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1、10申请公布号CN104211742A43申请公布日20141217CN104211742A21申请号201410169585X22申请日20140425C07H19/11200601C07F9/6574200601A61K47/48200601A61K9/127200601A61K9/14200601A61K9/107200601A61P1/16200601A61P31/12200601A61P35/0020060171申请人中国人民解放军军事医学科学院放射与辐射医学研究所地址100850北京市海淀区太平路27号72发明人金义光杜丽娜汪珊54发明名称用于病毒性肝炎和肝癌治疗的磷酰N脂肪酰核苷。
2、类似物57摘要本发明公开了一种用于病毒性肝炎和肝癌治疗的磷酰N脂肪酰核苷类似物，其特征在于核苷类似物用环磷酰化基团修饰后，再连接不同碳原子数的脂肪链。该磷酰N脂肪酰核苷类似物可以方便地制备得到纳米传递系统，且具有明显肝细胞靶向性和肿瘤靶向性。纳米传递系统包括脂质体、非离子表面活性剂泡囊、纳米粒、纳米乳、自组装传递系统。核苷类药物选自拉米夫定、阿糖腺苷、西多福韦、吉西他滨、阿糖胞苷、阿扎胞苷、氟达拉滨。磷酰N脂肪酰核苷类似物的纳米传递系统经静脉给药后，可发挥靶向性治疗病毒性肝炎和肝癌的效果。51INTCL权利要求书1页说明书11页附图4页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书。
3、1页说明书11页附图4页10申请公布号CN104211742ACN104211742A1/1页21一种磷酰N脂肪酰核苷类似物，其特征是结构为HEPNUL其中HEP代表在核苷糖环5位羟基或短脂肪链羟基取代的环磷酰化基团，NU是核苷类似物基团，L代表脂肪链，并且L中的碳数在820之间。2如权利要求1所述的磷酰N脂肪酰核苷类似物，其中脂肪链的原型分子选自正辛酸、正癸酸、十二酸、十四酸、十六酸、十八酸、二十酸。3如权利要求1所述的磷酰N脂肪酰核苷类似物，其中核苷类似物原型分子，选自拉米夫定、阿糖腺苷、西多福韦、吉西他滨、阿糖胞苷、阿扎胞苷、氟达拉滨。4如权利要求1所述的磷酰N脂肪酰核苷类似物，其中核苷。
4、类似物原型分子，是拉米夫定。5如权利要求1所述的磷酰N脂肪酰核苷类似物，其中核苷类似物原型分子，是吉西他滨。6一种纳米传递系统，其特征是它包括权利要求1的磷酰N脂肪酰核苷类似物，并且选自脂质体、非离子表面活性剂泡囊、纳米粒、纳米乳、自组装传递系统。7如权利要求6的纳米传递系统，其中自组装传递系统的粒子组成中权利要求1的磷酰N脂肪酰核苷类似物的量占全部组成成分的分子摩尔比例在50100之间，其余为添加剂。8如权利要求6的纳米传递系统，其中自组装传递系统的粒子全部由权利要求1的磷酰N脂肪酰核苷类似物组成。9如权利要求6的纳米传递系统，是磷酰N十二酰吉西他滨自组装传递系统。10如权利要求6的纳米传递。
5、系统，是磷酰N十二酰吉西他滨长循环自组装传递系统。权利要求书CN104211742A1/11页3用于病毒性肝炎和肝癌治疗的磷酰N脂肪酰核苷类似物技术领域0001本发明涉及化学和生物医药领域，特别涉及一种磷酰N脂肪酰核苷类似物，由该化合物可制备纳米传递系统，包括脂质体、非离子表面活性剂囊泡、纳米粒、纳米乳、自组装传递系统。背景技术0002肝组织细胞可分为肝实质细胞和非实质细胞。非实质细胞主要包括枯否细胞等具有吞噬功能的细胞，属于单核巨噬细胞系统MPS。肝脏恶性肿瘤包括肝实质细胞癌HCC，简称肝癌、胆管细胞癌、肝内血管肉瘤及肝内转移性肿瘤等，其中90为肝实质细胞癌，是全球除胃癌和食管癌外的第3种常。
6、见肿瘤。我国是肝癌发病率最高的国家，比西方国家高10倍以上，仅次于肺癌居第2位。我国肝癌发病人数占全球的55，而死亡人数约占全世界肝癌死亡人数的45。在可导致肝癌的多项危险因素中，乙型肝炎病毒HBV感染、丙型肝炎病毒HCV感染和酒精位列前3位。HBV或HCV作为嗜肝病毒，主要感染肝实质细胞，继而引发肝实质细胞肿瘤。特别是由于HBV感染还没有得到有效控制，我国肝癌发病率保持持续上升势头。0003核苷NUCLEOSIDES是生物体内的重要化学成分，由它衍生得到的核苷酸以及核酸是遗传信息的携带者。最重要的遗传物质DNA和RNA就是由核苷酸组装而成。核苷和核苷酸也参与生物体内许多重要的反应。自然界中的。
