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1、(10)申请公布号 CN 102660469 A (43)申请公布日 2012.09.12 CN 102660469 A *CN102660469A* (21)申请号 201210176806.7 (22)申请日 2012.05.31 C12N 1/19(2006.01) C12N 15/31(2006.01) C12N 15/81(2006.01) C12R 1/84(2006.01) (71)申请人 哈尔滨工业大学 地址 150001 黑龙江省哈尔滨市南岗区西大 直街 92 号 (72)发明人 杨谦 王允 宋金柱 从华 孙艳 曹广丽 姚琳 杨萍 赵磊 王震宇 刘冰南 (74)专利代理机构 。
2、哈尔滨市松花江专利商标事 务所 23109 代理人 韩末洙 (54) 发明名称 一种表达植物抗性诱导因子的毕赤酵母基因 工程菌株的构建方法 (57) 摘要 一种表达植物抗性诱导因子的毕赤酵母基因 工程菌株的构建方法， 涉及毕赤酵母基因工程菌 株的构建方法。是要解决目前绿木霉的植物抗性 诱导因子基因表达量低， 无法满足其研究与应用 的问题。 方法 ： 提取棘孢木霉菌丝总RNA， 反转录 ； PCR 扩增， 纯化扩增产物得目的基因 EplT4 ； 目的 基因与载体连接构建重组载体 ； 转化， 提取阳性 转化子质粒， 将质粒线性化并回收 ； 转化 ； 将转化 细胞涂在上长出重组菌， 将重组菌转接到含。
3、梯度 浓度抗生素的培养基上， 在最高浓度抗生素的培 养基上生长的菌落即为基因工程菌株 Pp-EplT4。 本发明方法获得的毕赤酵母基因工程菌株可高效 表达棘孢木霉的植物抗性诱导因子基因， 表达量 为 20mg/L。用于植物抗病领域。 (51)Int.Cl. 权利要求书 3 页 说明书 6 页 序列表 2 页 附图 3 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 3 页 说明书 6 页 序列表 2 页 附图 3 页 1/3 页 2 1. 一种表达植物抗性诱导因子的毕赤酵母基因工程菌株的构建方法， 其特征在于表达 植物抗性诱导因子的毕赤酵母基因工程菌株的构建方法， 。
4、按以下步骤进行 ： 一、 将棘孢木霉 接种到PDA培养基中进行培养， 3天后将孢子用无菌水清洗， 接入PDA液体培养基中， 28培 养3天后离心收集菌丝， 用Trizol提取菌丝的总RNA， 然后用反转录试剂盒将总RNA反转录 成 cDNA ； 二、 以获得的 cDNA 为模板进行 PCR 扩增， 将扩增产物用 1琼脂糖凝胶电泳检测， 然后用胶回收试剂盒进行纯化， 获得目的基因 EplT4， 对目的基因 EplT4 进行测序鉴定 ； 三、 将目的基因EplT4与质粒载体pPIC9K分别经EcoRI和NotI进行双酶切， 将酶切后的目的基 因 EplT4 和酶切后的质粒载体 pPIC9K 连接，。
5、 构建重组载体 pPIC9K-EplT4 ； 四、 将重组载体 pPIC9K-EplT4转化大肠杆菌Top10， 挑选转化子进行菌落PCR验证， 用质粒提取试剂盒提取 阳性转化子的质粒， 然后将质粒用 SalI 酶进行单酶切线性化， 并将线性化片段进行回收 ； 五、 用毕赤酵母 GS115 制备毕赤酵母感受态细胞， 将线性化片段与毕赤酵母感受态细胞混 合， 电击转化， 获得转化细胞 ； 六、 将转化细胞涂在 MD 平板培养基上， 于 30培养至长出重 组菌， 将重组菌分别转接到含梯度浓度 G418 抗生素的 MD 平板培养基上， 于 30培养， 在最 高浓度 G418 抗生素的培养基上生长的菌。
6、落， 即为毕赤酵母基因工程菌株 Pp-EplT4 ； 其中步 骤二中 PCR 扩增所用上游引物 Pa 为 5 -CGGAATTCGATACCGTCTCGTACGATACCGGCT-3， 下游 引物 Pb 为 5 -ATAAGAATGCGGCCGCTTAATGATGGTGATGGTGATGGAGGCCGCAGTTGCTCACAGC-3 ； 步骤四中菌落 PCR 所用上游引物 Pc 为 5 -TACTATTGCCAGCATTGCTGC-3， 下游引物 Pd 为 5 -GCAAATGGCATTCTGACATCC-3。 2. 根据权利要求 1 所述的一种表达植物抗性诱导因子的毕赤酵母基因工程菌株的构 。
