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1、(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201410734580.7(22)申请日 2014.12.05C07K 7/08(2006.01)C12N 15/11(2006.01)A61K 38/16(2006.01)A61P 25/00(2006.01)A61P 9/10(2006.01)A61P 7/02(2006.01)(71)申请人 华中科技大学地址 430074 湖北省武汉市洪山区珞喻路1037 号(72)发明人 旺姗 裴磊 颜欢欢 郭豫 李浩唐娜 庞培 鲁友明(74)专利代理机构 华中科技大学专利中心 42201代理人 曹葆青(54) 发明名称一种小分子多肽、其应用及。
2、产品(57) 摘要本发明公开了一种小分子多肽、其应用及产品。实验表明，所述小分子多肽，其应用于制备降低缺血后神经元坏死药物、降低缺血后神经元凋亡药物及防治缺血性卒中药物，具有良好的效果与实际操作可行性。本发明提供的产品，为其活性成分包括所述小分子多肽的防治缺血性卒中的药物，其为医学上可接受的剂型，优选为注射剂。(51)Int.Cl.(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请权利要求书1页 说明书9页序列表2页 附图4页(10)申请公布号 CN 104497106 A(43)申请公布日 2015.04.08CN 104497106 A1/1 页21.一种小分子多肽，其特征在于，其序。
3、列为 SEQ ID NO.1 所示。2.编码如权利要求 1 所述小分子多肽的核苷酸序列。3.一种如权利要求 1 所述的小分子多肽的应用，其应用于制备降低缺血后神经元坏死药物。4.一种如权利要求 1 所述的小分子多肽的应用，其应用于制备降低缺血后神经元凋亡药物。5.一种如权利要求 1 所述的小分子多肽的应用，其应用于制备防治缺血性卒中药物。6.一种防治缺血性卒中的药物，其特征在于，其活性成分包括如权利要求 1 所述的小分子多肽，其为医学上可接受的剂型，优选为注射剂。权 利 要 求 书CN 104497106 A1/9 页3一种小分子多肽、其应用及产品技术领域0001 本发明属于生物医药领域，更具。
4、体地，涉及一种小分子多肽、其应用及产品。背景技术0002 缺血性脑卒中是由于脑血流中断，引起血栓形成或栓塞，导致大脑局部缺血的一类严重的神经疾病，患者会出现语言功能损伤，视力丧失，瘫痪甚至死亡。脑卒中发病率、死亡率、致残率居高不下，伴随着人口老龄化的加剧，脑卒中的发生率还在逐渐上升。被公认为目前严重危害人类健康和生命安全的常见难治性疾病。0003 尽管如此，目前针对脑缺血造成的损害所采取的治疗手段却非常有限，目前唯一有效的治疗是运用组织纤溶酶原激活物 (tPA) 的溶栓疗法。然而，出于安全考虑和溶栓治疗的时间窗较窄(小于4.5小时)，多数患者只能得到对症支持治疗。目前实验室针对脑缺血治疗所开发。
5、的小分子化合物已超过 1000 种，并开展了约 200 项临床试验，但所有这些方法运用到临床都面临失败。卒中的研究走在了十字路口，若要取得突破，则必须对传统治疗手段的利弊进行再评价，与此同时，还应研究新的策略来指导临床。因此，针对缺血性卒中脑损伤，开发新的药物来对抗脑损伤并保护神经细胞显得格外重要。发明内容0004 针对现有技术的以上缺陷或改进需求，本发明提供了一种小分子多肽、其应用及产品，其目的在于提供一种小分子多肽，对于缺血性神经细胞损伤具有修复作用，可用于制备防治缺血性卒中药物，由此解决目前针对脑缺血造成的损伤所采取的质量手段有限的技术问题。0005 为实现上述目的，按照本发明的一个方面。
