牛传染性鼻气管炎ΔTK/ΔgE基因缺失标志活疫苗及制备方法技术领域
本发明涉及动物病菌基因工程技术领域。具体涉及一个牛疱疹病毒1型(BHV-1)胸苷激酶(TK)、gE糖蛋白基因缺失标记活疫苗及其制备方法。
背景技术
牛传染性鼻气管炎(Infectious Bovine Rhinotracheitis，IBR)，俗称红鼻子病(李佐波，2006)，是由牛疱疹病毒1型(BHV-1)引起的一种牛的急性、热性、接触性传染病，主要引起呼吸道和生殖道疾病，如传染性鼻气管炎、眼结膜炎、高热、传染性脓疱性外阴道炎、流产等。该病的发生极大地降低了奶牛的产奶量、公牛的繁殖力及役用牛的使役力，并且产生的呼吸道感染还容易继发牛的细菌性肺炎，这也是造成养牛业经济损失的主要原因之一(王延辉，2007)。
自该病被发现以来，目前除南极洲外各大洲均有牛传染性鼻气管炎的报道。据血清学的抗体统计分析，几乎在所有国家的牛群中都能不同程度的检测到BHV-1抗体。而目前仅有芬兰、瑞士、丹麦、奥地利、瑞典以及意大利的个别省已经将BHV-1成功根除，并在欧盟内法定宣布为无IBR感染区(Scahw，2000)。本病在我国最早是于20世纪70年代在进口牛群中被发现。而首次分离到该病毒则是在20世纪80年代由周泰冲等在深圳海关从新西兰的进口奶牛中分离的(周泰冲等，1981)。之后许多省市、地区的牛群皆被报道该病毒的普遍存在(杨春明等，2003；肖定汉等，2004；朱远茂等，2005；颜邦芬等，2007)。
本病的传播多种多样：在传播途径上，呼吸道途径和生殖系统途径是本病传播的主要途径，吸血昆虫也偶见带有传播；在传播方式上，水平传播和垂直传播同时出现，还可以通过初乳传给分娩后的新生胎儿。病毒在感染牛体后，可潜伏于神经系统内，使感染呈间歇性、持续性。而且病牛会长期甚至终生都带毒，当机体的抵抗力降低时，则又重新激活，向外排毒，这是该病极难根治的根本原因。
根据OIE的标准，牛传染性鼻气管炎属于B类疫病，此疾病的根除方法是病畜的检验与捕杀，而防治的主要措施是接种疫苗，灭活疫苗无法将野毒感染牛和疫苗免疫牛相区分，而弱毒疫苗有残余毒力和返强的可能性。多年的临床试验表明，长期使用常规疫苗(灭活苗和减毒弱毒苗)并不利于联合接种和本病的根除(吴春涛，2006)，所以目前该病毒疫苗的制备主要采用基因工程疫苗的方法。基因缺失疫苗的毒力比常规疫苗更弱，而且不会出现毒力偏强、返祖，也没有副作用，是一种十分优良的新型疫苗。多年来随着科研的不断开展，人们对α-疱疹病毒的了解越来越深入，目前已经对此科的许多病毒全基因组进行了释义，发现其中的很多基因是病毒复制非必需的基因，最常见的有TK、gB、gC、gE等基因(Kit et al.，1985；Kaashoek et al.，1998；Griffin et al.，1990)，这些基因都可以成为基因缺失疫苗的缺失对象。国外已相继开发出了牛疱疹病毒1型TK、gE基因缺失重组疫苗(Kaashoek et al.，1995)。但是在我国，由于起步较晚，对该病未引起足够的重视，尚未有国产商品化的疫苗的生产，仍无法在全国范围内开展防制工作和根除计划。
发明内容
本发明的目的在于获得一种牛传染性鼻气管炎ΔTK/ΔgE基因缺失标志毒株，利用该牛传染性鼻气管炎基因缺失标志毒株制备牛传染性鼻气管炎基因缺失标志疫苗以及该牛传染性鼻气管炎基因缺失标志疫苗的应用。
本发明的总体技术路线是
本发明通过基因重组技术获得一株牛传染性鼻气管炎ΔTK/ΔgE基因缺失标志活毒株，即，牛传染性鼻气管炎缺失株BHV-1 TK-/gE-/EGFP+，于2011年1月11日送交湖北省武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，其保藏编号为CCTCC NO：V201104，该缺失株缺失了如序列表SEQ ID NO：2所示的1-630bp和SEQ ID NO：6所示的1-1728bp的DNA片段；该缺失株还包括插入了如序列表SEQ IDNO：7所示的1-1941bp的EGFP表达盒。