7、建方法， 其特征在于步骤二中 PCR 扩增的反应体系如下 ： PCR 扩增条件为 ： 94变性 5min， 94变性 30s， 54退火 30s， 72延伸 2min， 共 30 个 循环， 再 72延伸 7min， 4保温。 3. 根据权利要求 1 所述的一种表达植物抗性诱导因子的毕赤酵母基因工程菌株的构 建方法， 其特征在于步骤三中目的基因 EplT4 的双酶切反应体系如下 ： 权 利 要 求 书 CN 102660469 A 2 2/3 页 3 酶切反应条件 ： 16酶切过夜。 4. 根据权利要求 1 所述的一种表达植物抗性诱导因子的毕赤酵母基因工程菌株的构 建方法， 其特征在于步骤三中。
8、质粒载体 pPIC9K 的双酶切反应体系如下 ： 酶切反应条件 ： 16酶切过夜。 5. 根据权利要求 1 所述的一种表达植物抗性诱导因子的毕赤酵母基因工程菌株的构 建方法， 其特征在于步骤三中连接反应体系如下 ： 连接反应条件 ： 16连接过夜。 6. 根据权利要求 1 所述的一种表达植物抗性诱导因子的毕赤酵母基因工程菌株的构 建方法， 其特征在于步骤四中 PCR 扩增的反应体系如下 ： 权 利 要 求 书 CN 102660469 A 3 3/3 页 4 PCR 扩增条件为 ： 94变性 5min， 94变性 30s， 54退火 30s， 72延伸 2min， 共 28 个 循环， 再 7。
9、2延伸 7min， 12保温。 权 利 要 求 书 CN 102660469 A 4 1/6 页 5 一种表达植物抗性诱导因子的毕赤酵母基因工程菌株的构 建方法 技术领域 0001 本发明涉及一种表达植物抗性诱导因子的毕赤酵母基因工程菌株的构建方法。 背景技术 0002 目前全世界每年因为病虫害而损失的粮食达数亿吨， 直接经济损失达数十亿美 元， 随着人口的不断增长， 粮食安全仍然是待解决的一大难题。生物农药与化学农药相比， 起作用的是生物活性或产生的活性物质， 相对具有无残留、 无污染， 对环境更加友好的优 势， 能兼顾生态平衡， 且病虫害不容易产生抗药性。 由于生物防治能克服化学农药的种种。
10、弊 端而成为被优先采用的方法， 受到了国际社会的极大关注。 0003 生物防治菌能够通过各种不同的机制抑制病原菌的生长， 故而在学术研究和工业 生产中， 都引起了广泛的重视， 且被普遍认为是能够替代多种化学农药的最具希望和潜力 的生防因子。生防菌通过多种机制包括重寄生作用、 溶菌作用、 抗生素作用， 以及对空间和 营养的竞争等达到防治植物病原菌的目的。 0004 来源于绿木霉的植物抗性诱导因子已被纯化， 该植物抗性诱导因子具有植物抗病 作用但目前其编码基因在丝状真菌中表达量较低， 纯化后的产量约为 150g/L， 无法满足 其研究与应用。 发明内容 0005 本发明是要解决目前绿木霉的植物抗性。
11、诱导因子基因表达量低， 无法满足其研究 与应用的问题， 提供一种表达植物抗性诱导因子的毕赤酵母基因工程菌株的构建方法。 0006 本发明表达植物抗性诱导因子的毕赤酵母基因工程菌株的构建方法， 按以下步 骤进行 ： 一、 将棘孢木霉接种到 PDA 培养基中进行培养， 3 天后将孢子用无菌水清洗， 接入 PDA 液体培养基中， 28培养 3 天后离心收集菌丝， 用 Trizol 提取菌丝的总 RNA， 然后用 反转录试剂盒将总 RNA 反转录成 cDNA ； 二、 以获得的 cDNA 为模板进行 PCR 扩增， 将扩增产 物用 1琼脂糖凝胶电泳检测， 然后用胶回收试剂盒进行纯化， 获得目的基因 E。