6、，提供了一种小分子多肽，其序列为 SEQ ID NO.1 所示。0006 按照本发明的另一方面，提供了编码所述小分子多肽的核苷酸序列。0007 按照本发明的另一方面，提供了所述的小分子多肽的应用，其应用于制备降低缺血后神经元坏死药物。0008 按照本发明的另一方面，提供了所述的小分子多肽的应用，其应用于制备降低缺血后神经元凋亡药物。0009 按照本发明的另一方面，提供了所述的小分子多肽的应用，其应用于制备防治缺血性卒中药物。0010 总体而言，通过本发明所构思的以上技术方案与现有技术相比能够取得下列有益效果 ：0011 (1) 本发明提供的小分子多肽，和对照组相比，对于缺血后神经元具有明显的滋。
7、养作用，实验表明，其应用于制备降低缺血后神经元凋亡药物及防治缺血性卒中药物，具有良好的效果 ；0012 (2) 本发明所涉及的小分子多肽纯度高，可溶，适合静脉注射，无毒副作用，便于转说 明 书CN 104497106 A2/9 页4化生产 ；0013 (3) 本发明提供的小分子多肽，意在采用静脉注射的方式达到改善缺血性卒中后神经系统症状，减少缺血性卒中神经细胞死亡和脑损伤的目的，其可以经血液穿过血脑屏障被神经元摄取，可以转化应用于神经系统疾病如缺血性卒中，使其具有实际操作的可行性。附图说明0014 图 1 是实施例 1 制备本发明提供的小分子多肽的色谱图 ；0015 图2是离体细胞水平实施例1。
8、中制备的小分子多肽对缺血性卒中治疗作用的流程图；0016 图3是离体细胞水平实施例1中制备的小分子多肽应用的最佳浓度探索结果示意图，其中图 3A 为应用不同浓度小分子多肽处理原代神经元免疫沉淀实验后免疫印迹条带图，图 3B 为图 3A 条带灰度统计图 ；0017 图 4 是实施例 1 中制备的小分子多肽减少氧糖剥夺 (OGD) 处理后神经元坏死，逆转 OGD 引起微兴奋性突触后电流 (mEPSC) 频率和幅度下降的结果统计图，其中图 4A 为碘化丙啶 (PI) 结果统计图，图 4B 为树突棘数目统计图，图 4C 为 mEPSC 频率统计图，图 4D 为mEPSC 幅度统计图 ；0018 图5是。
9、在体动物水平实施例1中制备的小分子多肽应用的最佳浓度和治疗时间窗探索结果示意图，其中图 5A 为静脉注射不同浓度小分子多肽免疫沉淀后免疫印迹结果示意图，图 5B 为大脑中动脉栓塞 (MCAO) 后不同时间点应用小分子多肽免疫沉淀后免疫印迹结果示意图 ；0019 图6是在体动物水平实施例1中制备的小分子多肽对缺血性卒中治疗作用的实施方案图 ；0020 图7是实施例1中制备的小分子多肽减少缺血性卒中后缺血梗死体积与神经元死亡的结果统计图，其中图 7A 为 TTC 染色结果示意图，图 7B 为 Fluoro-Jade C(FJ) 和 TUNEL染色结果示意图 ；0021 图8是实施例1中制备的小分子。
10、多肽改善缺血性卒中后神经系统症状及运动平衡功能的结果统计图，其中图 8A 为神经功能评分结果统计图，图 8B 为 1-5 分钟内小鼠旷场运动速度结果示意图，图 8C 为 Rotarod 转棒实验结果示意图。具体实施方式0022 为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。0023 本发明提供的小分子多肽，其序列为 SEQ ID NO.1 所示，为 ：0024 Tyr-Gly-A。
