的组合物用于降低血清中肿瘤坏死因子-α、γ-干扰素、白介素-4、或白介素-12的含量。

6.  如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的汉防己碱选自下组：
(a)汉防己碱纯净物；
(b)含汉防己碱的提取物；或
(c)含成分(a)和/或(b)且汉防己碱浓度大于1％的混合物。

7.  一种汉防己碱的用途，其特征在于，用于制备预防或治疗肝损伤的组合物。

8.  如权利要求7所述的用途，其特征在于，所述的肝损伤为肝炎。

9.  如权利要求7所述的用途，其特征在于，所述的肝损伤是由趋化因子的高表达引起的。

10.  一种预防或治疗肝损伤、或抑制趋化因子表达的方法，其特征在于，包括步骤：给需要的对象施用有效量的汉防己碱。

说明书汉防己碱在制备防治肝脏损伤的药物中的用途
技术领域
本发明属于药学领域，具体涉及汉防己碱在制备防治肝炎和肝损伤的药物中的用途。
背景技术
肝炎是严重危害人类健康的重大疾病，从病因看，肝炎主要分为：病毒性肝炎，酒精性肝炎，自身免疫性肝炎等。肝炎特别是病毒性肝炎在中国的发病率持续在较高水平，就乙型肝炎来说，全世界共有20亿人感染乙肝病毒，其中6.9亿在中国，全球有乙肝病毒表面抗原(HBsAg)携带者3.5亿人，其中三分之一在中国；全世界每年有75万人死于乙肝病毒感染引起的疾病，其中28万人来自中国。
汉防己碱(Tetrandrine，简称Tet)是从中草药汉防己的根块中提取的双苄基异喹啉类生物碱，是汉防己的主要有效成份。以往的研究发现，汉防己碱具有钙拮抗作用，其可阻断50％以上的跨膜钙离子内流；汉防己碱具有扩张血管的作用，可用作降血压药；汉防己碱具有促进睡眠的功效；汉防己碱可与甘草酸或丹参联用治疗肝纤维化；汉防己碱可能是一种有效的抗肿瘤药物，并且其对于糖尿病也可能有一定的防治作用。
此外，也有报道指出汉防己碱具有抗炎和免疫抑制作用，对于一些炎症有一定的抑制作用，现有已知主要将汉防己碱用于治疗类风湿性关节炎等相关炎症性疾病。
然而，现有技术中还没有将汉防己碱用于肝炎的防治。并且，人体各个器官或组织的炎症机制也不尽相同，针对各个器官或组织的炎症治疗药物也不尽相同。因此有必要进一步研究汉防己碱的抗炎机制，特别是对于特定器官或组织，从而将之真正用于疾病的治疗。
发明内容
本发明的目的在于提供一种汉防己碱在制备防治肝炎和肝损伤的药物、或抑制趋化因子表达的药物中的用途。
在本发明的第一方面，提供一种汉防己碱的用途，用于制备抑制趋化因子表达的组合物。
在本发明的一个优选例中，所述的趋化因子是干扰素诱导蛋白10(IP-10)或巨噬细胞炎性蛋白1-α(MIP1-α)。
在本发明的另一优选例中，所述的趋化因子的高表达导致肝损伤。
在本发明的另一优选例中，所述的组合物用于抑制NF-κB的活性。
在本发明的另一优选例中，所述的组合物用于降低血清中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、γ-干扰素(γ-IFN)、白介素-4(IL-4)、或白介素-12(IL-12)的含量。
在本发明的另一优选例中，所述的汉防己碱选自下组：
(a)汉防己碱纯净物；
(b)含汉防己碱的提取物；或
(c)含成分(a)和/或(b)且汉防己碱浓度大于1％的混合物。
在本发明的第二方面，提供一种汉防己碱的用途，用于制备预防或治疗肝损伤的组合物。
在本发明的另一优选例中，所述的肝损伤为肝炎。
在本发明的另一优选例中，所述的肝损伤是由趋化因子的高表达引起的。
在本发明的第三方面，提供一种预防或治疗肝损伤、或抑制趋化因子表达的方法，包括步骤：给需要的对象施用有效量(如0.001-50wt％；更佳地0.01-20wt％)的汉防己碱。
本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
附图说明
图1显示了对对照组和汉防己碱处理组小鼠的诱导CIH及取样流程。
图2显示了汉防己碱对于CIH小鼠谷丙转氨酶活性的影响，可见汉防己碱能够显著降低CIH小鼠的谷丙转氨酶活性。其中，与对照组相比，**P＜0.01。
图3A为PBS处理组小鼠H&E染色结果，图3B为汉防己碱处理组小鼠H&E染色结果，图3C为PBS处理组小鼠TUNEL染色结果，图3D为汉防己碱处理组小鼠TUNEL染色结果。其中，图3A和图3B放大100倍，图3C和图3D放大200倍。
