《鉴定儿茶酚O甲基转移酶调节剂的方法.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《鉴定儿茶酚O甲基转移酶调节剂的方法.pdf（14页珍藏版）》请在专利查询网上搜索。
1、(10)申请公布号 CN 103026236 A (43)申请公布日 2013.04.03 CN 103026236 A *CN103026236A* (21)申请号 201180036632.8 (22)申请日 2011.07.25 10170957.4 2010.07.27 EP G01N 33/58(2006.01) G01N 33/573(2006.01) G01N 33/542(2006.01) C12Q 1/48(2006.01) (71)申请人 弗哈夫曼 - 拉罗切有限公司 地址 瑞士巴塞尔 (72)发明人 T恩德勒 D罗特 (74)专利代理机构 北京市中咨律师事务所 11247。
2、 代理人 黄革生 林柏楠 (54) 发明名称 鉴定儿茶酚 O- 甲基转移酶调节剂的方法 (57) 摘要 本发明涉及用于鉴定儿茶酚 O- 甲基转移酶 (COMT) 酶活性的调节剂的方法。 (30)优先权数据 (85)PCT申请进入国家阶段日 2013.01.25 (86)PCT申请的申请数据 PCT/EP2011/062704 2011.07.25 (87)PCT申请的公布数据 WO2012/013614 EN 2012.02.02 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 5 页 序列表 2 页 附图 5 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1。
3、 页 说明书 5 页 序列表 2 页 附图 5 页 1/1 页 2 1. 鉴定儿茶酚 O- 甲基转移酶 (COMT) 活性的调节剂的方法， 所述方法包括以下步骤 ： a) 提供与荧光染料共价连接的 COMT 底物， b) 将步骤 a) 的分子与儿茶酚 O- 甲基转移酶 (COMT)、 S- 腺苷甲硫氨酸 (SAM) 和候选 化合物接触， 和 c) 测量步骤 b) 的混合物的荧光读数， 其中在候选化合物存在下较之空白改变的荧光 读数指示为儿茶酚 O- 甲基转移酶 (COMT) 的调节剂。 2.权利要求1的方法， 其中方法是用于鉴定COMT抑制剂的方法， 并且步骤c)中较之空 白降低的荧光读数指示。
4、为 COMT 抑制剂。 3. 权利要求 1 或 2 的方法， 其中 COMT 底物是 4- 硝基儿茶酚。 4. 权利要求 1 至 3 的方法， 其中荧光染料是 Alexa488。 5. 前述权利要求中任一项的方法， 其中步骤 c) 中的荧光读数是动力学读数。 6. 前述权利要求中任一项的方法， 其中 COMT 是人 COMT。 7. 前述权利要求中任一项的方法， 其中方法是高通量筛选方法。 8. 前述权利要求中任一项的方法， 其中方法在微量滴定板上进行。 9. 前述权利要求中任一项的方法， 其中 COMT 的终浓度是约 25mM。 10. 前述权利要求中任一项的方法， 其中 COMT 底物的终。
5、浓度是约 200nM。 11. 前述权利要求中任一项的方法， 其中 SAM 的终浓度是约 500nM。 12. 鉴定儿茶酚 O- 甲基转移酶 (COMT) 的底物的方法， 所述方法包括以下步骤 ： a) 提供包含与荧光染料共价连接的 COMT 底物和 S- 腺苷甲硫氨酸 (SAM) 的混合物， b) 将步骤 a) 的混合物与不同浓度的候选化合物接触， c) 将步骤 b) 的混合物与儿茶酚 O- 甲基转移酶 (COMT) 接触， 和 d) 测量步骤 c) 的混合物的动力学荧光读数， 其中降低的荧光读数稳定水平作为增加 的浓度的候选化合物的函数指示为儿茶酚 O- 甲基转移酶 (COMT) 的底物。。