11、rg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg-Glu-Asp-Ser-Ser-Ser-Pro-Pro-Ser-Thr(YGRKKRRQRRR-EDSSSPPST)。0025 所述小分子多肽为商业化公司合成。说 明 书CN 104497106 A3/9 页50026 编码所述小分子多肽的核苷酸，其序列为 SEQ ID NO.2 所示序列及其同义序列。0027 本发明提供的小分子多肽具有滋养缺血后神经元的作用，可应用于制备降低缺血后神经元坏死药物及制备降低缺血后神经元凋亡药物，从而可应用于制备治疗或预防缺血性卒中药物的应用，具体如下 ：0028 (1) 缺血性卒中细胞模型应。
12、用所述小分子多肽0029 氧糖剥夺 (Oxygen Glucose Deprivation,OGD) 是一种缺血性中风的体外细胞模型。我们对体外培养 14 天的原代神经元给予 Lenti-EGFP-virus 显示树突棘，共聚焦显微镜下观察树突棘的密度，进行计数。对感染了 GFP 的神经元进行 60 分钟 OGD 处理，然后再观察树突棘的密度，结果树突棘密度明显下降。用 5M 的所述小分子多肽对培养的原代神经元进行孵育处理，OGD 处理，结果树突棘密度的下降得到抑制，说明所述小分子多肽处理可以在细胞水平降低缺血后神经元树突棘丢失。PI 染色检测 OGD 后神经元坏死情况，结果发现所述小分子多肽。
13、处理后坏死神经元数量较对照组明显下降。同时我们对 OGD 处理的原代神经元进行电生理记录，5M 的所述小分子多肽孵育处理能显著提高 AMPA 受体介导的mEPSC 幅度和频率 , 说明所述小分子多肽处理可以恢复 OGD 导致的突触功能损伤。0030 (2) 缺血性卒中动物模型应用所述小分子多肽0031 大脑中动脉栓塞 (Middle Cerebral Artery Occlusion,MCAO) 以及光照缺血栓塞模型广泛用于脑缺血研究中，通过向小鼠颈动脉中插入线拴堵塞大脑中动脉能引起大脑中动脉支配的皮层纹状体缺血，拔出线拴，则引起血流再灌注，从而引起缺血再灌注损伤，以模拟临床脑梗塞或脑栓塞的症。
14、状。光照缺血栓塞模型 ：小鼠腹腔注射 Rose bengal，暴露头皮，15 分钟后冷光源照射大脑局部，10 分钟后，移除冷光源，则光照区域内的血管形成血栓，其所支配的脑区则缺血。采用一系列的实验来检测小鼠缺血后的表型。TTC染色反映缺血梗死体积，FJ和TUNEL检测神经元死亡与凋亡的情况，转棒实验Rotarod反映动物协调平衡能力，神经系统功能评分(Neurological Score,N.S.)反映缺血后神经系统症状，旷场实验检测小鼠的运动能力。对动物缺血再灌注后3小时和6小时的小鼠股静脉注射2mg/kg的所述小分子多肽溶液，动物缺血再灌注第 3 天处理，TTC 染色显示给予所述小分子多肽。
15、的小鼠脑缺血梗死体积显著低于对照组实施例 1 制备的对照用小分子多肽或生理盐水 Vehicle组。而 FJ 和 TUNEL 染色也显示死亡的神经元大大减少。此外，所述小分子多肽注射的小鼠转棒行为学与旷场行为学结果均较实施例1制备的对照用小分子多肽或Vehicle组得到显著改善，神经症状评分也得到一致的结果。进一步证明，所述小分子多肽对缺血性卒中具有确切的治疗作用。0032 本发明提供的防治缺血性卒中的药物，其活性成分包括本发明提供的小分子多肽，浓度优选 5M 至 500M，其为医学上可接受的剂型，优选为注射剂。0033 以下为实施例 ：0034 实施例 1 本发明提供的小分子多肽及对照用小分子。
16、多肽的人工合成0035 本发明提供的小分子 RNA 序列如 SEQ ID NO.1 所示，由武汉百意欣生物技术有限公司人工合成，合成报告如下所示，色谱如图 1 所示。0036 人工合成 HPLC 报告0037 说 明 书CN 104497106 A4/9 页60038 表10039 处理通道说明 ：W2489 ChA 220nm0040 0041 合成后目标小分子多肽纯度为99，每支5mg，为白色粉末状，避光保存于-20度，完全可溶于水。使用前，用无菌生理盐水按指定浓度进行稀释配制。用于细胞或用于动物前，置于 37 度温箱预热。0042 对照用小分子多肽，序列为 ：0043 Tyr-Gly-A。