更详细的技术方案如下所述。
本发明将TK基因上下游各1100bp左右的序列通过分子克隆技术克隆至载体上，通过酶切位点拼接在一起，构成重组所必需的上下游同源臂，构建的该中间转移载体被命名为pZF08-21(缺失TK基因)，在pZF08-21中插入带有完整启动子的EGFP报告基因，将构建成的重组转移质粒命名为pZF07-16(TK-/EGFP+)。用同样的手段得到gE缺失的中间转移载体pZF09-08(缺失gE基因)和重组转移质粒pZF09-15(gE-/EGFP+)。通过pZF07-16(TK-/EGFP+)和BHV-1基因组进行第一次同源重组，筛选得到BHV-1TK-/EGFP+重组病毒。再用pZF08-21(缺失TK基因)和BHV-1TK-/EGFP+重组病毒基因组进行第二次同源重组，筛选得到BHV-1TK-重组病毒。最后通过pZF09-15(gE-/EGFP+)和BHV-1TK-重组病毒基因组进行第三次同源重组，筛选得到BHV-1TK-/gE-/EGFP+重组病毒(图1)。该基因缺失标记菌株于2011年1月11日送交湖北省武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏号为CCTCC NO.：V201104。本发明制备的牛传染性鼻气管炎ΔTK/ΔgE基因缺失标志菌株的复制非必需毒力基因TK和糖蛋白基因gE被缺失，导致其毒力大大降低，潜伏的病毒也不易被激活，因而具有很高的安全性。此外，除了被缺失的TK基因和gE基因，该缺失毒株仍能表达其它所有的毒力基因，所以具有很好的免疫原性。
本发明的主要优点是：
1.本发明所用的材料是牛疱疹病毒1型BHV-1临床分离株(见文献：定明，2010)，具有全部的毒力因子和其他免疫原性很好的抗原。因此，以该病毒为基础构建的牛传染性鼻气管炎ΔTK/ΔgE基因缺失标志菌株所制备的基因工程疫苗对牛免疫具有很强的针对性，具有广阔的市场应用前景。
2.α疱疹病毒成员的主要毒力基因TK基因和牛疱疹病毒1型的十个囊膜糖蛋白之一gE基因的缺失疫苗相较只缺失TK或gE基因的缺失的疫苗更安全可靠，更方便实际操作。
3.选用EGFP作为报告基因，使得重组病毒的构建更快速，准确，结果更真实，可靠。
附图说明
序列表SEQ ID NO：1.本发明构建的牛疱疹病毒1型BHV-1TK缺失株所用的下游同源臂序列，序列长度为1149bp。
序列表SEQ ID NO：2.本发明构建的牛疱疹病毒1型BHV-1TK缺失株缺失的TK序列，序列长度为630bp。
序列表SEQ ID NO：3.本发明构建的牛疱疹病毒1型BHV-1gE缺失株所用的上游同源臂序列，序列长度为1174bp。
序列表SEQ ID NO：4.本发明构建的牛疱疹病毒1型BHV-1gE缺失株所用的下游同源臂序列，序列长度为1162bp。
序列表SEQ ID NO：5.本发明构建的牛疱疹病毒1型BHV-1TK缺失株所用的上游同源臂序列，序列 长度为1072bp。
序列表SEQ ID NO：6.本发明构建的牛疱疹病毒1型BHV-1gE缺失株缺失的gE序列，序列长度为1728bp。
序列表SEQ ID NO：7.本发明构建的牛疱疹病毒1型BHV-1TK-/gE-/EGFP+缺失株所用的EGFP表达盒序列，序列长度为1941bp。
图1.本发明所构建BHV-1TK-/EGFP+缺失株的构建所用的转移质粒及其构建的技术路线，其中图1A：本发明所构建的质粒；图1B：是本发明技术路线图。
图2.本发明所扩增TK基因上下游同源臂的PCR产物检测，图中泳道1：扩增的TK上游同源臂，大约1.0kb；2：扩增的TK下游同源臂，大约1.1kb；M：DL2000DNA molecular marker(购至宝生物工程(大连)有限公司公司)。