图4A为ConA注射2小时后取小鼠血清，采用ELISA法检测血清中肿瘤坏死因子-α的浓度；图4B-D为ConA注射8小时后取小鼠血清，采用ELISA法检测血清中肿γ-干扰素，白介素-4，白介素-12的浓度，汉防己碱处理组小鼠血清中多种炎性细胞因子的含量显著低于对照组。其中，与对照组相比，**P＜0.01，***P＜0.001。
图5显示了汉防己碱对于肝脏中趋化因子IP-10和MIP1-α的基因表达的影响。图5A为实时定量PCR检测趋化因子IP-10的表达水平的结果；图5B为实时定量PCR检测趋化因子MIP1-α的表达水平的结果。
图6显示了汉防己碱对于NF-κB活化的影响，可见汉防己碱处理组NF-κB的活性显著低于对照组(PBS组)。
具体实施方式
本发明人经过长期而广泛的研究，意外地发现汉防己碱对于防治肝炎或肝脏损伤具有极其优异的效果，且没有任何副作用。并且，所述的汉防己碱可抑制炎症中趋化因子干扰素诱导蛋白10(IP-10)或巨噬细胞炎性蛋白1-α(MIP1-α)的表达，从而可避免炎症中由于趋化因子的过度释放而导致的过度免疫反应、或细胞或组织功能障碍。基于此完成了本发明。
汉防己碱
汉防己碱(Tetrandrine，简称Tet)，是一种双苄基异喹啉类生物碱，是中药汉防己的主要有效成份，其化学式为6，6’7，12-四甲氧基-2，2’-二甲基berbaman，结构式为：

在本发明中，所述的“汉防己碱”可以是纯净形式存在的式I所示的化合物，或纯度大于85％的式I所示的化合物，也可以是含有1-90wt％，更佳地5-85wt％的汉防己碱或其衍生物的汉防己碱的提取物(如汉防己的根块提取物)。该术语还包括汉防己碱的浓度大于1％的混合物。
所述的汉防己碱可提取自任何含有汉防己碱或其衍生物(如盐或酯)的植物中，所述的植物包括但不限于：汉防己(Stephania tetrandra)、毛叶轮环藤(Cycleabarbata Miers)、密花轮环藤(Cyclea densiflora)、夜花藤(Hypserpa nitidaMiers)、金线吊乌龟(Stepahania cepharantha Hayata)、海南地不容(StephaniaeHainanensis)、蝙蝠葛(Menispermum dauricum DC)等。优选的，其可从中药汉防己中提取获得。
此外，所述的汉防己碱也可通过化学合成的方式获得。
在本发明中，还包括汉防己碱的药学上可接受的盐。所述的“药学上可接受的盐”是指汉防己碱与无机酸或有机酸反应生成的盐。
可将汉防己碱的植物提取物直接给药；或者可将汉防己碱的植物提取物进行提纯和加工，制成纯净形式的汉防己碱、或各种形式的汉防己碱的制剂后，用于给药。
用途
本发明提供了汉防己碱、其药学上可接受的盐或汉防己碱的植物提取物的用途，用于制备预防或治疗哺乳动物肝炎或肝损伤的组合物；或者，用于制备抑制趋化因子表达的组合物。
为了论证汉防己碱的上述用途，本发明人以ConA诱导的肝炎模型(ConA(刀豆素)induced hepatitis，CIH)作为研究模型，该肝炎模型是一种T细胞介导的肝炎模型，主要用作免疫介导的肝脏损伤的机理研究和保肝药物作用机理的研究。在模型被诱导后8到24小时，血清谷丙转氨酶活性急剧增加，HE染色可见肝脏正常结构被破坏，大量的肝实质细胞凋亡死亡，呈TUNEL阳性。
本发明利用汉防己碱，在CIH模型上证实了其对免疫介导的肝损伤有显著的保护作用，汉防己碱可以使CIH小鼠血清谷丙转氨酶(ALT)的活性降低到100U/L以下(正常小鼠ALT值约为50U/L，CIH小鼠ALT平均值在5000U/L以上)，而其他已有报道的有类似作用的化合物可以将CIH的ALT值降低到1000U/L左右。
肝脏的病理分析也显示，在汉防己碱处理组小鼠几乎看不到明显的肝脏正常结构的破坏和TUNEL阳性的凋亡细胞。
本发明人的深入研究表明，汉防己碱对免疫介导的肝损伤的保护作用的机理是其对NF-κB信号通路激活的抑制，导致介导肝损伤的多种炎性细胞因子，包括γ干扰素和肿瘤坏死因子α表达的显著下降，从而保护肝脏免受损伤。