17、rg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg-Pro-Ser-Thr-Glu-Pro-Ser-Asp-Ser-Ser(YGRKKRRQRRR-PSTEPSDSS)。0044 合成方法、品质及使用方法同目标小分子多肽。0045 实施例 2 实施例 1 制备的的小分子多肽在缺血性卒中细胞模型 OGD 中的应用0046 (1) 原代神经元培养与缺血性卒中 OGD 细胞模型的构建0047 原代神经元培养是神经研究领域常用的实验技术。孕18-21天的母鼠，麻醉后从母鼠子宫取出胚胎期小鼠，迅速断头，于解剖液(含双抗和葡萄糖的D-Hanks溶液 ) 中取出大脑皮层组织，眼科剪剪碎组织。
18、，加入 1/2 体积的胰酶，37水浴锅中消化分离皮层细胞，每 5 分钟取出轻轻晃动，3x5 分钟后种植培养基终止消化，轻轻吹打，分散细胞，细胞筛过滤后种植于包被多聚赖氨酸和层粘连蛋白的玻璃片上，细胞种植密度约为100150 个细胞 / 平方毫米，3 小时神经元贴壁后换为含新鲜无血清 Neurobasal 培养基(21103,GIBCO) 与 2 B27 的维持培养基中，每隔 4 天更换新鲜相同培养基。培养 12 天后通过对培养的神经元进行神经元标记物 NeuN 的免疫细胞染色证明所培养细胞 85以上为神经元。0048 氧糖剥夺(oxygen glucose deprivation OGD)是在。
19、细胞水平上模拟缺血、低氧的刺激模型。通过对细胞培养条件的改变，包括将细胞放入低氧箱以及更换无糖的培养基。模拟细胞在缺血、低氧情况下的损伤，细胞会产生坏死、凋亡、自噬等现象。为模拟缺血性卒中的细胞模型，12 孔板中的神经元在培养第 14 天 (Days in vitro 10,DIV14) 给予氧糖剥夺(OGD) 处理，即将培养神经元的 12 孔板放入含 5 CO2，10 H2和 85 N2的厌氧培养箱中。用800l的去氧无糖碳酸氢盐溶液置换此前的培养液，并润洗三次，然后将细胞置于37摄说 明 书CN 104497106 A5/9 页7氏度厌氧培养箱 (5 CO2/94 N2/1 O2) 维持 。
20、60 分钟。随后，再用原来的维持培养基置换去氧无糖培养液，并在 37 摄氏度含 5 CO2/10 H2/85 O2的潮湿培养箱中维持培养 24 小时。至此，缺血性卒中的细胞模型建立完成，随即可对培养的神经元使用实施例 1 制备的小分子多肽进行处理 ( 图 2)。0049 (2) 实施例 1 制备的小分子多肽在缺血性卒中 OGD 细胞模型应用最佳浓度探索0050 为了明确实施例 1 制备的小分子多肽的最佳应用浓度，上述原代培养的神经元在 OGD 处理后，恢复到常规培养箱和培养基条件 2 小时，12 孔板每孔 800l 的培养基给予2l,10l, 和 20l 37 度预热的 lmg/ml 浓度实施。
21、例 1 制备的小分子多肽 进行孵育，观察其抑制 DAPK1 与 CTX 相互作用的效果。通过提取不同浓度实施例 1 制备的小分子多肽孵育的细胞蛋白，进行免疫共沉淀实验，用抗 DAPK1 的抗体去沉淀细胞蛋白，再用抗 CTX 的抗体对沉淀在 NC 膜上的蛋白进行免疫印迹染色，黑色条带显示 DAPK1 所沉淀的 CTX 蛋白，提示 DAPK1 与 CTX 的相互作用。当给予 5M 实施例 1 制备的小分子多肽时，NC 膜上的黑色条带消失，说明该浓度完全抑制 DAPK1 与 CTX 的相互作用，也说明 5M 实施例 1 制备的小分子多肽是最佳的治疗给药浓度 ( 图 3)。0051 (3) 实施例 1。