图3.本发明所扩增gE基因上下游同源臂的PCR产物检测，图中M：DL2000DNA molecular marker；1、2：扩增的gE上游同源臂，大约1.1kb；3：扩增的gE下游同源臂，大约1.0kb。
图4.本发明所扩增EGFP表达盒，图中1：扩增的大约1.9kb的EGFP表达盒；M：DL2000DNA molecular marker。
图5.本发明所构建重组转移质粒pZF08-21和pZF07-16限制性酶切鉴定，图中泳道M：DL15000DNA molecular marker(购自宝生物工程(大连)有限公司公司)；1：用Xba I和EcoR I酶切pZF08-21得到4.0kb和1.1kb片段；2：用EcoR I and HindⅢ酶切pZF08-21出4.1kb和1.0kb片段p；3：用HindⅢ酶切pZF08-21成5.2kb的片段；4：pZF08-21质粒；5：pZF07-16质粒；6：用Nhe I和HindⅢ酶切pZF07-16成3.2kb，2.2kb和1.7kb的片段，说明EGFP表达盒片段顺式插到了TK基因上游同源臂后。
图6.本发明所构建的pZF07-16重组转移质粒转染HeLa细胞。
图7.本发明所构建的pZF09-08重组转移质粒限制性酶切鉴定，图中泳道M：DL15000DNA molecular marker；1：用Kpn I和BamH酶切pZF09-08成5.6kb and 1.9kb片段；泳道2：pZF09-08质粒；3：用HindⅢ和EcoR I酶切pZF09-08成5.4kb and 2.1kb片段。
图8.本发明构建的pZF07-16重组转移质粒与辅助质粒pBICP0和BHV-1基因组共转染MDBK细胞，其中图8A：箭头所指在常光下的细胞群；图8B：箭头所指的细胞群没有发出绿色荧光。
图9.本发明所构建的BHV-1TK-/EGFP+重组病毒的筛选纯化，其中图9A：箭头所指的细胞群在蓝光下发出绿色荧光；图9B：箭头所指细胞群在常光下；图9C：空斑纯化的最终结果。
图10.本发明所构建的BHV-1TK-/EGFP+重组病毒PCR验证，图中泳道1：用pZF07-16质粒做阳性对照检验EGFP与TK下游同源臂的连接；2-5：检验EGFP与TK下游同源臂的连接，扩增出0.4kb的条带；6：用pZF07-16质粒做阳性对照检验EGFP与TK上游同源臂的连接；7-10：检验EGFP与TK上游同源臂的连接，扩增出0.3kb的条带；M：DL2000DNA molecular marker。
图11.本发明构建的BHV-1TK-/EGFP+中TK缺失的示意图。虚线部分为缺失的碱基。
图12.本发明所构建的BHV-1TK-/EGFP+重组病毒southern blot验证，其中，泳道1：用BHV-1TK-/EGFP+DNA用Sph I酶切显示4.8kb的片段；泳道2：用BHV-1DNA用Sph I酶切显示3.5kb的片段。
图13.本发明所构建的BHV-1TK-重组病毒的筛选纯化，其中图12A：箭头所指细胞群在常光下；图13B：箭头所指的细胞群在蓝光下发出绿色荧光。
图14.本发明所构建的BHV-1TK-重组病毒PCR鉴定，图中泳道1：ddH20为模板做阴性对照；泳道2：pZF08-21为模板做阳性对照；泳道3：PCR扩增260b的片段鉴定TK上下游同源臂；泳道M：DL2000DNA molecular marker。
图15.本发明所构建的pZF09-15重组转移质粒与辅助质粒pBICP0和BHV-1基因组共转染MDBK细胞，其中：图14A：箭头所指的细胞群在蓝光下发出绿色荧光；图14B：箭头所指细胞群在常光下。
图16本发明所构建的BHV-1TK-/gE-/EGFP+重组病毒筛选纯化，其中图16A：箭头所指的细胞群在蓝光下发出绿色荧光；图16B：箭头所指细胞群在常光下；图16C：空斑纯化的最终结果。