本发明人的深入研究还表明，汉防己碱可显著抑制炎症机制中趋化因子(包括：干扰素诱导蛋白10(IP-10)或巨噬细胞炎性蛋白1-α(MIP1-α))的表达。趋化因子在炎症中起着将其它免疫细胞向炎症中心趋化的作用，然而其过度表达，会导致过激的免疫反应及趋化过多的免疫细胞，从而使得体内器官组织受到损伤，造成高致病性及增加死亡率。因此，抑制趋化因子的表达可抑制过激的免疫反应发生。
组合物
如本文所用，术语“本发明的组合物”包括药物组合物和饮食补充剂(如保健品组合物)，只要它们含有汉防己碱作为预防或治疗哺乳动物代谢综合症的活性成分。
通常，所述的饮食补充剂含有0.001-50wt％的汉防己碱或其药学上可接受的盐；(b)食品上可接受的载体或赋形剂。
本发明还提供了一种药物组合物，含有：(a)有效量的汉防己碱或其药学上可接受的盐；以及(b)药学上可接受的载体或赋形剂。
本发明中，术语“含有”表示各种成分可一起应用于本发明的混合物或组合物中。因此，术语“主要由...组成”和“由...组成”包含在术语“含有”中。
本发明中，“药学上可接受的”成分是适用于人和/或动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)即有合理的效益/风险比的物质。
本发明中，“药学上可接受的载体”是用于将本发明的汉防己碱或其生理上可接受的盐传送给动物或人的药学上或食品上可接受的溶剂、悬浮剂或赋形剂。载体可以是液体或固体。
从易于制备和给药的立场看，优选的药物组合物是固态组合物，尤其是片剂和固体填充或液体填充的胶囊。药物组合物的口服给药是优选的。
本发明所述的药物组合物的剂型可以是多种多样的，只要是能够使活性成分有效地到达哺乳动物体内的剂型都是可以的。比如可选自：片剂、胶囊、粉末、颗粒、糖浆、溶液、悬浮液、或气雾剂。其中汉防己碱可以存在于适宜的固体或液体的载体或稀释液中。
本发明的汉防己碱及其组合物也可储存在适宜于注射或滴注的消毒器具中。通常，在本发明的药物组合物中，汉防己碱作为活性成分占总重量的1-50％(较佳地2-40％，更佳地3-30％)，其余为药学上可接受的载体以及其他添加剂等物质。
给药方式和剂型
本发明的药物组合物可以通过常规方法制成任何常规的制剂形式。
通常，当所述化合物或其药学上可接受的盐及其组合物用于上述用途时，它们可与一种或多种药学上可接受的载体或赋形剂混合，如溶剂、稀释剂等，而且可以用如下形式口服给药：片剂、胶囊、可分散的粉末、颗粒或悬浮液(含有如约0.05-5％悬浮剂)、糖浆(含有如约10-50％糖)、和酏剂(含有约20-50％乙醇)，或者以无菌可注射溶液或悬浮液形式(在等渗介质中含有约0.05-5％悬浮剂)进行非肠胃给药。例如，这些药物制剂可含有与载体混合的约25-90％，通常约为5-60％(重量)的活性成分。
所用的活性成分的有效剂量可随所用的化合物、给药的模式和待治疗的疾病的严重程度而变化。然而，通常当本发明的化合物每天以约1-300mg/kg动物体重的剂量给予时，能得到令人满意的效果，较佳地每天以1-3次分开的剂量给予，或以缓释形式给药。对大部分大型哺乳动物而言，每天的总剂量约为5-1000mg，较佳地约为10-500mg。适用于内服的剂量形式，包含与固态或液态药学上可接受的载体密切混合的约1-200mg的活性化合物。可调节此剂量方案以提供最佳治疗应答。例如，由治疗状况的迫切要求，可每天给予若干次分开的剂量，或将剂量按比例地减少。
所述化合物或其药学上可接受的盐及其组合物可通过口服以及静脉内、肌内或皮下等途径给药；优选的是口服给药。固态载体包括：淀粉、乳糖、磷酸二钙、微晶纤维素、蔗糖和白陶土，而液态载体包括：无菌水、聚乙二醇、非离子型表面活性剂和食用油(如玉米油、花生油和芝麻油)，只要适合活性成分的特性和所需的特定给药方式。在制备药物组合物中通常使用的佐剂也可有利地被包括，例如调味剂、色素、防腐剂和抗氧化剂如维生素E、维生素C、BHT和BHA。
所述活性化合物或其药学上可接受的盐及其组合物也可肠胃外或腹腔内给药。也可在适当混合有表面活性剂(如羟丙基纤维素)的水中制备这些活性化合物(作为游离碱或药学上可接受的盐)的溶液或悬浮液。还可在甘油、液体、聚乙二醇及其在油中的混合物中制备分散液。在常规储存和使用条件下，这些制剂中含有防腐剂以防止微生物的生长。
适应于注射的药物形式包括：无菌水溶液或分散液和无菌粉(用于临时制备无菌注射溶液或分散液)。在所有情况中，这些形式必须是无菌的且必须是流体以易于注射器排出流体。在制造和储存条件下必须是稳定的，且必须能防止微生物(如细菌和真菌)的污染影响。载体可以是溶剂或分散介质，其中含有如水、醇(如甘油、丙二醇和液态聚乙二醇)、它们的适当混合物和植物油。