7、核苷由一个嘌呤或嘧啶碱基与一个五碳糖结合而成。碱基包括腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶、胸腺嘧啶，五碳糖为核糖和脱氧核糖，并由它们分别组成腺苷、鸟苷、胞苷和尿苷，以及脱氧腺苷、脱氧鸟苷、脱氧胞苷和脱氧胸苷。0004核苷类似物NUCLEOSIDEANALOGUES，NU是一类重要的化学物质。它的结构特征与核苷类似。人们已经合成了多种核苷类似物，发现其中有许多具有药理活性，例如抗病毒作用、细胞毒作用、免疫抑制作用等。目前对核苷类似物活性的考查主要集中在抗病毒和抗癌方面。抗病毒的核苷类似物在体内经过病毒和人体细胞的激酶磷酸化作用后形成磷酸化核苷类似物，后者可通过各种途径抑制病毒。根据不同作用功能部位，。
8、它们可以分为DNA聚合酶抑制剂、DNA还原酶抑制剂、胸苷激酶抑制剂、RNA酶抑制剂、逆转录酶抑制剂等，临床上用于治疗疱疹病毒、巨细胞病毒、水痘病毒、流感病毒、肝炎病毒、SARS病毒、艾滋病毒HIV、脑炎病毒等感染。因为病毒的复制在细胞内完成，所以大多数抑制病毒复制增殖过程的抗病毒药物需要进入细胞内才能发挥抗病毒作用。核苷类似物的水溶性一般较强，使得细胞内核苷类物质不易渗出，这是由细胞维持生命本能决定的。同时外界核苷类似物也较难进入细胞内部，即许多核苷类似物的细胞膜渗透性不好。因此许多核苷类似物药物口服生物利用度差，细胞内浓度小，影响了抗病毒作用的发挥，并且药物长期在细胞内保持低浓度还有可能使病。
9、毒产生耐药性。抗癌的核苷类似物一般是一种抗代谢物，通过抑制核酸合成发挥细胞毒作用，同样它们也需要进入细胞内才能发挥作用。因此抗癌核苷类似物也存在生物利用度较低、穿越细胞膜和血脑屏障较难等问题。说明书CN104211742A2/11页40005人们设计了很多方法来解决核苷类似物的生物利用度和细胞摄取问题，例如合成前药和设计特殊的药物传递系统，其中脂溶性前药和脂质体给药系统比较引人注目。脂溶性前药给药有一定困难。因为脂溶性药物不溶或难溶于水，一般制剂，如片剂和注射剂无法解决其在水溶液中的分散和溶解问题。药物一般需要以分子或高度分散状态的分子聚集体形式才能吸收和进入细胞。人体内环境呈水性，生物膜呈脂。
10、溶性，药物或药物传递系统需在体内多次穿越生物膜，才能达到细胞等作用靶部位。如果不溶性的脂溶性药物无法溶解或高度分散，就无法有效地传递药物。0006脂质体LIPOSOMES是一种由磷脂双分子层构成的囊泡，在水溶液中高度分散，可作为多种药物的载体。它的高度分散性使其在体内具有靶向、缓释等效果，口服具有淋巴趋向性，较易携带药物穿越血脑屏障，容易通过融合、内吞等途径进入细胞内。脂质体囊泡的磷脂双分子层膜将内部包裹的水相和外部水相隔开，双分子层内呈疏水性。药物根据其物理化学性质的不同分别包裹在内水相或膜中。一般地，水溶性药物在内水相中；脂溶性药物在膜层中。脂质体的制备是磷脂分子在水中自组装的过程，内外水。
11、相的体积比例不能很大。这些因素决定了大部分水溶性药物的包裹率较低50，有时还会很低5，并且包裹的药物有渗漏到外水相的可能。如果有合适的脂溶性基团如脂肪链，脂溶性药物分子就可插入到磷脂双分子层中，结合比较牢固，药物分子不容易脱掉，所以药物包裹率较高。因此为了增加某些水溶性药物在脂质体中的包裹率，人们往往采用了制备成带有长脂肪链的脂溶性前体药物的方式。如果在制备得到核苷类似物脂溶性前药的基础上，再制备成脂质体，可以增加包裹率，也同时具有了脂质体水溶液中高度分散性和脂溶性前药易渗透进入细胞的特点0007非离子表面活性剂囊泡NIOSOMES是指某些非离子表面活性剂如司盘60在一定条件下在水中自组装成囊。
12、泡结构，类似脂质体。它可作为药物载体，具有类似脂质体的一些体内外特征。0008纳米粒NANOPARTICLES一般是指纳米级分散的固体粒子，由于其高度分散性，作为药物载体有提高药物生物利用度、增强靶向性等特点。固体脂质纳米粒SLN采用人体相容的脂质材料作为主要辅料形成纳米粒，具有普通纳米粒的特点和生物相容性好的特点，近年来研究较多。0009绝大部分肿瘤内部血管生长迅速不规则，内部淋巴系统清除慢，存在肿瘤渗透增强因子，使大分子和纳米颗粒易滞留在肿瘤内部，称为“增强渗透和滞留效应”ENHANCEDPERMEABILITYANDRETENTION，EPR。纳米给药系统由于EPR效应可被动靶向到肿瘤。。