图17.本发明所构建的BHV-1TK-/gE-/EGFP+重组病毒PCR鉴定，图中泳道1：以BHV-1DNA为模板用Ecto PCR扩增出0.3kb的片段；泳道2：以BHV-1TK-/EGFP+DNA为模板用Ecto PCR扩增出0.3kb的片段；泳道3：以ddH20为模板用Ecto PCR检验；泳道4、5：以BHV-1DNA为模板用Ecto PCR检验；泳道M：DL2000DNA molecular marker。
图18.本发明构建的BHV-1TK-/gE-/EGFP+中gE缺失的示意图。虚线部分为缺失的碱基。
图19牛疱疹病毒1型BHV-1TK-/gE-/EGFP+和野生型牛疱疹病毒1型BHV-1病毒分别接种牛后的症状。
具体实施方式
以下结合说明书附图和实施例对本发明做进一步的说明，但不是限制本发明。
实施例1 EGFP基因表达盒及TK、gE上下游同源臂的PCR扩增
根据GenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)上发表的牛疱疹病毒1型(BHV-1)基因组的全长核苷酸序列(Genbank登录号为AJ004801)，设计4对引物(引物对序列见表1，所有引物由北京奥科生物技术有限公司合成)，以BHV-1基因组DNA为模板，分别扩增TK基因(图2)和gE基因(图3)的上下游同源臂。将质粒pEGFP-C1(购自美国Clontec laboratoties公司)用BamH I和Bgl Ⅱ双酶切，以去除多克隆位点，T4连接酶连接后作为模板，扩增EGFP表达盒。扩增条件祥见表2。分别扩增出EGFP基因表达盒约1900bp的片段，与预期大小相符(见图4)。
表1EGFP基因表达盒及TK、gE上下游同源臂扩增所用引物
表注：引物序列的下划线部分表示酶切位点。
表2EGFP基因及TK、gE基因上下游同源臂和PCR验证的扩增条件
实施例2
转染载体的构建
将载体质粒pBluescriptII SK+(由华中农业大学动物医学院周复春赠送)分别用XbaI和EcoR I双酶切、EcoR I和HindⅢ(所有限制性内切酶购自宝生物工程(大连)有限公司)双酶切。TK上游同源臂PCR产物用XbaI和EcoR I双酶切、下游同源臂PCR产物用EcoR I和Hind Ⅲ双酶切。连接到载体pBluescriptII SK+上。将限制性内切酶XbaI和EcoR I双酶切的TK上游同源臂定向插入到上游的克隆载体pBluescriptII SK+中再插入EcoR I和Hind Ⅲ双酶切的TK下游同源臂，构建了中间转移载体，并命名为pZF08-21(见图1A)。然后插入EGFP表达盒，构建成重组转移质粒，将其命名为pZF07-16(见图1A)。经过限制性内切酶切和测序鉴定后，同时转染HeLa细胞(中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心)，以鉴定EGFP的表达。用脂质体法(脂质体转染试剂盒购自GIBCO公司。货号：18064-14)转染HeLa细胞后，可以看到，作为标 记基因的EGFP表达盒表达正常(图6)，表明所构建的转移质粒pZF07-16正确，可用于共转染。
将载体质粒pcDNA3.1(+)myc-His B(购自美国invitrogen公司)分别用Hind Ⅲ和Kpn I双酶切、BamH I和EcoR I双酶切，上游同源臂用Hind Ⅲ和Kpn I双酶切、下游同源臂BamH I和EcoR I双酶切，分别连接到载体pcDNA3.1(+)myc-His B上。用BamH I和EcoR I酶切下游同源臂，将下游同源臂定向插入到上游的pBluescriptII SK+克隆载体中，构建了中间转移载体，并命名为pZF09-08(见图1A)。由图7可见，转移质粒pZF09-08双酶切和单酶切结果均与预期相符。
实施例3 牛传染性鼻气管炎ΔTK/ΔgE基因缺失标志毒株的构建和鉴定
1.BHV-1TK-/EGFP+重组病毒同源重组和筛选纯化