汉防己碱或其药学上可接受的盐及其组合物还可与其它活性成分或药物联合给药。
当两种或两种以上的药物联合给药时，一般具有优于两种药物分别单独给药的效果。
汉防己碱及其药学上可接受的盐的制备方法
汉防己碱的制备方法可采用本领域现有技术人员所了解的方法，比如化学合成的方法，或从植物中提取的方法。优选的，可采用从植物中提取汉防己碱的方法。
本发明的主要优点在于：
(1)首次发现了汉防己碱在防治肝炎或肝损伤方面的新用途，其药理作用强，且没有毒副作用，具有极好的药用前景。
(2)所述的汉防己碱可以直接提取自植物中，在毒性低，服用方便的同时，还具有来源丰富，价格低廉，制备工艺简单的优点。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室指南(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
实施例1  汉防己碱的配制及注射
1.汉防己碱注射剂的配制
配制汉防己碱注射液，方法如下：取100mg购自陕西慧科植物开发有限公司公司的汉防己碱(纯度98％以上)固体粉末，加入0.1M盐酸至溶解，然后将溶解后形成的溶液加入到PBS中至终浓度为20mg/ml，制成汉防己碱的注射剂。
2.实验分组和注射
选用C57b1/6小鼠(购自上海斯莱克实验动物有限责任公司)作为试验对象，将小鼠进行随机分组，每组3-5只小鼠，建立对照组和汉防己碱处理组1和汉防己碱处理组2。
其中，对照组用PBS腹腔注射小鼠，汉防己碱处理组1用25mg/kg体重的汉防己碱腹腔注射小鼠，汉防己碱处理组2用50mg/kg体重的汉防己碱腹腔注射小鼠。
在距离第一次注射4小时后，进行第二次注射，即对照组用PBS腹腔注射小鼠，汉防己碱处理组1用25mg/kg体重的汉防己碱腹腔注射小鼠，汉防己碱处理组2用50mg/kg体重的汉防己碱腹腔注射小鼠。
随后，所有的小鼠由尾静脉注射15mg/kg体重的ConA(购自Vector公司)，诱导CIH，最后，在不同的时间点处死小鼠，获取样品。用于评价汉防己碱的治疗效果的标本包括血清，肝脏组织切片，以及肝脏组织RNA等，上述流程也可参见图1。
实施例2汉防己碱对于CIH小鼠谷丙转氨酶(ALT)活性的影响
本实施例中，对小鼠的处理如实施例1所述，在所有的小鼠由尾静脉注射剂量为15mg/kg的ConA 17小时后，取小鼠血清测定谷丙转氨酶活性，采用上海伊华医学科技有限公司生产的血清谷丙转氨酶活性测定试剂盒，按照说明书操作。简要步骤如下：血清适当稀释后，取25微升加至96孔板，加入100微升酶工作液，37摄氏度孵育15分钟，加入150微升终止液，酶标仪492nm读数，根据试剂盒提供的标准血清和稀释倍数计算谷丙转氨酶活性数值。
数据以平均数±标准差的形式表示，测得的数据为PBS组5783±368，25mg/kg组671±27，50mg/kg组75±18，见图2，图2代表了3次试验的结果的平均值(**P＜0.01)。
由结果可知，小鼠在给予25mg/kg汉防己碱时，血清谷丙转氨酶活性比对照组降低了约90％，在给予50mg/kg汉防己碱剂量时，血清谷丙转氨酶活性由接近6000U/L骤降至约100U/L(正常小鼠的血清谷丙转氨酶活性约为50U/L)，也即接近于正常值。
因此，汉防己碱能够显著降低CIH小鼠的谷丙转氨酶活性。
实施例3  肝脏组织切片染色
本实施例中，对小鼠的处理如实施例1所述，在所有的小鼠由尾静脉注射剂量为15mg/kg的ConA 17小时后，取小鼠的肝脏组织，制备切片，进行常规的H&E染色或者TUNEL染色。结果见图3A-图3D。
图3A为PBS处理组小鼠H&E染色结果，其中可观察到肝脏组织的出现大面积坏死现象，正常结构被严重破坏。
图3B为汉防己碱处理组(50mg/kg组)小鼠H&E染色结果，未见肝脏组织出现大面积坏死现象，肝脏组织结构基本正常。
图3C为PBS处理组小鼠TUNEL染色结果，可观察到出现大量的TUNEL阳性的凋亡细胞。
图3D为汉防己碱处理组(50mg/kg)小鼠TUNEL染色结果，可见小鼠的肝脏组织中未见炎性病灶和坏死区域。
实施例4  汉防己碱对CIH小鼠血清细胞因子的影响