22、 制备的小分子多肽在缺血性卒中 OGD 细胞模型中的应用0052 原代培养的神经元在OGD处理后，恢复到常规培养箱和培养基条件下培养1小时，12 孔板每孔 800l 的培养基给予 37 度预热的 10l 5M 的实施例 1 制备的小分子多肽或实施例 1 制备的对照用小分子多肽生理盐水溶液孵育，继续在 37 摄氏度含 5 CO2/10H2/85 O2的潮湿培养箱中继续维持培养 23 小时后进行 PI 染色观察坏死的细胞数量。同时，神经元培养第 10 天给予 Lenti-virus 标记神经元突起状况，OGD 后进行实施例 1 制备的小分子多肽或对照实施例 1 制备的对照用小分子多肽治疗，24 小。
23、时后共聚焦显微镜下计数树突棘的数量，同时电生理记录 AMPA 受体介导的 mEPSC 幅度和频率。0053 (4) 实施例 1 制备的小分子多肽应用效果评估0054 PI 染色检测神经元死亡 ：碘化丙啶 (propidine iodide,PI) 是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但在坏死的细胞，PI 能够透过细胞膜而使细胞核红染。因此 PI 染色可大致反映细胞的坏死程度。具体步骤为 ：先用 PBS 稀释 PI 粉末 (sigma) 于 1mg/ml，12 孔板每孔 10ul(10l/800l)。在 37 摄氏度条件下孵育 30 分钟，随后 4多聚甲醛固定，用 PBS 润洗两次后，加入细。
24、胞核染液 DAPI 1l 孵育 10 分钟后，直接在荧光显微镜下以535nm 的激发光照射下观察拍照，红色标记细胞为阳性坏死细胞。接下来，我们对体外培养14 天的原代神经细胞进行 OGD 处理 60 分钟和 90 分钟，在 60 分钟 OGD 处理的情况下，PI 标记出 46细胞坏死。当培养物经过 90 分钟 OGD 处理后，PI 标记出 89细胞，可见大部分细胞在 OGD 处理下死亡。用 5M 的实施例 1 制备的小分子多肽对培养的原代神经元进行孵育处理，OGD 处理 90 分钟后的原代培养神经元，被 PI 标记的细胞数目显著减少，其细胞坏死率为 12，说明实施例 1 制备的小分子多肽处理可。
25、以在细胞水平降低缺血后神经元死亡，表明实施例1制备的小分子多肽具有治疗缺血性卒中的作用，而实施例1制备的对照用小分子多肽孵育的神经元的坏死率基本不变 ( 图 4A)。0055 树突棘数目鉴定突触形态 ：带EGFP慢病毒感染神经元后3天在488激发光照下即可观察到大部分神经元均可被染成绿色，而且 EGFP 在神经元胞体、突起等均匀分布，成熟说 明 书CN 104497106 A6/9 页8的神经元的树突棘借 EGFP 可被清晰的显示。OGD 处理后的神经元树突棘数目明显下调，为142 个 /um，而用 5M 的实施例 1 制备的小分子多肽孵育处理后的神经元树突棘数目虽然没有未经 OGD 处理的神。
26、经元树突棘数目多 (313 个 /um), 但和 OGD 处理的相比明显上升，为253个/um，比实施例1制备的对照用小分子多肽也明显上调，以上结果说明实施例1 制备的小分子多肽保护突触形态，减轻了缺血缺氧时的突触损伤 ( 图 4B)。0056 电生理记录突触功能 ：AMPA 受体介导的 mEPSC 幅度和频率可以反映突触的基本功能。在电压钳模式下，利用 Axopatch 200B 放大器 (Axon Instronments,Inc,USA) 对经OGD 处理 48h 后的神经元进行全细胞记录，采样频率 10kHz，低通滤波频率为 2kHz。数据的采集和分析均使用 Clampfit 10.0。