13、0010HEPDIRECT前药是一类新的磷酸酯和磷酸酯前药。它是1，3丙烷基酯类，包含一个4芳基环状取代基。该类前药对细胞色素P450CYP450催化的氧化断裂反应敏感，可以特异地被CYP450同工酶CYP3A4酶氧化，释放出活性核苷酸或核苷磷酸，发挥药效。CYP3A4酶主要在肝实质细胞中表达，其他细胞表达较少。因此HEPDIRECT前药只有在肝实质细胞中被特异性降解发挥作用，降低了前药对正常细胞的损伤，毒副作用降低。在肝炎和肝癌靶向治疗中意义重大。发明内容0011本发明人发明了一种磷酰N脂肪酰核苷类似物，其特征在于核苷类似物用环磷说明书CN104211742A3/11页5酰化基团修饰后，再连。
14、接不同碳原子数的脂肪链。本发明人出乎意料地发现由上述磷酰N脂肪酰核苷类似物可以方便地制备得到纳米传递系统，且具有明显肝细胞靶向性和肿瘤靶向性。根据前面所述，具有高度分散状态并且脂溶性较强的药物容易在体内进行传递，并且生物膜渗透性好。本发明因此首次设计并制备了具备上述功能的用于病毒性肝炎和肝癌治疗的磷酰N脂肪酰核苷类似物，并制备了其纳米传递系统。0012一般采用适当的某种反应将环磷酰化基团、核苷类似物、长脂肪链三者结合，得到磷酰N脂肪酰核苷类似物。磷酰N脂肪酰核苷类似物的结构为0013HEPNUL0014其中HEP代表在核苷糖环5位羟基或短脂肪链羟基取代的环磷酰化基团，NU是核苷类似物基团，L代。
15、表脂肪链，并且L中的碳数在820之间。0015一般情况下，可以先将环磷酰化基团与核苷类似物结合，再与长脂肪链结合，当然也可以将顺序颠倒。本发明中的长脂肪链碳数在820之间，它的原型分子优选自820个碳数的单羧基脂肪酸，如正辛酸、正癸酸、十二酸月桂酸、十四酸肉豆蔻酸、十六酸软脂酸、十八酸硬脂酸、二十酸花生酸。0016本发明中所述的用于制备磷酰N脂肪酰核苷类似物的核苷类似物原型分子，在分子结构特征方面一般含有活泼基团，如游离的羟基或氨基，优选的是核苷类似物分子中的非芳香环的脂肪链或环上有一个以上的羟基，更优选的是非芳香环的脂肪链或环上有一个羟基。本发明所述的核苷类似物没有要求其具有特殊作用，但优选。
16、的是在作用方面具有药理活性的药物，更优选的是具有抗病毒或抗癌作用的药物。抗病毒药物可以选自拉米夫定、阿糖腺苷、西多福韦，优选的是拉米夫定。抗肿瘤药物可以选自吉西他滨、阿糖胞苷、阿扎胞苷、氟达拉滨，优选的是吉西他滨。0017本发明中的磷酰N脂肪酰核苷类似物的合成步骤一般分为两个阶段。首先核苷类似物与环磷酰化基团发生酯化，然后再与脂肪链以酰胺键连接得到最终产物，或两个步骤倒置。在上述酰化反应中，可以采用酸或酸酐与羟基或氨基酰化；或酰氯与羟基或氨基酰化的方式；或羧酸先形成活化的中间体，然后与羟基或氨基酰化；或由羧酸直接与羟基或氨基酰化。通过参考相关文献方法和利用一般专业技术就可以得到高纯度的磷酰N脂。
17、肪酰核苷类似物。0018本发明中的磷酰N脂肪酰核苷类似物带有脂溶性较强的脂肪长链，可以将它们制备成纳米传递系统，选自脂质体、非离子表面活性剂囊泡、纳米粒、纳米乳剂型。这些纳米传递系统的粒子直径一般小于1微米，优选的是小于05微米，更优选的是小于02微米。制备方法可以参考相关文献方法和专业技术。0019一般地，如果采用薄膜分散法制备脂质体，可以将磷酰N脂肪酰核苷类似物与磷脂等膜材共同溶于有机溶剂，盛入烧瓶中，减压旋转蒸发，得到一层薄膜，然后加入水或适当缓冲液，进行振荡和超声，直至形成均匀的混悬液。如果超声时间延长，还可能得到纳米级分散系统。如果采用反相蒸发法制备脂质体，可以将磷酰N脂肪酰核苷类似。
18、物与磷脂等膜材共同溶于有机溶剂，加入水或缓冲液，高速搅拌或超声制备成乳剂，然后减压旋转蒸发，得到凝胶态物质，然后加入水或适当缓冲液或不加，继续减压旋转蒸发，直至形成均匀的脂质体混悬液。脂质体混悬液还可以选择适当处方并在适当条件下进行冷冻干燥或喷雾干燥，形成固体粉末状，这样可以保证制剂的稳定性，临用前加入水溶液振摇即可得到脂质说明书CN104211742A4/11页6体混悬液。运用同样的技术可以获得磷酰N脂肪酰核苷类似物的非离子表面活性剂囊泡。0020纳米粒制剂中的固体脂质纳米粒较适合于本发明中的磷酰N脂肪酰核苷类生物。一般地，将磷酰N脂肪酰核苷类似物与常温下为固态的脂质，如磷脂、脂肪酸、甘油酯。