12、plT4， 对目 的基因 EplT4 进行测序鉴定 ； 三、 将目的基因 EplT4 与质粒载体 pPIC9K 分别经 EcoRI 和 NotI 进行双酶切， 将酶切后的目的基因 EplT4 和酶切后的质粒载体 pPIC9K 连接， 构建重 组载体 pPIC9K-EplT4 ； 四、 将重组载体 pPIC9K-EplT4 转化大肠杆菌 Top10， 挑选转化子进 行菌落 PCR 验证， 用质粒提取试剂盒提取阳性转化子的质粒， 然后将质粒用 SalI 酶进行 单酶切线性化， 并将线性化片段进行回收 ； 五、 用毕赤酵母 GS115 制备毕赤酵母感受态细 胞， 将线性化片段与毕赤酵母感受态细胞混合。
13、， 电击转化， 获得转化细胞 ； 六、 将转化细胞涂 在 MD 平板培养基上， 于 30培养至长出重组菌， 将重组菌分别转接到含梯度浓度 G418 抗 生素的 MD 平板培养基上， 于 30培养， 在最高浓度 G418 抗生素的培养基上生长的菌落， 即为毕赤酵母基因工程菌株 Pp-EplT4 ； 其中步骤二中 PCR 扩增所用上游引物 Pa 为 5 -C GGAATTCGATACCGTCTCGTACGATACCGGCT-3， 下游引物 Pb 为 5 -ATAAGAATGCGGCCGCTTAAT 说 明 书 CN 102660469 A 5 2/6 页 6 GATGGTGATGGTGATGGAG。
14、GCCGCAGTTGCTCACAGC-3 ； 步骤四中菌落 PCR 所用上游引物 Pc 为 5 -TACTATTGCCAGCATTGCTGC-3， 下游引物 Pd 为 5 -GCAAATGGCATTCTGACATCC-3。 0007 本发明的有益效果 ： 0008 本发明方法获得的毕赤酵母基因工程菌株 Pp-EplT4 可高效表达棘孢木霉的植物 抗性诱导因子基因(EplT4)， 表达量为20mg/L。 本发明从三个层面来证明EplT4能诱导大豆 产生抗病性的问题。首先， 在基因水平上， EplT4 能够诱导大豆的病原相关蛋白基因表达量 的上调， 几丁质酶， 葡聚糖酶等基因的高表达， 能有效抑制。
15、外来病源的侵染 ； 其次， 在生理生 化水平上， 植物抗性反应的前期是产生过氧化氢和植物抗毒素 ( 往往与产生荧光相关联 )， EplT4 能分别诱导大豆叶片产过氧化氢和荧光现象说明， 大豆已经产生诱导抗性 ； 最后， 在 抗病原菌水平上， EplT4 能抑制大豆灰斑病在叶片上的发病情况， 这说明它提高大豆对灰斑 病的抗病能力。 附图说明 0009 图 1 为具体实施方式一中分子筛层析后得到的吸收峰图 ； 图 2 为具体实施方式一 中SDS-PAGE电泳图 ； 图3为具体实施方式一中实时定量PCR检测病原相关蛋白的基因表达 量结果 ； 图 4 为 EplT4 蛋白诱导大豆叶片产 H2O2结果 。
16、； 图 5 为 H2O 诱导大豆叶片产 H2O2结 果 ； 图 6 为实验组荧光检测结果 ； 图 7 为阴性对照组荧光检测结果 ； 图 8 为阳性对照组荧光 检测结果 ； 图 9 为经 EplT4 蛋白、 水杨酸 (SA) 和水处理的叶片的病斑生长情况比较图 ； 图 10 为图 9 中病斑损伤区域比率的柱状图。 具体实施方式 0010 本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式， 还包括各具体实施方式间的 任意组合。 0011 具体实施方式一 ： 本实施方式表达植物抗性诱导因子的毕赤酵母基因工程菌株的 构建方法， 按以下步骤进行 ： 一、 将棘孢木霉接种到 PDA 培养基中进行培养， 3 天。
17、后将孢子用 无菌水清洗， 接入 PDA 液体培养基中， 28培养 3 天后离心收集菌丝， 用 Trizol 提取菌丝 的总 RNA， 然后用反转录试剂盒将总 RNA 反转录成 cDNA ； 二、 以获得的 cDNA 为模板进行 PCR 扩增， 将扩增产物用 1琼脂糖凝胶电泳检测， 然后用胶回收试剂盒进行纯化， 获得目的基 因 EplT4， 对目的基因 EplT4 进行测序鉴定 ； 三、 将目的基因 EplT4 与质粒载体 pPIC9K 分别 经 EcoRI 和 NotI 进行双酶切， 将酶切后的目的基因 EplT4 和酶切后的质粒载体 pPIC9K 连 接， 构建重组载体 pPIC9K-Epl。