使用磷酸钙法(定明，2010)将实施例2获得的重组转移质粒pZF07-16、辅助质粒pBICP0和BHV-1基因组共转染MDBK细胞(购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心)，共转染后4h，更换新鲜DMEM培养基(配制方法：将商品化的1L装DMEM粉剂溶于900mL灭菌ddH2O中，加入3.7g NaHCO3，用HCl调节pH值至6.8左右，补水定容至1000mL后，在超净台上用0.22μm的滤膜过滤除菌，分装后4℃保存；DMEM粉末购自GIBCO BRL公司，货号：12800-017)。第二天，将6孔细胞培养板中的细胞消化传代，转移至一新的T25细胞培养瓶中，置于37℃5％CO2培养箱中培养，50h后在荧光显微镜下观察，可以看到多团绿色荧光信号，而在可见光下相同的视野里，可以看到一片失去了正常形态并逐渐脱落、降解的被病毒侵染死亡的细胞，得到重组病毒(图8)，进入筛选纯化过程。
将观察到成功重组的病毒液-80℃冻存，取出冻融后接毒于铺满单层MDBK细胞的细胞用平皿中，第一次筛选为了便于寻找、提高效率，采用25cm的大平皿，后面几次用15cm的小平皿即可。感染互作2h后，吸弃病毒液，补加由2×无酚红DMEM培养基(26.8g无酚红DMEM粉剂溶于900mL灭菌ddH2O中，加入7.4gNaHCO3，用HCl调节pH值到6.8左右，用单蒸水定容至1000mL后，在超净台上用0.22μm的滤膜过滤除菌，4℃保存。无酚红DMEM粉剂购自美国HyClone实验室公司，货号：SH30211.15)和加热呈液态的低熔点琼脂糖(购自原平皓生物技术有限公司)按体积比1∶1混合的改良的DMEM培养基。待培养基凝固后置于37℃、5％CO2培养箱中培养，42-60小时内，在荧光显微镜下轮流用荧光和正常光观察，寻找呈团状、空斑状绿色荧光区域(图9A、B)。用移液器吸取，置于干净的预先加入500μl生长液(在DMEM培养基中加入10％的无支原体新生牛血清、100U/mL的青霉素、链霉素，少量配置，4℃保存备用)的2mL细胞冻存管中，做好标记。如此反复，经过7次纯化，获得了纯的BHV-1TK-/EGFP+重组病毒，侵染细胞后全部发出绿色荧光。
2.BHV-1TK-/EGFP+重组病毒PCR和Southern Blot鉴定
以BHV-1TK-/EGFP+DNA为模板，设计引物P11、P12、P13、P14(见表1)扩增TK基因上、下游同源臂和EGFP的接头处，另设pZF07-16质粒模板为阳性对照，分别扩增出336bp和381bp的特异性片段，与预期大小相符(图10)，证实了所操作的TK基因已经缺失，重组病毒正确。以P11、P14为两端引物扩增缺失TK基因之后的剩余片段，回收后连入pMD18-T载体，进行测序。结果比较BHV-1全基因组序列，显示该基因组缺失了上述632bp的TK基因(见图11)。
扩增的BHV-1TK基因下游同源臂和EGFP接头处的PCR片段381bp为模板制备标记探针(探针特异性利敏感性都非常的高)。以BHV-1野毒基因组和BHV-1TK-/EGFP+基因组为标记底物，经Sph I充分 酶切后，进行southern blot分析(地高辛标记southern试剂盒购自上海罗氏制药有限公司。货号：11745832910)。在BHV-1中，TK基因所在的片段大小为3526bp，而在BHV-1TK-/EGFP+重组株中，我们缺失了630bp的TK基因，同时又在其位点上插入了EGFP表达盒，所以此段的特异性长度由大约3.5kp变成了4.8kp(图10)。在BHV-1野毒株中约3.5kb处出现杂交条带，同时在BHV-1TK-/EGFP+重组株中，约4.8kb处出现杂交条带，与预期相符(图12)，进一步证实了所操作的TK基因已经缺失，重组病毒正确。
3.BHV-1TK-重组病毒同源重组和筛选纯化