19、，共同加热熔融，然后加入水或适当缓冲液，在加热情况下在高压乳匀机上循环乳化多次，形成纳米分散的乳滴，迅速冷却，使之固化，即得到磷酰N脂肪酰核苷类似物固体脂质纳米粒。用微乳法也可制得磷酰N脂肪酰核苷类似物固体脂质纳米粒。磷酰N脂肪酰核苷类似物纳米粒混悬液还可以选择适当处方并在适当条件下进行冷冻干燥或喷雾干燥，形成固体粉末状，这样可以保证制剂的稳定性，临用前加入水溶液振摇即可得到纳米粒混悬液。0021磷酰N脂肪酰核苷类似物纳米乳的制备可以参考常见的处方，一般包括乳化剂、助乳化剂、助溶剂、油相、水相。一般在选择合适的处方后，即可容易地形成纳米乳。如果选择合适的处方，一般包括乳化剂、助乳化剂、助溶剂、。
20、油相，还可以组成自纳米乳化系统，在加入适量水溶液后，系统可以自行分散成纳米乳。0022除了上述可以方便地得到的磷酰N脂肪酰核苷类似物的纳米传递系统外，本发明人还出乎意料地发现由于本发明中的磷酰N脂肪酰核苷类似物具有特殊的物理化学性质，特别是两亲性，由它自身或加入适量添加剂后在水溶液中可以自组装，形成纳米传递系统。磷酰N脂肪酰核苷类似物分子中含有脂溶性强的长脂肪链基团和极性较大的核苷基团，因此具有两亲性，这种物理化学性质类似于磷脂和某些表面活性剂。如果两亲性分子的分子结构满足一定条件，由它本身可以在水中自组装成纳米有序聚集体，例如双分子层、双分子层弯曲得到的囊泡和双分子层叠加得到的长形纳米粒。本。
21、发明中的磷酰N脂肪酰核苷类似物具有较长的并且脂溶性较强的长脂肪链基团和亲水性核苷基团，较容易形成双分子层，并进一步得到囊泡或长形纳米粒，不过某些条件下需加入一定量的添加剂。因此本发明首次设计并制备了由本发明中的磷酰N脂肪酰核苷类似物组成或加入适量添加剂的自组装传递系统。0023本发明中的由磷酰N脂肪酰核苷类似物组成的自组装传递系统的制备方法和脂质体等纳米传递系统的制备方法类似。通常是将磷酰N脂肪酰核苷类似物溶于某种有机溶剂，根据需要可以加入适当添加剂，然后进行分散。方法包括薄膜分散法、反相蒸发法、注入法、复乳法等。在某些情况下，添加剂不是必需的，此时传递系统全部由磷酰N脂肪酰核苷类似物组成。在。
22、某些情况下，单独用磷酰N脂肪酰核苷类似物不能形成很好的纳米粒子，此时需要加入适当添加剂，帮助其形成有序结构。是否需要加入添加剂根据磷酰N脂肪酰核苷类似物的物理化学性质决定，一般可以通过预实验来推断。0024本发明中的自组装传递系统中添加剂的量占全部组成成分的分子摩尔比例在050之间，优选的是030，更优选的是015，其余成分即为磷酰N脂肪酰核苷类似物。添加剂可以选自磷脂、多元醇酯类表面活性剂、聚氧乙烯类表面活性剂、双十六烷基磷脂酸、胆固醇及其衍生物、硬脂胺。磷脂包括合成磷脂、半合成磷脂、天然磷脂。其中合成磷脂又包括修饰的磷脂如聚乙二醇衍生化的磷脂、连接单克隆抗体的磷脂。多元醇酯类表面活性剂优选。
23、的是失水山梨醇脂肪酸酯，具体如司盘60、司盘40、司盘20。聚氧乙烯类表面活性剂优选的是聚氧乙烯聚氧丙烯嵌段共聚物又称泊洛沙姆，聚山梨酯和聚氧乙烯脂肪醇醚，具体如泊洛沙姆P188、吐温80、吐温60、吐温40、吐温20、苄泽35。胆固醇及其衍生物包括胆固醇、胆固醇的脂肪酸酯、聚乙二醇衍生化的胆固醇。说明书CN104211742A5/11页70025含磷酰N脂肪酰核苷类似物的纳米传递系统包括自组装传递系统，如果其组成或表面吸附有高度亲水的分子或分子片段，由于在体外环境或体内环境可以形成亲水性保护层，可以阻滞粒子间的聚合或在体内阻滞调理化作用而获得长循环效果。常用的亲水性分子或分子片段是聚乙二醇P。
24、EG。在本发明中，可以采用添加聚乙二醇衍生化的磷脂或聚乙二醇衍生化的胆固醇的方法制备得到表面亲水的磷酰N脂肪酰核苷类似物的纳米传递系统包括其自组装传递系统。附图说明0026图113苯基1，3丙二醇合成路线0027图213氯苯基1，3丙二醇N十二酰拉米夫定磷酸酯合成路线0028图3磷酰N脂肪酰吉西他滨单分子膜A等温曲线。磷酰N辛酰吉西他滨CPOG、磷酰N十二酰吉西他滨CPDG、磷酰N十四酰吉西他滨CPTG、磷酰N十六酰吉西他滨CPHG和磷酰N十八酰吉西他滨CPODG。0029图4磷酰N脂肪酰吉西他滨自组装传递系统的透射电镜照片。A磷酰N辛酰吉西他滨自组装传递系统；B磷酰N十二酰吉西他滨自组装传递。
25、系统；C磷酰N十四酰吉西他滨自组装传递系统；D磷酰N十六酰吉西他滨自组装传递系统；E磷酰N十八酰吉西他滨自组装传递系统。0030图5不同浓度磷酰N脂肪酰吉西他滨自组装传递系统对HEPG2细胞存活率的影响。吉西他滨GEM、磷酰N辛酰吉西他滨CPOG、磷酰N十二酰吉西他滨CPDG、磷酰N十四酰吉西他滨CPTG、磷酰N十六酰吉西他滨CPHG和磷酰N十八酰吉西他滨CPODG0031图6磷酰N十二酰吉西他滨CPDG自组装传递系统静脉注射后荷瘤小鼠体重变化率0032图7磷酰N十二酰吉西他滨自组装传递系统静脉注射后在荷H22瘤小鼠中的组织分布具体实施方式0033实施例1磷酰N脂肪酰吉西他滨的合成0034磷酰。