18、T4 ； 四、 将重组载体 pPIC9K-EplT4 转化大肠杆菌 Top10， 挑选 转化子进行菌落 PCR 验证， 用质粒提取试剂盒提取阳性转化子的质粒， 然后将质粒用 SalI 酶进行单酶切线性化， 并将线性化片段进行回收 ； 五、 用毕赤酵母 GS115 制备毕赤酵母感受 态细胞， 将线性化片段与毕赤酵母感受态细胞混合， 电击转化， 获得转化细胞 ； 六、 将转化细 胞涂在MD平板培养基上， 于30培养至长出重组菌， 将重组菌分别转接到含梯度浓度G418 抗生素的 MD 平板培养基上， 于 30培养， 在最高浓度 G418 抗生素的培养基上生长的菌落， 即为毕赤酵母基因工程菌株 Pp-。
19、EplT4 ； 其中步骤二中 PCR 扩增所用上游引物 Pa 为 5 -C GGAATTCGATACCGTCTCGTACGATACCGGCT-3， 下游引物 Pb 为 5 -ATAAGAATGCGGCCGCTTAAT GATGGTGATGGTGATGGAGGCCGCAGTTGCTCACAGC-3 ； 步骤四中菌落 PCR 所用上游引物 Pc 为 说 明 书 CN 102660469 A 6 3/6 页 7 5 -TACTATTGCCAGCATTGCTGC-3， 下游引物 Pd 为 5 -GCAAATGGCATTCTGACATCC-3。 0012 本实施方式步骤六中 MD 平板培养基由 13.4。
20、g/L 的酵母基本氮源、 0.4mg/L 的生物 素、 20g/L 的葡萄糖和蒸馏水组成。 0013 本实施方式步骤六所述含梯度浓度 G418 抗生素的培养基中 G418 抗生素浓度为 0.5mg/mL、 1.0mg/mL、 2.0mg/mL、 3.0mg/mL 和 4.0mg/mL， 其中 G418 抗生素浓度为 4.0mg/mL 的培养基中菌落无法长出， G418 抗生素浓度为 3.0mg/mL 的培养基中有少许菌落长出， 为能 够长出菌落的最高浓度 G418 抗生素的培养基， 因此在 G418 抗生素浓度为 3.0mg/mL 的培养 基中生长的菌落即为毕赤酵母基因工程菌株 Pp-EplT。
21、4。 0014 步骤一所述棘孢木霉为棘孢木霉(Trichoderma asperellum)T4， 已在 Expressed sequence tags-based identification of genes in a biocontrol strain Trichoderma asperellum (通过表达序列标签在生物防治菌棘孢木霉鉴定基因 ， Mol Biol Rep(2010)37 ： 3673-3681) 文章中公开， 并且保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通 微生物中心， 保藏编号为 CGMCC3.14975。 0015 本实施方式步骤一中 Trizol 购自 Invitr。
22、ogen 公司， Trizol 提取 RNA 的方法参照 Trizol 说明书 ； 步骤一中反转录试剂盒为购自 Takara 公司 ( 宝生物工程有限公司 ) 的 RNA PCRKit Ver.3.0 ； 步骤二中使用的胶回收试剂盒为购自 Takara 公司的 Agarose Gel DNA Purification Kit( 琼脂糖凝胶 DNA 纯化试剂盒 ) ； 步骤三所用质粒载体 pPIC9K 和步骤五 所述毕赤酵母 GS115 均购自于 Invitrogen 公司 ； 步骤四所述大肠杆菌 Top10 购自 Takara 公司。 0016 本实施方式步骤五中用毕赤酵母 GS115 制备毕。
23、赤酵母感受态细胞的方法具体参 照 Invitrogen 公司提供的毕赤酵母表达操作手册。 0017 本实施方式步骤二中对目的基因 EplT4 进行测序鉴定的具体操作方法为 ： 将目的 基因 EplT4 与 TA 克隆载体 pMD18-T( 购买自 TaKaRa 公司 ) 进行连接， 连接方法参照 TaKaRa pMD18-T Vector试剂盒说明书， 获得连接产物 ； 采用CaCl2法制备大肠杆菌Top10感受态细 胞 ； 将连接产物在大肠杆菌Top10感受态细胞在无菌条件下混匀， 用热激法转化， 加入LB培 养基， 37摇床 180r/min 振荡培养 1h， 将菌液涂布于含 Amp、 I。