在获得了BHV-1TK-/EGFP+重组病毒的基础上，再次以磷酸钙转染法将重组转移质粒pZF08-21、质粒pBICP0和BHV-1TK-/EGFP+基因组DNA共转染MDBK细胞，以同源重组的方式去掉EGFP荧光标签。共转染后4h，更换新鲜DMEM培养基，第二天，将6孔细胞培养板中的细胞消化传代，转移至新的细胞培养瓶中，37℃、5％CO2培养箱中培养，48h后荧光显微镜下观察。由于在大片荧光中寻找极少数清晰的不发光的空斑比较困难，本实验重复多次，终于观察到所筛选的空斑。可确定重组成功(图13)进入筛选纯化过程，经过5轮纯化成功的获得了BHV-1TK-突变株(仅仅缺失TK基因)。
4.BHV-1TK-重组病毒PCR鉴定
以BHV-1TK-DNA为模板，使用之前扩增BHV-1TK上、下游同源臂与EGFP连接处上下端的P11和P14为扩增引物，另设pZF08-21质粒模板为阳性对照，水为阴性对照。扩增出260bp的特异性片段，与预期大小相符(图14)，PCR结果说明了EGFP基因已经被去除，验证了TK-重组病毒的构建成功。
5.BHV-1TK-/gE-/EGFP+重组病毒同源重组和筛选纯化
将KpnI和HindIII酶切的重组转移质粒pZF09-15、辅助质粒pBICP0和BHV-1TK-基因组通过磷酸钙法共转染到MDBK细胞上，共转染后4h，更换新鲜DMEM培养基，第二天，将6孔细胞培养板中的细胞消化传代，转移至新的T25细胞培养瓶中，37℃5％CO2培养箱中培养，72h后荧光显微镜下观察。由于观察及时，在可见光下可以看到明显的细胞病变形成的空斑，空斑周围细胞肿胀变大变圆，而且同一个视野相同位置，在荧光下可以看到多团绿色荧光信号，有此可确定重组成功(图15)。
纯化方法同BHV-1TK-/EGFP+重组病毒筛选操作方法，于细胞接毒后48-72h，在荧光显微镜下轮流用荧光和正常光观察，寻找呈团状、空斑状、周围胀大变圆的绿色荧光区域(图16A、图16B)。经过7次筛选和纯化，获得了纯的BHV-1TK-/gE-/EGFP+重组病毒。
6.BHV-1TK-/gE-/EGFP+重组病毒PCR鉴定
设计引物P15、P16，分别以BHV-1、BHV-1TK-/EGFP+、水以及BHV-1TK-/gE-/EGFP+为模板DNA，扩增缺失掉的gE基因部分片段Ecto，扩增结果(图17)显示，当以BHV-1、BHV-1TK-/EGFP+为模板时，均扩增出337bp的特异性片段，且与预期大小相符，而以水和BHV-1TK-/gE-/EGFP+为模板时，未扩增出特异性片段，证实了gE基因已经缺失，验证了重组病毒的正确性。我们将片段回收后，连入pMD18-T载体，进行了测序。结果比较全基因组序列，显示缺失了该段1.7kp的gE基因(图18)。
实施例4 牛传染性鼻气管炎ΔTK/ΔgE基因缺失标志菌株BHV-1TK-/gE-/EGFP+疫苗的制备
接种前，先将BHV-1TK-/gE-/EGFP+病毒液连续作10倍倍比稀释，取适当的稀释度(一般为10-5、10-6、10-7)的病毒液200μL/孔加入到长满单层MDBK细胞的24孔板上，吸附2h后(期间振荡混匀几次)，直接覆盖配好的4％羧甲基纤维素钠培养基(8.0g羧甲基纤维素钠，溶于500.0mL灭菌ddH2O中，快速剧烈摇晃混和，加入500.0mL无酚红DMEM培养液(2×)，摇床上过夜摇匀，4℃保存)再加入3％新生牛血清，48-72h后，待细胞出现病变或蚀斑时，各孔补满10％中性甲醛，固定1d(4h以上即可)，弃掉孔中液体，流水侧板冲洗数次，各孔补加配好的结晶紫溶液(0.35％、w/v)，染色15min后，弃掉染液，继续冲洗数次，在37℃温箱中敞口烘干，显微镜下计数。在所测得的PFU基础上，按0.01个MOI的量接种BHV-1种毒于长满单层的MDBK细胞上，48-72小时后，观察直至80％以上细胞出现裂解或者拉网状脱落时，可收获培养物。-80℃冻融3次后，先低速离心去除细胞等杂质，取上清液缓慢加入到预先制备好的30％蔗糖下层，然后低温超速离心(OptimaTM LE-80K ultracentrifuge，SW28rotor，27000r/min×120min)。弃上清取沉淀，用少量ddH2O溶解，置于4℃冰箱内溶解过夜后使用(殷震，刘景华，1997)。