26、N脂肪酰吉西他滨的结构式为00350036其中R为单链脂肪链，并且RC7H15，C9H19，C11H23，C13H27，C15H31或C17H35首说明书CN104211742A6/11页8先合成13氯苯基1，3丙二醇。称取镁粉63G，026MOL，加入乙醇27ML和四氯化碳3ML，冰浴条件下搅拌，得白色固体。逐滴加入33ML乙酰乙酸乙酯026MOL、40ML乙醇和和30ML乙醚的混合液。05H后，再逐滴加入间氯苯甲酰氯33ML，026MOL，60油浴2H，待反应液冷却后倒入150ML冷水中，3M盐酸溶液调节PH值至4。取有机相，用5W/VNAHCO3、水各洗三遍后干燥，浓缩。向浓缩液中逐滴加。
27、入KOH269G，048MOL的乙醇液150ML室温搅拌过夜，浓缩后溶于390ML水中。再加入NH4CL297G，0556MOL和60ML30氨水，45油浴反应25H。二氯甲烷萃取后干燥，浓缩，得到13氯苯基1羰基丙酸乙酯，为橘红色液体。硅胶柱纯化环己烷乙酸乙酯81，V/V。取纯化产物226G，10MOL溶于32ML四氢呋喃THF中，缓慢加入硼氢化钠15G，4MOL65回流5MIN。再逐滴加入32ML甲醇于65回流4H。待冷却后加入3M稀盐酸溶液30ML，用乙酸乙酯萃取，干燥、浓缩、纯化石油醚乙酸乙酯41，V/V，得淡黄色油状物13氯苯基1，3丙二醇。0037第二步合成13氯苯基1，3磷酰内酯。
28、对硝基苯。称取对硝基苯酚347G，25MMOL，POCL3196ML，125MMOL和01GNACL回流6H，浓缩。取浓缩产物76G，298MMOL溶于150MLTHF中，冰浴条件下逐滴滴加13氯苯基1，3丙二醇30G，1610MMOL、三乙胺600ML，596MMOL和THF80ML的混合液。反应2H后继续向反应液中加82G对硝基苯酚59MMOL和84ML三乙胺，继续反应24H。浓缩，分别用水和乙酸乙酯萃取，取有机层分别用04MNAOH溶液、水、饱和盐水洗涤。干燥、浓缩后纯化乙酸乙酯石油醚37，V/V得黄白色固体。0038磷酰N脂肪酰吉西他滨选自磷酰N辛酰吉西他滨CPOG、磷酰N十二酰吉西他。
29、滨CPDG、磷酰N十四酰吉西他滨CPTG、磷酰N十六酰吉西他滨CPHG和磷酰N十八酰吉西他滨CPODG。下面以磷酰N十四酰吉西他滨CPTG的合成为例，其余衍生物的合成步骤类似。0039称取吉西他滨104G，4MMOL，适量N,N二甲基甲酰胺DMF溶解后，通入N25MIN，逐滴滴加TBUMGCL6ML，6MMOL，反应30MIN。逐滴加入13氯苯基1，3磷酰内酯对硝基苯148G，44MMOL，反应24H。浓缩并纯化二氯甲烷甲醇181，V/V得13氯苯基1，3磷酰内酯吉西他滨PHOSPHORYLNACYLGEMCITABINEDERIVATIVE，CPG，为黄色固体。取十四酸0456G2MMOL和。
30、8ML无水吡啶在冰浴条件下，逐滴滴加三光气016G，06MOL的THF溶液8ML，先冰浴反应5MIN，继续室温反应2H。逐滴滴加13氯苯基1，3磷酰内酯吉西他滨096G，2MMOL的DMF溶液，反应2H。浓缩后，用水和二氯甲烷萃取，取有机相分别用1MHCL溶液、水洗三遍。干燥，浓缩，纯化二氯甲烷乙醇451，V/V得到淡黄色蓬松状固体。0040磷酰N脂肪酰阿糖腺苷、磷酰N脂肪酰阿糖胞苷、磷酰N脂肪酰阿扎胞苷、磷酰N脂肪酰氟达拉滨的合成和磷酰N脂肪酰吉西他滨类似。0041实施例213氯苯基1，3丙二醇N十二酰拉米夫定磷酸酯0042本品是拉米夫定先与13氯苯基1，3丙二醇生成磷酸酯，再与十二酸酰胺化。
31、的产物，分子式C28H41CLN3O7PS，分子量64214。首先合成13氯苯基1，3丙二醇，具体步骤如下。取镁粉63G，026MOL加至圆底烧瓶中，加入乙醇27ML和四氯化碳3ML，在冰浴条件下搅拌混合。再往其中滴加乙酰乙酸乙酯33ML，026MOL的乙醇40ML和乙说明书CN104211742A7/11页9醚30ML液。反应05H，将混合液降温至0，再逐滴加入间氯苯甲酰氯33ML，026MOL，60反应2H，冷却。将反应液倒入冷水中150ML中并用盐酸溶液酸化至PH4。用分液漏斗分离有机相，5碳酸氢钠溶液和水各沈5次，干燥。往其中滴加氢氧化钾269G，048MOL的乙醇150ML溶液室温搅。