27、 软件 (Axon Instronments,Inc,USA)，全细胞记录电极(3-5M)，在孵育液中加入 50uM 的 D-APV，10uM 的荷包牡丹碱和 1uM 的河豚毒素，可以检测到 AMPA 受体依赖的 mEPSCs, 所有的记录都是在室温下将电压钳制在 -70mV. 通过模板将阈值设置在 -6pA( 噪音的 2.5SD) 来筛选 mEPSCs 为了数据的准确性 , 每一个记录到的mEPSCs 都通过这个值进行校准。经 OGD 处理 48h 后进行记录，孵育实施例 1 制备的小分子多肽的神经元的mEPSC幅度和频率较孵育实施例1制备的对照用小分子多肽和生理盐水的明显上调 ( 图 4C。
28、D)。0057 实施例 3 实施例 1 中制备的小分子多肽在缺血性卒中小鼠模型中的应用0058 (1) 缺血性卒中小鼠模型的建立0059 运用大脑中动脉栓塞MCAO小鼠模型模拟缺血性脑卒中，具体方法为：麻醉小鼠，仰面固定于加热毯 (Harvard Apparatus,Holliston,MA,USA)，维持动物体温于370.5。颈部做1-2cm长正中切口，分离右侧颈总动脉，暴露颈外与颈内动脉分叉，从颈外动脉向颈内插入直径约 0.1mm 尖端包被 0.2mm 直径硅胶的尼龙线栓 (Doccol Co.,Redlands,CA,USA)，插入深度约 0.8-1.0cm，至大脑中动脉前段起始部。1 。
29、小时后，小心移除线栓，恢复颈总动脉灌注，缝合伤口，整个手术过程中，施行无菌操作。假手术组动物(Sham)除了不插入线栓外，其余步骤均与MCAO模型动物相同。在施行MCAO术后，建立股静脉通道，以便后续注射实施例 1 中制备的小分子多肽，避免对小鼠进行反复麻醉，影响小鼠状态。0060 (2) 实施例 1 中制备的小分子多肽静脉注射及最佳浓度探索0061 在小鼠脑缺血再灌注后3小时，经股静脉缓慢单次注射0.5，1，2，或5mg/kg实施例1中制备的小分子多肽，多肽浓度为1mg/ml,用无菌生理盐水溶解。实施例1中制备的小分子多肽静脉注射后，在缺血再灌注 24 小时后的小鼠脑组织蛋白匀浆，用 DAP。
30、K1 的抗体沉淀组织蛋白，再用 CTX 的抗体去检测沉淀下来的蛋白，检测到 NC 膜上黑色印迹表明 DAPK1KD与 CTX 相互作用。结果显示，静脉注射给予实施例 1 中制备的小分子多肽 2mg/kg 以上的剂量，抗 CTX 的抗体无法检测到 NC 膜上的 CTX 蛋白 ( 图 5A)，提示 DAPK1KD 与 CTX 的相互作用被实施例 1 中制备的小分子多肽所阻断。为了评估治疗时间窗，我们选取三个时间点 ( 缺血再灌注后 3，69 小时 ) 静脉注射 2mg/kg 实施例 1 中制备的小分子多肽或实施例 1 中制备的对照用小分子多肽或生理盐水。24 小时后取材匀浆，用 DAPK1 的抗体。
31、去沉淀蛋白，用CTX 抗体进行检测，结果显示，再灌注 3 和 6 小时应用实施例 1 中制备的小分子多肽，抗 CTX的抗体无法检测到 NC 膜上的 CTX 蛋白，提示 DAPK1KD 与 CTX 的相互作用被实施例 1 中制备的小分子多肽所阻断 ( 图 5B)。这些结果显示 2mg/kg(408M)( 静脉注射 ) 是有效的合适说 明 书CN 104497106 A7/9 页9的剂量，再灌注 6 小时以内均是合适的治疗时间窗。0062 由此最优浓度及实施例 2 中实验的到的最优浓度，可知当实施例 1 中制备的额小分子多肽浓度在 50M 至 500M 之间时，具有明显的防治卒中效果。0063 (。