6、 13. 权利要求 12 的方法， 其中 COMT 底物是 4- 硝基儿茶酚。 14. 权利要求 12 或 13 的方法， 其中荧光染料是 Alexa488。 权 利 要 求 书 CN 103026236 A 2 1/5 页 3 鉴定儿茶酚 O- 甲基转移酶调节剂的方法 0001 本发明涉及鉴定儿茶酚 O- 甲基转移酶的酶活性的调节剂的方法 0002 儿茶酚 O- 甲基转移酶 (COMT) 催化具有儿茶酚部分的底物的 O- 甲基化。被 COMT 甲基化中的甲基供体是 S- 腺苷甲硫氨酸 (SAM)。COMT 在内源性儿茶酚胺神经递质、 儿茶酚 雌激素和异生分子的分解代谢中起重要作用。 COMT。
7、的抑制是开发帕金森症的新治疗方法的 重要途径。 0003 W.F.Herblin(Analytical Biochemistry51， 19-22， 1973) 描述了用于 COMT 活性 的比色测定。该测定使用硝基儿茶酚作为 COMT 的甲基受体。在酸性 pH 下， 硝基儿茶酚在 水中以黄色溶液形式存在， 最大吸收在 350nm 处。在微碱性 pH 下， 对位羟基的电离使溶液 变为橙色 (max 430nm)。在较强的碱中， 间位羟基的电离导致樱桃红色溶液 (max 520nm)。测定基于观测到硝基儿茶酚被 COMT 甲基化， 并且甲基化的硝基儿茶酚不再表现出 由于第二次电离导致的樱桃红色。。
8、在此测定中底物 ( 硝基儿茶酚 ) 和 SASM 必须在 M 浓 度范围内， 所述范围处于或高于限制灵敏度的 Km。 0004 G.Zrcher 和 M.Da Prada(Journal of Neurochemistry， Vol.38， No.1， 1982) 描 述了 COMT 活性的单步放射化学测定。在此测定中， 通过将 COMT 与 3H 甲基 SAM、 Mg2+和腺 苷脱氨基酶孵育， 儿茶酚被转化为氚化的愈创木酚， 它是具有非常低极性的化合物。 用低极 性介质例如甲苯提取愈创木酚， 并用闪烁计数器计数。 0005 由于有限的灵敏度(比色测定)或由于测定设置(放射化学测定中的提取步骤。
9、)， 上述测定不适于自动化筛选大量的化合物的 COMT 调节剂活性。 0006 因此， 存在对适于筛选大量化合物的 COMT 调节活性的灵敏、 均质的测定方法的需 求。 0007 在第一个目的中， 本发明提供鉴定儿茶酚 O- 甲基转移酶 (COMT) 活性的调节剂的 方法， 包括以下步骤 ： 0008 a) 提供与荧光染料共价连接的 COMT 底物， 0009 b) 将步骤 a) 的分子与儿茶酚 O- 甲基转移酶 (COMT)、 S- 腺苷甲硫氨酸 (SAM) 和 候选化合物接触， 和 0010 c) 测量步骤 b) 的混合物的荧光读数， 其中在候选化合物存在下较之空白改变的 荧光读数指示为儿。
10、茶酚 O- 甲基转移酶 (COMT) 的调节剂。 0011 在优选的实施方式中， 方法是用于鉴定COMT抑制剂的方法， 其中步骤c)中较之空 白降低的荧光读数指示为 COMT 抑制剂。 0012 在另外优选的实施方式中 COMT 底物是 4- 硝基儿茶酚。 0013 在另外优选的实施方式中荧光染料是 Alexa488。 0014 在另外优选的实施方式中步骤 c) 中的荧光读数是动力学读数。 0015 在另外优选的实施方式中 COMT 是人 COMT。 0016 在另外优选的实施方式中方法是高通量筛选方法。 0017 在另外优选的实施方式中方法在微量滴定板中进行。 0018 在另外优选的实施方式。