32、拌过夜。溶液浓缩后溶于水中390ML，加入氯化铵297G，0556MOL和30氨水60ML，45油浴混合搅拌25H。冷却后，用二氯甲烷萃取3次100ML3，合并有机相并用硫酸钠干燥，旋蒸除去溶剂，得橘红色液体。将所得物用硅胶色谱纯化，洗脱剂为环己烷乙酸乙酯81，得约5G产物13苯基1羰基丙酸乙酯。产率约10。取上一步纯化的1三氯苯基1羰基丙酸乙酯226G，10MMOL溶于32MLTHF中，加入硼氢化钠15G，4MMOL，65搅拌5MIN，回流搅拌时用恒压滴液漏斗滴加32ML甲醇。65油浴回流反应4H，冷却至室温，加入HCL水溶液30ML，用乙酸乙酯萃取3次，合并有机相并干燥，浓缩后纯化，洗脱剂。
33、选用石油醚乙酸乙酯41。得淡黄色油状物13苯基1，3丙二醇约13G，薄层层析显示一个斑点。产率约30。反应方程式见附图1。0043称取拉米夫定137G，6MMOL溶于30MLDMF，加入9ML吡啶。加入DCC37G，18MMOL和13氯苯基1，3丙二醇113G，6MMOL的DMF溶液，100油浴反应15H。70旋蒸基本除去DMF和吡啶，然后加入30ML甲醇萃取产物，用布氏漏斗抽滤除去DCU，滤液旋蒸除去溶剂后用硅胶色谱纯化，洗脱剂选用二氯甲烷甲醇181。旋蒸除去溶剂后，加入适量混合溶剂二氯甲烷/甲醇10/1溶解后置于冰箱重结晶，抽滤后得到拉米夫定磷酸酯前药。薄层层析显示一个斑点，产率约60。0。
34、044称取月桂酸15G，75MMOL于烧瓶中，加入2ML氯化亚砜，70油浴下回流反应1H，25旋蒸除去氯化亚砜。将生成的酰氯慢慢滴加入冰浴下搅拌的30ML拉米夫定磷酸酯前药115G，25MMOL吡啶溶液中。滴加完毕后5MIN撤去冰浴，室温下反应25H。60旋蒸除去大部分吡啶，加入20ML水，再加入20ML二氯甲烷。取有机层，用1MOL/LHCL溶液和01MOL/L柠檬酸溶液各洗三遍除去剩余吡啶。旋蒸除去溶剂后用硅胶色谱纯化，洗脱剂选用二氯甲烷甲醇401，最后得到淡黄色固体约06G，产率40。合成路线见附图2。薄层层析显示一个斑点。1HNMR显示，化学位移08823423H，CH3CH210，4。
35、501H，CHCH2CH2，724、732、742、7564H，C6H4，801H，HNNC。004513氯苯基1，3丙二醇N八酰拉米夫定磷酸酯、13氯苯基1，3丙二醇N十酰拉米夫定磷酸酯、13氯苯基1，3丙二醇N十四酰拉米夫定磷酸酯、13氯苯基1，3丙二醇N十六酰拉米夫定磷酸酯、13氯苯基1，3丙二醇N十八酰拉米夫定磷酸酯与13氯苯基1，3丙二醇N十二酰拉米夫定磷酸酯的合成步骤相似，只是更换不同的脂肪酸。0046实施例3磷酰N十二酰吉西他滨脂质体的制备0047取磷酰N十二酰吉西他滨25MG、大豆磷脂01G于250ML烧瓶中，用20ML二氯甲烷溶解，减压旋转蒸发，得到一层有机脂溶性膜，加入PH。
36、74的磷酸盐缓冲液10ML，振荡，大部分膜脱落，在50超声，直至得到均匀混悬液，显微镜下观察，大部分粒子直径小于1微米，即为磷酰N十二酰吉西他滨脂质体。0048实施例4磷酰N十六酰吉西他滨非离子表面活性剂囊泡的制备0049取磷酰N十六酰吉西他滨30MG、司盘60008G于250ML烧瓶中，用20ML二氯说明书CN104211742A8/11页10甲烷溶解，减压旋转蒸发，得到一层有机脂溶性膜，加入PH74的磷酸盐缓冲液10ML，振荡，大部分膜脱落，在50超声，直至得到磷酰N十六酰吉西他滨非离子表面活性剂囊泡的均匀混悬液，激光散射粒度分析仪检测，平均粒径为205NM。0050实施例513氯苯基1，。
37、3丙二醇N十二酰拉米夫定磷酸酯长循环脂质体的制备0051取13氯苯基1，3丙二醇N十二酰拉米夫定磷酸酯50MG、大豆磷脂01G、PEG化二硬脂酰磷脂酰乙醇胺PEGDSPE002G于烧瓶中，用20ML氯仿异丙醚11，V/V溶解，加入适量蒸馏水，超声使其成为乳剂，减压旋转蒸发，得到凝胶态物质，加入少量水，继续减压旋转蒸发，凝胶态物质脱落并分散成均匀混悬液，显微镜下观察，大部分粒子直径小于1微米，即为13氯苯基1，3丙二醇N十二酰拉米夫定磷酸酯长循环脂质体。0052实施例6磷酰N十八酰吉西他滨固体脂质纳米粒的制备0053取磷酰N十八酰吉西他滨50MG、单硬脂酸甘油酯07G、吐温80003G于烧杯中加。