本实施例中，对小鼠的处理如实施例1所述，在小鼠由尾静脉注射剂量为15mg/kg的ConA 2小时或8小时后，取小鼠血清，分别用ELISA方法检测血清中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、γ-干扰素(IFN-γ)、白介素-4(IL-4)、白介素-12(IL-12)的浓度。
使用Duoset ELISA kit(R&D，MN，USA)，按照生产商提供的说明书操作。简要步骤为：
100微升一抗(R&D，MN，USA)包板过夜，洗板后300微升封闭缓冲液封闭2小时，洗板后加入100微升样品和标准品，孵育2小时，洗板后加入二抗(R&D，MN，USA)孵育2小时，洗板后加入酶标链亲和素，加入底物显色，硫酸中止，酶标仪450nm读数(参考波长540nm)。根据标准曲线计算样品中各细胞因子的浓度。
结果见图4A-图4D。
图4A为ConA注射2小时后，取小鼠血清，ELISA检测血清中肿瘤坏死因子-α的浓度。可见汉防己碱处理组(50mg/kg组)小鼠血清中肿瘤坏死因子-α的含量显著低于对照组。
图4B为ConA注射8小时后，取小鼠血清，ELISA检测血清中γ-干扰素的浓度。可见汉防己碱处理组(50mg/kg组)小鼠血清中γ-干扰素的含量显著低于对照组。
图4C为ConA注射8小时后，取小鼠血清，ELISA检测血清中白介素-4的浓度。可见汉防己碱处理组(50mg/kg组)小鼠血清中白介素-4的含量显著低于对照组。
图4D为ConA注射8小时后，取小鼠血清，ELISA检测血清中白介素-12的浓度。可见汉防己碱处理组(50mg/kg组)小鼠血清中白介素-12的含量显著低于对照组。
因此，汉防己碱可降低CIH小鼠血清中多种炎性细胞因子的含量。
实施例5  汉防己碱对肝脏中趋化因子基因表达的影响
本实施例中，对小鼠的处理如实施例1所述，在小鼠由尾静脉注射剂量为15mg/kg的ConA 8小时后，取小鼠肝脏组织，提取RNA，实时定量PCR检测趋化因子IP-10和MIP1-α的表达水平。
检测过程如下：
使用RNeasy Mini Kit(Qiagen，Hilden，Germany)从小鼠肝脏组织抽提总RNA，在cDNA合成前进行RNA纯化，使用去RNase的DNase(Qiagen，Hilden，Germany)将基因组DNA从总RNA中移走，将RNA储存在-80℃。
每一RNA样品使用Sensiscript RT Kit(Qiagen，Hilden，Germany)以6核苷酸随机引物来合成c DNA。
通过实时PCR来检测趋化因子(MIP-1α，IP-10)的mRNA的表达，采用SYBRGreen master mix(Applied Biosystems，Foster City，USA)。PCR循环的条件包括：50℃ 2分钟，95℃ 10分钟；接着进行2步PCR程序，包括95℃ 15秒、60℃ 60秒，进行40个循环。在ABI Prism 7900序列检测系统(Applied Biosystems，FosterCity，USA)上采集和分析数据。使用β-actin基因作为内参，以标准化每一样品中的总RNA量。所有的量均用相对于β-actin的表达量的倍数表示。
实时PCR中，采用的引物如下：
β-actin正向引物(SEQ ID NO：1)：
5’TGTCCACCTTCCAGCAGATGT 3’；
β-actin反向引物(SEQ ID NO：2)：
5’AGCTCAGTAACAGTCCGCCTAGA 3’。
MIP-1α正向引物(SEQ ID NO：3)：
5’CACCCTCTGTCACCTGCTCAA 3’；
MIP-1α正向引物(SEQ ID NO：4)：
5’ATGGCGCTGAGAAGACTTGGT 3’。
IP-10正向引物(SEQ ID NO：5)：
5’GCCGTCATTTTCTGCCTC 3’；
IP-10正向引物(SEQ ID NO：6)：
5’ATGGCGCTGAGAAGACTTGGT 3’。
结果见图5A和图5B。
图5A为实时定量PCR检测趋化因子IP-10的表达水平，可见汉防己碱处理组(50mg/kg组)小鼠肝脏的相对IP-10表达水平显著低于对照组。
图5B为实时定量PCR检测趋化因子MIP1-α的表达水平，可见汉防己碱处理组(50mg/kg组)小鼠肝脏的相对MIP1-α表达水平显著低于对照组。