11、中 COMT 的终浓度是约 25nM。 说 明 书 CN 103026236 A 3 2/5 页 4 0019 在另外优选的实施方式中 COMT 底物的终浓度是约 200nM。 0020 在另外优选的实施方式中 SAM 的终浓度是约 500nM。 0021 在第二个目的中， 本发明提供鉴定儿茶酚O-甲基转移酶(COMT)的底物方法， 包括 以下步骤 ： 0022 a) 提供包含与荧光染料共价连接的 COMT 底物和 S- 腺苷甲硫氨酸 (SAM) 的混合 物， 0023 b) 将步骤 a) 的混合物与不同浓度的候选化合物接触， 0024 c) 将步骤 b) 的混合物与儿茶酚 O- 甲基转移酶 。
12、(COMT) 接触， 和 0025 d) 测量步骤 c) 的混合物的动力学荧光读数， 其中降低的荧光读数稳定水平作为 增加的候选化合物浓度的函数指示为儿茶酚 O- 甲基转移酶 (COMT) 的底物。 0026 在优选的实施方式中 COMT 底物是 4- 硝基儿茶酚。 0027 在另外优选的实施方式中荧光染料是 Alexa488。 0028 附图简述 0029 图 1 显示了与 4- 硝基儿茶酚共价偶联的 Alexa488 的化学结构 ； 0030 图 2 显示了硝基儿茶酚 ( 蓝色 )、 2- 甲氧基 -5- 硝基苯酚 ( 红色 ) 和 1， 2- 二甲 氧基 -4- 硝基苯 ( 绿色 ) 的。
13、 Stern Volmer 曲线 ； 将 20nM 游离 Alexa Fluor 488 分别与高 至 25mM 浓度的硝基儿茶酚、 2- 甲氧基 -5- 硝基苯酚和 1， 2- 二甲氧基 -4- 硝基苯混合。仅 对于硝基儿茶酚观察到了 Alexa488 荧光强度 (10/I) 的变化， 甲基化产物不影响 Alexa488 的荧光强度。 0031 图 3 显示了在本发明的荧光测定中， COMT 催化的 Alexa488- 硝基儿茶 酚的甲基化的酶动力学 ； 0032 图 4a 显示了在多种浓度的 COMT 抑制剂托卡朋 (Tolcapone) 存在下， 荧光强度的 变化的动力学测量 ； 003。
14、3 图 4b 显示了从图 3a 的动力学测量的斜率计算的托卡朋的剂量应答曲线 ； 0034 图 5 显示了在 COMT 的天然底物多巴胺存在下的荧光测定。随着增加的多巴胺浓 度， 达到降低的稳定水平。 由于多巴胺是底物， 它和Alexa488-硝基儿茶酚底物被 甲基化。SAM 的可获得性被限制 (500nM)， 使得在高多巴胺浓度下， Alexa488- 硝 基儿茶酚底物不再能够被完全甲基化。 0035 图 6 显示了低 (500nM) 和高 (200M)SAM 浓度下， 以及对每个 SAM 浓度在加入 Alexa488- 硝基儿茶酚底物前有和没有预孵育化合物和 SAM1 小时的底物的剂量 应。
15、答曲线。与低 SAM 的预孵育将剂量应答曲线移动至较低的 IC50因为化合物耗尽了 SAM。 在高 SAM 浓度下， 有和没有预孵育之间没有差别， 因为 SAM 不限制， 并且与低 SAM 相比， 剂量 应答曲线移动至较高 IC50， 因为化合物被耗尽。 0036 图 7 显示了低 (500nM) 和高 (200M)SAM 浓度下， 有和没有预孵育化合物与 SAM1 小时的 SAM 竞争化合物的剂量应答曲线。对于 SAM 竞争化合物， 在每个 SAM 浓度， 有和没有 预孵育不影响 IC50， 但在高 SAM 浓度， IC50移动至较大值。 0037 发明详述 0038 本发明的测定基于这样的。
16、发现， 即共价偶联至COMT底物的荧光染料(例如共价偶 说 明 书 CN 103026236 A 4 3/5 页 5 联至硝基儿茶酚的 Alexa488) 由于分子内淬灭， 表现出降低的荧光， 以及 COMT 底 物 - 荧光染料复合物中 COMT 底物被 COMT 甲基化消除了荧光的淬灭， 即较之未甲基化的复 合物， COMT 底物 - 荧光染料复合物中 COMT 底物的甲基化导致荧光增加。 0039 术语 “COMT” 在本文中用于指来自任何动物例如哺乳动物物种， 包括人类的天然序 列 COMT， 和 COMT 变体 ( 在下文中进一步限定 )。COMT 多肽可从多种来源， 包括人组织类型。