38、热至80，逐渐加入含十二烷基硫酸钠10MG的80水10ML，保持温度不变，呈透明液体。再将其用注射器注入到高速搅拌的0水中，呈透明液体。在原子力显微镜下观察，多为100NM以下的粒子。该磷酰N十八酰吉西他滨固体脂质纳米粒混悬液可常温放置10天未见沉淀析出。该固体脂质纳米粒混悬液添加适当保护剂后冻干成固体粉末，临用前加入水，即成磷酰N十八酰吉西他滨固体脂质纳米粒混悬液。0054实施例7磷酰N脂肪酰吉西他滨自组装传递系统的制备0055取磷酰N脂肪酰吉西他滨25MG，溶于甲醇中，配制成5MG/ML的溶液。在涡旋状态下，用微量注射器将溶液缓慢注入到纯水液面下，重复数次，直至不能再注入如果再注入，会出现。
39、明显沉淀。将新制备的自组装传递系统放置于烧瓶中，在37下减压除去有机溶剂，得到取磷酰N脂肪酰吉西他滨自组装传递系统。该自组装传递系统分散效果好，性质稳定，室温可放置一个月以上。该自组装传递系统进一步进行水浴和减压，可蒸发部分水分，可将药物浓度浓缩到某个值。具体制备了磷酰N辛酰吉西他滨自组装传递系统、磷酰N十二酰吉西他滨自组装传递系统、磷酰N十四酰吉西他滨自组装传递系统、磷酰N十六酰吉西他滨自组装传递系统和磷酰N十八酰吉西他滨自组装传递系统。0056实施例8磷酰N十二酰吉西他滨长循环自组装传递系统的制备0057称取胆固醇基聚乙二醇1500CHSPEG150020MG，四氢呋喃溶解并定容至10ML。
40、，得2MG/ML的溶液。称取磷酰N十二酰吉西他滨68MG，加入上述溶液溶解。在涡旋状态下，用微量注射器将溶液缓慢注入到纯水液面下，重复数次，直至不能再注入如果再注入，会出现明显沉淀。将新制备的自组装传递系统放置于烧瓶中，在25下减压除去有机溶剂，得到取磷酰N脂肪酰吉西他滨长循环自组装传递系统。0058实验例1磷酰N脂肪酰吉西他滨LANGMUIR膜性质考察0059分别将实施例1合成的磷酰N脂肪酰吉西他滨用氯仿甲醇91，V/V配成浓度为1MG/ML的溶液，用微量进样器取25L缓慢滴加于LANGMUIR膜天平水平面上25，维持15MIN，然后滑障以10MM/MIN速度挤压水平面，通过计算机软件记录并。
41、绘制表面压与分子截面积A的A曲线附图3。证明几种磷酰N脂肪酰吉西他滨有很好的两亲性。说明书CN104211742A109/11页110060实验例2磷酰N脂肪酰吉西他滨自组装传递系统性质考察0061分别取实施例7制备的磷酰N脂肪酰吉西他滨自组装传递系统5L滴在喷碳铜网表面，1MIN后在铜网一侧边缘吸多余液体，再用5L2磷钨酸W/V溶液染色，1MIN后在铜网一侧吸走多余液体，空气中晾干，透射电镜下观察其形态附图4。0062分别取组装体磷酰N脂肪酰吉西他滨自组装传递系统12ML加到样品池中，测定自组装传递系统粒径，测定温度为25。类似方法测定自组装传递系统的ZETA电位。磷酰N辛酰吉西他滨、磷酰N。
42、十二酰吉西他滨、磷酰N十四酰吉西他滨、磷酰N十六酰吉西他滨和磷酰N十八酰吉西他滨的粒径分别为956、1251、1432、2647、3037NM；ZETA电位分别为208、310、257、350、326MV。自组装传递系统稳定，室温下放置1个月，粒径没有明显改变。0063实验例3磷酰N十二酰吉西他滨自组装传递系统细胞药效学评价0064配置吉西他滨的磷酸盐溶液、实施例7制备的磷酰N十二酰吉西他滨自组装传递系统混悬液，浓度分别为125、25、5、10、20、40、80、160G/ML，每个样品浓度平行3孔，对照孔为完全培养基。HEPG2肝癌细胞于37、5CO2培养箱中培养，收集对数期细胞。细胞悬液稀。
43、释至05104个/ML后接种于96孔培养板，100L/孔，置于培养箱中继续培养24H。贴壁后每孔加药100L/孔，使每孔终体积为200L。继续培养24H后，加入MTT溶液20L/孔，继续孵育4H，弃去上清液，各孔加入150L二甲基亚砜，振荡10MIN，使结晶物充分溶解。用酶联免疫检测仪在490NM波长处测定各孔吸光值，按下式计算结果附图5。0065细胞存活率OD药物OD空白/OD对照OD空白1000066实验例4磷酰N十二酰吉西他滨自组装传递系统动物模型抗肿瘤药效学评价0067将腹水型H22小鼠肝癌细胞接种到雄性昆明小鼠腹腔内，7天后在无菌条件下抽取小鼠腹水，用灭菌生理盐水稀释成浓度约为210。