综上可知，汉防己碱可显著降低CIH小鼠肝脏中IP-10和MIP1-α两种趋化因子的表达水平。
实施例6  汉防己碱对NF-κB活化的影响
本实施例中，对小鼠的处理如实施例1所述，在小鼠由尾静脉注射剂量为15mg/kg的ConA 3小时后，取小鼠肝脏组织，获得细胞核提取物，EMSA(电泳迁移率试验，Electrophoretic Mobility Shift Assay)检测NF-κB的活性。
电泳迁移率试验过程如下：
采用文献M.Nagaki等，Tumor necrosis factor alpha prevents tumor necrosisfactor receptor-mediated mouse hepatocyte apoptosis，but not fas-mediatedapoptosis：role ofnuclear factor-kappaB.Hepatology 32(2000)1272-9中所述的方法制备肝组织的核抽提物。NF-κB结合保守单链寡核苷酸(5’-AGTTGAGGGGACTTTCCCAGGC-3’(SEQ ID NO：7))被先与与其互补的寡核苷酸(5’-GCCTGGGAAAGTCCCTCAACT-3’(SEQ ID NO：8))退火。退火的DNA片段用[γ-32P]dATP(Amersham，Piscataway，USA)标记(T4聚核苷酸激酶(Promega，Madison，USA)催化)。核蛋白(15ug)与2微升的32P标记的双链寡核苷酸探针在4℃孵育30分钟。混合物加入到0.5×Tris-硼酸-EDTA中，在4℃，在4％聚丙烯酰胺凝胶上电泳。以冷探针(cold probe)为阴性对照。
电泳结果见图6，可见汉防己碱处理组NF-κB的活性显著低于对照组(PBS组)。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明做各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
<110>中国科学院上海生命科学研究院
<120>汉防己碱在制备防治肝脏损伤的药物中的用途
<130>066571
<160>8
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>21
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<213>人工序列
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<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<223>引物
<400>4
atggcgctga gaagacttgg t                    21
<210>5
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
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<223>引物
<400>5
gccgtcattt tctgcctc                        18
<210>6
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<223>引物
<400>6
atggcgctga gaagacttgg t                    21
<210>7
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<223>单链寡核苷酸
<400>7
agttgagggg actttcccag gc       22
<210>8
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<212>DNA
<213>人工序列
<220>
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<223>单链寡核苷酸
<400>8
gcctgggaaagtccctcaact          21