17、 分离， 或通过重组和 / 或合成方法制备。 0040 此测定中能够使用天然或重组生产的 COMT。 “重组蛋白质” 是依靠在异源细胞中 表达， 分离、 纯化或鉴定的蛋白质， 所述细胞已经用改造为驱动蛋白质在宿主细胞中表达的 重组表达载体瞬时或稳定地转化或转染。 能够在原核细胞(例如大肠杆菌)、 酵母(例如粟 酒裂殖酵母 ) 或真核细胞 ( 例如 HEK293、 Sf9 昆虫细胞 ) 中生产重组 COMT。优选地， Sf9 昆 虫细胞被用于重组 COMT 的高表达。用于测定的 COMT 可为纯化的。如本文所用的术语 “纯 化的” 指从其天然环境或重组生产源移出的、 分离的或分开的多肽， 并且至。
18、少 60， 更优选 地至少 80不含与其天然缔合的其它组分， 例如膜和微粒体。 0041 “天然序列 COMT” 指与天然存在的 COMT 多肽具有相同氨基酸序列的多肽， 无论其 制备方式。天然序列 COMT 可从自然界分离， 或通过重组和 / 或合成方法制备。术语 “天然 序列 COMT” 特别涵盖 COMT 的天然存在的截短的或分泌的形式、 天然存在的变体形式 ( 例如 可变剪接形式 ) 和天然存在的等位基因变体。人 COMT 多肽在 NCBI 数据库中的标识符是 AAA68927(Seq.Id.No.1)。 0042 术语 “COMT 变体” 指天然序列 COMT 的氨基酸序列变体， 在。
19、天然序列中含有一个或 多个氨基酸替换和/或缺失和/或插入。 氨基酸序列变体通常与天然序列COMT的氨基酸序 列具有至少约75， 优选地至少约80， 更优选地至少约85， 甚至更优选地至少约90， 最优选地至少约 95的序列同一性。 0043 术语 “化合物” 在本文中用于关于本发明的测定描述的上下文 “测试化合物” 或 “药 物候选化合物” 。 同样地， 这些化合物包含源自合成的或从天然来源得到的有机或无机化合 物。 化合物包括特征为相对低分子量的无机和有机化合物， 例如多核苷酸、 脂类或激素类似 物。其他生物聚合有机测试化合物包括包含从约 2 至约 40 个氨基酸的多肽和包含从约 40 至约。
20、 500 个氨基酸的较大的多肽， 例如抗体或抗体缀合物。 0044 术语 “动力学读数” 指在酶促反应线性部分中的某两个时间点处测量的荧光信号 的差异。一次测量在酶促反应开始时进行 ( 起点 )， 并在孵育时间后进行第二次读数 ( 终 点 )。然后以 rfu/min 计算最终信号为 (rfu( 终点 )-rfu( 起点 )/ 孵育时间。(rfu ： 相对 荧光单位 )。 0045 本发明的方法可用于鉴定抑制酶儿茶酚O-甲基转移酶(COMT)的化合物。 因此， 由 本发明的方法鉴定的 COMT 抑制剂可用于其中 COMT 钝化神经元外儿茶酚胺起作用的治疗、 预防或控制疾病的方法， 例如在预防或控。
21、制抑郁中。在此情况下本发明的化合物可用作单 独的化合物或与其他有利地影响病程的治疗活性物质组合使用。 本发明的化合物也可与其 他治疗活性物质共同用药。 0046 本发明的方法可用于测定用测试化合物处理过的动物组织样品中 COMT 的活性。 例如， 测定适于测定来自动物 ( 例如小鼠和大鼠 ) 的脑和肝脏组织样品中的 COMT 活性， 所 述动物已经用测试化合物 (COMT 调节剂 ) 处理过。 说 明 书 CN 103026236 A 5 4/5 页 6 0047 实验部分 0048 4- 硝基儿茶酚 -Alexa488 的合成 0049 将含有 1三乙胺的 DMSO 中的氨乙基 - 硝基 -。