44、7个/ML的细胞悬液。每只小鼠左前侧腋下接种02ML含细胞4106个/ML。接种后第3天，挑选肿瘤大小相近的荷瘤小鼠随机分成七组，每组6只。A模型对照组按C组给药体积量给予等体积生理盐水；B阳性对照组GEM注射剂，5MG/ML，40MG/KG；C磷酰N十二酰吉西他滨自组装传递系统低剂量组静注，2684MG/KG，为B组1/4摩尔量；D磷酰N十二酰吉西他滨自组装传递系统高剂量组静注，5268MG/KG，为B组1/2摩尔量。0068第一次给药记作第一天，每三天给药一次，共给药三次，每天称量小鼠体重，计算体重变化率附图6。第八天处死，解剖取出肿瘤，称肿瘤湿重，计算抑瘤率表1。0069体重变化率治疗后。
45、平均体重治疗前平均体重/治疗后平均体重1000070抑瘤率对照组平均瘤重实验组平均瘤重/对照组平均瘤重1000071因为磷酰N十二酰吉西他滨自组装传递系统高剂量组相当于吉西他滨组1/2摩尔量，所以磷酰N十二酰吉西他滨自组装传递系统抗肿瘤效果明显。0072表1磷酰N十二酰吉西他滨自组装传递系统对荷瘤昆明小鼠的抑瘤率0073说明书CN104211742A1110/11页120074自组装传递系统低剂量组磷酰N十二酰吉西他滨自组装传递系统低剂量组，相当于吉西他滨组1/4摩尔量0075自组装传递系统高剂量组磷酰N十二酰吉西他滨自组装传递系统高剂量组，相当于吉西他滨组1/2摩尔量0076实验例5磷酰N十。
46、二酰吉西他滨自组装传递系统的组织分布0077荷瘤小鼠模型的建立。将肝癌细胞H22注射到雄性昆明小鼠腹腔内，培养至腹腔长满腹水后在无菌条件下抽取小鼠腹水，用生理盐水稀释成浓度约为2107个/ML的细胞悬液。每只小鼠左前侧腋下接种02ML的细胞悬液含细胞4106个/ML。接种后第3天，挑选20只肿瘤大小相近的荷瘤小鼠给药。0078组织分布方案。取荷瘤小鼠20只，随机分为4组，每组5只，尾静脉注射实施例7制备的磷酰N十二酰吉西他滨自组装传递系统后，分别于05、1、15、2H处死小鼠，解剖取心、肝、脾、肺、肾，将上述组织在生理盐水中冲洗，然后称组织湿重。加入等量的超纯水匀浆，3000RPM离心10MI。
47、N取上清液，分别取10L上清液，加入蛋白沉淀剂90L，涡旋2MIN，3000RPM离心10MIN，取上清液20L，测定磷酰N十二酰吉西他滨CPDG浓度。0079磷酰N十二酰吉西他滨自组装传递系统静脉注射给荷H22瘤小鼠后，磷酰N十二酰吉西他滨大部分分布在肝脏和肿瘤附图7。这主要是由于磷酰N十二酰吉西他滨自组装传递系统的靶向作用和肿瘤EPR效应，使其主要被肝和肿瘤摄取。尾静脉注射给药05H后，荷瘤小鼠体内各组织中磷酰N十二酰吉西他滨含量占给药剂量的百分含量如表2。其中肝脏磷酰N十二酰吉西他滨含量最高，占给药剂量的3579。磷酰N十二酰吉西他滨在肿瘤部位为2158，证明磷酰N十二酰吉西他滨自组装传。
48、递系统对肿瘤有靶向作用。0080表205H后磷酰N十二酰吉西他滨在荷瘤小鼠各组织中的百分比含量0081肝心肾脾肺肿瘤占给药剂量百分率3579023023135034215800820083实验例6磷酰N十二酰吉西他滨长循环自组装传递系统动物模型抗肿瘤药效学评价0084将鼠源肝癌细胞H22注射到雄性昆明小鼠腹腔内，培养至腹腔长满腹水后在无菌条件下抽取小鼠腹水，离心，取上层液，用生理盐水稀释成浓度约为2107个/ML的细胞悬液。每只小鼠左前侧腋下接种02ML的细胞悬液含细胞4106个/M1。接种后第3天，挑选28只肿瘤大小相近的荷瘤小鼠给药。取建模成功小鼠，随机分成四组，每组8只。A说明书CN10。
49、4211742A1211/11页13阴性对照组生理盐水；B阳性对照注射组吉西他滨5MG/ML；C注射组低剂量实施例8制备的磷酰N十二酰吉西他滨长循环自组装传递系统相当于B组吉西他滨1/4摩尔量；D注射组高剂量实施例8制备的磷酰N十二酰吉西他滨长循环自组装传递系统相当于B组吉西他滨1/2摩尔量。0085给药剂量分别为B组按30MG/KG给药，C组按193MG磷酰N十二酰吉西他滨/KG为B组1/4摩尔量，D组按3861MG磷酰N十二酰吉西他滨/KG为B组1/2摩尔量，A组按D组给药体积量给予等体积生理盐水。第一次给药记作第一天，每三天给药一次，共给药三次，每天称量小鼠体重，测肿瘤体积。0086药效评价方法同实验例4。抑瘤率结果见表30087表3磷酰N十二酰吉西他滨长循环自组装传递系统对荷瘤昆明小鼠的抑瘤率00880089自组装传递系统低剂量组磷酰N十二酰吉西他滨长循环自组装传递系统低剂量组，相当于吉西他滨组1/4摩尔量0090自组装传递系统高剂量组磷酰N十二酰吉西他滨长循环自组装传递系统高剂量组，相当于吉西他滨组1/2摩尔量0091高剂量磷酰N十二酰吉西他滨长循环自组装传递系。