实施例5 牛传染性鼻气管炎ΔTK/ΔgE基因缺失标志菌株BHV-1TK-/gE-/EGFP+疫苗安全性试验
将公奶牛按试验组和对照组分栏分组，其中对照组6头，试验组9头。在试验组中，以4×105PFU的本发明的BHV-1TK-/gE-/EGFP+病毒接种2头，以4×106PFU的缺失活病毒接种3头，以4×107PFU的缺失活病毒接种3头(采用鼻腔滴鼻接种试验动物，左右鼻孔各2ml相应浓度的缺失病毒液)，另设空白对照组。同时在4×107PFU栏中喂养未接种免疫的牛只作为同居组，做同居试验。每天观察精神状况和死亡情况，分别于0d、1d、3d、5d、7d、9d、14d和21d测量体温和收集鼻眼拭子，并间隔1周采血1次，以检测血清中和抗体水平。采集鼻眼拭子后，迅速放在冰上。带回实验室后，置于-80℃冰箱中放置1天，快速融化后2000r/min离心15min，转移液体于1.5ml EPP管中，-80℃保存。为了测量抗体变化规律，在颈部采集血液后，一部分血液迅速打入抗凝管中并快速上下混匀，避免凝集；另一部分血液在做好标记后倾斜静置，便于血液凝集、析出血清。带回实验室后，置于37℃培养箱中放置30min至析出血清，4℃冰箱放置1h，短暂离心后，分装上清于1.5ml EPP管中，-20℃保存。
表3安全性试验分组
BHV-1TK-/gE-/EGFP+接种后，牛只精神状态正常，饮食及粪便均正常，缺失病毒接种前后体温变化均在正常波动范围，具体情况见表4：
表4本发明的BHV-1TK-/gE-/EGFP+疫苗接种前后牛只体温变化
表5本发明的BHV-1TK-/gE-/EGFP+疫苗接种后分毒情况
表注：“-”表示阴性；“+”表示阳性。
为了调查排毒情况，将采集的鼻眼拭子从-80℃冰箱中取出快速融化，短暂离心后取样品连续做10倍梯度稀释，分别接200μl/孔样品原液、10-1、10-2、10-3稀释液于铺满单层MDBK细胞的24孔板中，作用2h后，吸弃液体，补加含3％新生牛血清的4％羧甲基纤维素钠培养基1ml/孔，置于37℃5％CO2培养箱中培养72h，观察是否出现CPE孔。在检测的13批次105个样品中，仅在滴鼻攻毒后的第一天和第三天的107组中共检出4个样品含有少量病毒，其余(包含同居牛样品)均不能检出(表9)。
比较各组所有样品的BHV-1病毒检出情况，仅有两天分离出了BHV-1病毒，分别是在免疫后的第一天和第三天。而其的样品均不能检出BHV-1病毒的存在，说明经过免疫的牛，不能排出BHV-1缺失病毒，进而感染其它牛。同居试验的牛只样品也没有分离到BHV-1病毒，说明没有发生同居感染，因而该BHV-1病毒对未接种的靶动物没有潜在的危险性。证明其具有良好的安全性。
实施例6 牛传染性鼻气管炎ΔTK/ΔgE基因缺失标志毒株BHV-1TK-/gE-/EGFP+疫苗再激活试验
表6再激活试验分组
为了进一步验证该疫苗的安全性，从试验组分组中各选一头健康公牛做再激活试验：编号分别为105 组24号、106组9号、107组29号。从28d开始连续3天，通过肌肉注射3ml(5mg/ml)的地塞米松，以激活处于潜伏状态的病毒，持续观察一周，测量体温、采集鼻眼拭子。采集鼻眼拭子后，迅速放在冰上。带回实验室后，置于-80℃冰箱中放置1天，快速融化后2000r/min离心15min，转移拭子液于1.5ml EP管中，-80℃保存。将分装的鼻眼拭子液做连续10倍稀释，取适当稀释度(一般为原液、10-1、10-2、10-3)的BHV-1病毒液200μL/孔接于24孔板长满单层的MDBK细胞上，吸附2h左右，覆盖配好的4％羧甲基纤维素钠培养基(含3％新生牛血清)，48-72h后，各孔补满10％中性甲醛，固定1d(4h以上即可)，弃孔中的液体，用流水侧板冲洗数次，各孔加结品紫(0.35％、w/v)，覆盖15min，弃去染液，继续冲洗数次，用温箱(37℃)烘干，显微镜下观察是否有病变形成的空斑，即是否含有BHV-1病毒。