22、 邻苯二酚的 10mM 溶液 1 与含有 1三乙胺的DMSO中的Alexa488羧酸琥珀酰亚胺酯的10mM溶液2(Invitrogen Corporation， 5791Van Allen Way， Carlsbad， California92008) 以 1 1 的化学计量比混 合。将反应混合物在室温轻轻混合过夜， 在Explorer100 反相 HPLC 上纯化。将产品 冻干并重悬于 DMSO。 0050 0051 4- 硝基儿茶酚 -Alexa488 0052 荧光测定方法 0053 以下测定方法、 试剂和材料用于本发明的实施例。实施例的结果在图 1-7 描述。 0054 微量滴定板 ：。
23、 0055 384 孔微量滴定板， Corning 黑色透明平底， 非结合性表面， 聚苯乙烯 (ref.3655) 0056 试剂和缓冲液储液 ： 0057 缓冲液储液 ： 说 明 书 CN 103026236 A 6 5/5 页 7 0058 -M 磷酸盐缓冲液 pH7.6(Na2HPO4Fluka71644， NaH2PO4Merck6346.0500)， 储存于 4。 0059 -580mM MgCl2(Merck1.0833.0250)， 储存于室温。 0060 -1M CaCl2储存于 4。 0061 -65mM DTT(Sigma D-0632)， 储存于 -20。 0062 重组。
24、人 COMT ： 室内制备， 储存于 -80。 0063 4-硝基儿茶酚-Alexa488 ： 室内制备， 1.3mM在DMSO中， 室温储存于暗 处 0064 S- 腺苷甲硫氨酸 ： 10mM 在 H2O 中 (Sigma-Aldirch A2804)， 储存于 -20 0065 试剂和缓冲溶液 ： 0066 测定缓冲液 ( 终浓度 ) ： 0067 -40mM 磷酸盐缓冲液 pH7.6 0068 -2.88mM MgCl2 0069 -0.9mM DTT 0070 -0.25mM CaCl2 0071 化合物稀释 ： 在 100 DMSO 中 (Sigma41640) 稀释， 最终测定浓度。
25、 6.25 DMSO 0072 重组人 COMT ： 测定缓冲液中 80nM， 最终测定浓度 25nM 0073 4- 硝基儿茶酚 -Alexa488 ： 测定缓冲液中 320nM， 最终测定浓度 200nM 0074 S- 腺苷甲硫氨酸 ： 测定缓冲液中 800nM， 最终测定浓度 500nM 测定方法 0075 10l hCOMT( 人 COMT) 0076 2l 测试化合物 0077 摇床上 1min 0078 20l 底物 -SAM 混合物 0079 摇床上 5min 0080 读数 ： 在板 : 视觉 TM 读数器上的动力学测量 (exc.475(40)nm， em.535(45)n。
26、m， 强 度 7.5， 曝光时间 1s)。 说 明 书 CN 103026236 A 7 1/2 页 8 0001 0002 序 列 表 CN 103026236 A 8 2/2 页 9 序 列 表 CN 103026236 A 9 1/5 页 10 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 103026236 A 10 2/5 页 11 图 3 说 明 书 附 图 CN 103026236 A 11 3/5 页 12 图 4a 图 4b 说 明 书 附 图 CN 103026236 A 12 4/5 页 13 图 5 图 6 说 明 书 附 图 CN 103026236 A 13 5/5 页 14 图 7 说 明 书 附 图 CN 103026236 A 14 。