24、PTG、 X-Gal 的 LB 平板上进行 蓝白斑筛选， 用无菌牙签挑取白色菌落于 3mL 的 LB 培养基中， 置于摇床 37摇床 180r/min 振荡过夜培养， 然后以菌液为模板， 进行阳性克隆的PCR鉴定， 反应结束后取5L PCR产物 进行琼脂糖凝胶电泳检测 ； 将鉴定结果为阳性的菌液送至测序公司进行测序 ； 将测序结果 用 DNAman 软件与 cDNA 文库中的序列进行比对， 两者除信号肽和 C 端的 6 个 His 标签外， 相 似性达 100， 可以确定该基因为棘孢木霉的植物抗性诱导因子基因 (EplT4)， EplT4 基因 的碱基序列如 SEQ ID NO ： 1 所示。。
25、 0018 步骤五中将线性化片段与感受态细胞混合， 电击转化的具体操作方法为 ： 将 80L 毕赤酵母感受态细胞和 10g 线性化片段混合均匀， 得混合液， 然后把混合液转移入 预先冰浴的转化杯中， 冰浴 5 分钟， 然后用 Eppendorf 电转化仪在 1100V 电压下电击转化， 接着立即往转化杯中加入 1mL 冰浴的 1M 山梨醇， 然后把转化杯中液体转入一个新的 1.5mL 离心管中， 30静置培养 1 2h。 0019 为验证本实施方式获得的毕赤酵母基因工程菌株 Pp-EplT4 的蛋白表达量及 EplT4蛋白的功能， 进行以下实验(实验中所用大豆的品种为绥农10号， 购买自黑龙江。
26、省农 说 明 书 CN 102660469 A 7 4/6 页 8 业科学院 ) ： 0020 1、 对 EplT4 蛋白进行纯化 0021 将本实施方式获得的毕赤酵母基因工程菌株 Pp-EplT4 在基础盐培养基 ( 配 方参照 Invitrogen 公司的 毕赤酵母发酵过程指南 Pichia Fermentation Process Guidelines) 中培养 48h， 1甲醇诱导培养 48h， 收集培养基上清， 在 80饱和度的硫酸铵 过夜沉淀。于 8000r/min 离心， 将沉淀用平衡缓冲液溶解， 用 His-bind column(Madison， WI， USA) 进行初步纯。
27、化。将洗脱缓冲液用 NH4CO3透析过夜， 得到的产物用 Superdex 200 进 行分子筛层析， 分子筛层析后得到的吸收峰图如图 1 所示， SDS-PAGE 电泳图如图 2 所示， 图 2 中 M 为蛋白 marker， 1 为纯化前的培养基上清浓缩液， 2 为经镍柱纯化后的结果， 3 为 Superdex200进行分子筛层析后的结果。 可见， 经两步纯化后， 得到较纯的单一条带， 为纯度 较高的 EplT4 单体。植物抗性诱导因子 (EplT4) 基因表达量为 20mg/L。 0022 2、 用 EplT4 蛋白诱导大豆叶片， 检测大豆病原相关蛋白基因表达量 0023 对培养 14d。
28、 的大豆无菌苗叶片喷洒约 50g EplT4 蛋白， 12 小时后， 提取大豆叶 片的 RNA， 反转录， 进行实时定量 PCR 检测病原相关蛋白的基因表达量， 结果如图 3 所示。 -1， 3 葡聚糖酶 (Glu)、 几丁质酶 III(Chi III-A)、 半胱氨酸蛋白酶抑制剂 (CPI)、 过氧化 物酶 (Peroxidase) 的表达， 均受 EplT4 蛋白的诱导， 说明 EplT4 蛋白能在基因水平上影响 大豆的抗病性。 0024 3、 用 EplT4 蛋白诱导大豆叶片， 检测大豆产 H2O2和荧光反应 0025 由于植物产生 H2O2和荧光是病原诱导的早期反应， 因此常用检测这两。
29、种现象 说明植物产生抗性反应。将培养 14d 的大豆无菌苗叶片用无菌针处理小伤口， 实验组 在伤口处喷洒约 20g EplT4 蛋白 ； 阴性对照组在伤口处喷洒 H2O。12 小时后， 加入 3， 3 -diaminobenzidine(DAB)( 该试剂在 H2O2下会形成红褐色沉淀 )， 阴性对照组的结果如 图 4 所示， 实验组结果如图 5 所示。可见图 5 中形成红褐色沉淀， 这说明了通过毕赤酵母表 达的 EplT4 能诱导大豆叶片产生 H2O2。 0026 植物产生植物抗毒素等物质时， 常常与产荧光相关联， 因此对大豆叶片产 荧光进行检测。将培养 14d 的大豆无菌苗叶片用无菌针处理。