在表10中可以看出，经过地塞米松再激活后，试验牛只体温变化仍均在正常波动范围。在分毒试验中，在所检测的所有样品里，均无法检出BHV-1病毒(包含同居牛样品)。再次表明该疫苗具有良好的安全性。
表7本发明的BHV-1TK-/gE-/EGFP+疫苗再激活前后牛只体温变化
实施例7牛传染性鼻气管炎ΔTK/ΔgE基因缺失标志毒株BHV-1TK-/gE-/EGFP+疫苗血清中和试验
按固定病毒—稀释血清法(Rovozzo G.C.and Burke C.N.，1973)，测定各组免疫后7d、14d、21d、28d血清的50％中和效价。测定BHV-1TK-/gE-/EGFP+病毒液的TCID50，将测好TCID50的病毒液稀释成200个TCID50的病毒悬液。在96孔微量培养板中将血清(预先56℃灭活30min)做连续倍比稀释，每个稀释度做4孔。在上述各孔内加入500μl稀释好的病毒液，混匀后放入37℃5％CO2培养箱中作用45min-60min。同时设待检血清毒性对照，阴、阳性血清对照，病毒对照和正常细胞对照，其中病毒对照要做200个TCID50、20个TCID50、2个TCID50、0.2个TCID504个不同浓度的对照。感作完成后每孔加入100μl细胞悬液，置于37℃5％CO2培养箱中培养，逐日观察并记录结果，一般要观察5-7天。结果计算，按Reed-Muench两氏法(TCID50的测定。1g TCID50＝距离比例×稀释度对数之间的差值+高于50％病变率的稀释度对数，其中距离比例＝(高于50％病变率的百分数-50％)(/高于50％病变率的百分数-低于50％病变率的百分数)。)。其中，105组的血清中和抗体很低，其余两组数据如表8：
表8免疫后试验牛只的中和抗体变化
实施例8牛传染性鼻气管炎ΔTK/ΔgE基因缺失标志毒株BHV-1TK-/gE-/EGFP+疫苗保护力试验
表9保护力试验分组
在安全性试验的基础上，我们紧接着连续性的进行了保护力试验。将两月龄公奶牛分为双缺失病毒免疫组和空白对照组2个组。免疫组由梯度分为105、106、107三栏，分开饲养。试验中，分别用4X105、4X106、4X107PFU的BHV-1TK-/gE-/EGFP+基因缺失活病毒接种免疫4周后，和免疫DMEM的空白组同时以4X107PFU BHV-1病毒攻击(免疫和攻毒均采用鼻腔滴鼻接种试验动物，左右鼻孔各2ml4X105、4X106、4X107PFU的BHV-1TK-/gE-/EGFP+基因缺失活病毒液和4X107PFU BHV-1病毒液)每天观察精神状况和死亡情况并采集样品。
在表10中可以看到，空白对照组出现了较为严重、典型的症状。在攻毒后14天，死亡一只。同时精神状态一致出现紧张、抑郁、少动、喜窝，饮食上变得少食厌食，呼吸沉闷、声音很粗、在早晚安静情况下尤为明显，同时伴有间歇性的咳嗽。有大量鼻黏液和眼屎。而免疫组中除了105组可能由于免疫剂量低，保护力不足也出现了部分症状，其余均十分正常，说明均能提供较强保护力。
表10BHV-1WT攻毒后结果
表注：表10中，“+”表示出现典型症状，，“-”表示没有症状。
在对照组中，出现了明显的鼻黏液(图19A)，还有继发感染结膜炎产生的颗粒状眼屎(图19B)，部分牛只甚至出现了咳嗽、呼吸苦难，而在免疫组中并未见此现象产生(图19C)。由此可见，缺失突变株BHV-1TK-/gE-/EGFP+的接种对试验牛提供了很强的保护力。在使用BHV-1WT强毒株攻毒后28天后，对试验动物进行了宰杀。结果发现，在免疫组接种的牛只气管中，既没有发现典型的出血、干酪样渗出物，也没有坏死、溃疡、黏液的症状，是十分正常的(图19D)，进一步表明其为试验动物提供了坚强的保护。
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