30、小伤口， 实验组在伤口 处喷洒约 20gEplT4 蛋白 ； 阴性对照组在伤口处喷洒 H2O ； 阳性对照组在伤口处喷 洒 2， 6-dichloroisonicotinic acid(INA ； 50nmol) ； 12 小 时 后 用 荧 光 显 微 镜 Olympus BX-51fluorescent microscope进行观察。 实验组荧光检测结果如图6所示， 阴性对照组荧 光检测结果如图 7 所示， 阳性对照组荧光检测结果如图 8 所示 ( 图 6 至图 8 中， 上面为可见 光， 下面为荧光 )。结果表明 EplT4 和阳性对照 (INA) 均能诱导叶片产生荧光， 而 H2O 不。
31、能 诱导大豆叶片产生荧光。 0027 4、 经诱导的大豆对大豆灰斑病的抗病性检测 0028 大豆灰斑病是世界性病害， 可使大豆减产甚至绝产， 在黑龙江省比较严重， 因此对 大豆灰斑病的抗性进行了检测。将培养 14d 的大豆无菌苗叶片用无菌针处理小伤口， 在 伤口处喷洒约 20g 蛋白， 然后接种约 104个大豆灰斑病 (Cercosporidium sofinum)15 号生理小种的孢子， 在 60的湿度， 27下培养 14 天， 对叶片进行拍照， 并用 Image Pro Plus6.0 软件对病斑面积进行统计， 结果如图 9 和图 10 所示， 经 EplT4 和水杨酸 (SA， 做 阳性。
32、对照 ) 处理的叶片的病斑比例与用 H2O 处理的有显著性差异。这说明 EplT4 能诱导 说 明 书 CN 102660469 A 8 5/6 页 9 大豆产生抗病性， 并提高其对大豆灰斑病的抗病能力。所述大豆灰斑病 (Cercosporidium sofinum)15 号生理小种购买自黑龙江省农业科学院。 0029 具体实施方式二 ： 本实施方式与具体实施方式一不同的是 ： 步骤二中 PCR 扩增的 反应体系如下 ： 0030 0031 PCR 扩增条件为 ： 94变性 5min， 94变性 30s， 54退火 30s， 72延伸 2min， 共 30 个循环， 再 72延伸 7min， 。
33、4保温。其它与具体实施方式一相同。 0032 具体实施方式三 ： 本实施方式与具体实施方式一或二不同的是 ： 步骤三中目的基 因 EplT4 的双酶切反应体系如下 ： 0033 0034 酶切反应条件 ： 16酶切过夜。其它与具体实施方式一或二相同。 0035 具体实施方式四 ： 本实施方式与具体实施方式一至三之一不同的是 ： 步骤三中质 粒载体 pPIC9K 的双酶切反应体系如下 ： 0036 说 明 书 CN 102660469 A 9 6/6 页 10 0037 酶切反应条件 ： 16酶切过夜。其它与具体实施方式一至三之一相同。 0038 具体实施方式五 ： 本实施方式与具体实施方式一至。
34、四之一不同的是 ： 步骤三中连 接反应体系如下 ： 0039 0040 连接反应条件 ： 16连接过夜。其它与具体实施方式一至四之一相同。 0041 具体实施方式六 ： 本实施方式与具体实施方式一至五之一不同的是 ： 步骤四中 PCR 扩增的反应体系如下 ： 0042 0043 PCR 扩增条件为 ： 94变性 5min， 94变性 30s， 54退火 30s， 72延伸 2min， 共 28 个循环， 再 72延伸 7min， 12保温。其它与具体实施方式一至五之一相同。 说 明 书 CN 102660469 A 10 1/2 页 11 0001 0002 序 列 表 CN 102660469 A 11 2/2 页 12 序 列 表 CN 102660469 A 12 1/3 页 13 图 1 图 2 图 3 说 明 书 附 图 CN 102660469 A 13 2/3 页 14 图 4图 5 图 6 图 7 说 明 书 附 图 CN 102660469 A 14 3/3 页 15 图 8 图 9 图 10 说 明 书 附 图 CN 102660469 A 15 。