32、3) 实施例 1 中制备的小分子多肽在缺血性卒中小鼠模型的应用0064 在小鼠 MCAO 脑缺血再灌注后 3 小时，用注射器经股静脉缓慢单次注射 2mg/kg 实施例 1 中制备的小分子多肽或对照实施例 1 中制备的对照用小分子多肽或无菌生理盐水(Vehicle)。多肽浓度为 1mg/ml, 用无菌生理盐水溶解。实施例 1 中制备的小分子多肽静脉注射后，在缺血再灌注 3 天后的小鼠脑组织切片进行 TTC 染色观察梗死病灶，再灌注第 7天，FJ 染色观察细胞死亡情况，冰冻切片进行 TUNEL 染色，观察凋亡情况，同时进行神经系统症状评分 (N.S.)，评估实施例 1 中制备的小分子多肽的治疗效果。
33、，第 28 天旷场检测小鼠在一定时间内的运动距离 ；缺血再灌注小鼠 28 天内指定时间点连续观测转棒行为，进一步明确实施例 1 中制备的小分子多肽对缺血性卒中的治疗作用 ( 图 6)。0065 (3) 实施例 1 中制备的小分子多肽治疗效果评估0066 TTC 染色检测缺血梗死体积 ：TTC(2，3，5氯化三苯基四氮唑 ) 是脂溶性光敏感复合物，1894 年首次合成用来检测种子的生存能力，1958 年开始用来染色检测哺乳动物组织的缺血梗塞。它是呼吸链中吡啶核苷结构酶系统的质子受体，与正常组织中的脱氢酶反应而呈红色，而缺血组织内脱氢酶活性下降，不能反应，故不会产生变化呈苍白。具体操作步骤如下 ：。
34、MCAO 模型动物于缺血再灌注 3 天后麻醉处死，迅速取出完整脑组织，-20 摄氏度速冻 20 分钟，新鲜配置 1 TTC-PBS 溶液，避光于 37 摄氏度保存备用。-20 摄氏度取出脑组织后，迅速从前向后作连续冠状切片，切片厚度约 1 毫米。然后将切片置于 1 TTC-PBS溶液中，37 摄氏度避光孵育，15 分钟后，将切片翻转，再孵育 15 分钟。染色结果可见，正常脑组织区域为红色，而缺血区不被着色。染色后，切片置于 4多聚甲醛 PBS 溶液中固定，最后对固定的脑切片缺血面积进行统计分析。选取前囟点前后各 0.3 厘米区域的连续 6 张切片，运用图像分析软件 (Image J 1.37v。
35、,Wayne Rasband,available through National Institutes of Health) 计算分析缺血体积 (Infarction,mm3)。0067 Fluoro-Jade C(FJ-C) 染色 ：FJ-C 染液是一种带荧光的物质，可以与变性的神经元结合，在显微镜 488nm 激发光激发下发出绿色荧光，而正常神经元不会与 FJ-C 染液结合，所以不发荧光。缺血再灌注第 3 天，麻醉小鼠后经心脏主动脉灌流，分别用 0.9生理盐水和冰冷的 4多聚甲醛 PBS 溶液灌流固定脑组织。取出脑组织后，在相同多聚甲醛液中后固定 6-8 小时后，置于 30蔗糖溶液，脑组。
36、织沉底后进行冰冻切片，片厚 30m，切片保存于PBS溶液中，进行随后的FJ-C染色。FJ-C染色：切片贴于明胶载玻片后晾干，先置于100乙醇1分钟，70乙醇1分钟以及双蒸水中1分钟，随后在含0.01Fluoro-Jade(Millipore) 和 0.1醋酸 (1:10) 的混合液中避光室温下孵育 30 分钟。随后用水进行润洗，二甲苯快速透明后用 DPX 封片剂 (Sigma) 封片，显微镜用 488nm 激发光观察绿色标记的阳性细胞，即为变性死亡的细胞。0068 TUNEL染色：细胞在发生凋亡时，会激活内源性核酸内切酶，这些内切酶会切断核小体间的基因组DNA，暴露的3-OH可以在末端脱氧核苷。
37、酸转移酶(Terminal Deoxynucleotidyl Transferase,TdT) 和 DNA 多聚酶的催化下加上荧光素 (TRITC) 标记的 dUTP(fluorescein-dUTP)，从而可以通过荧光显微镜进行检测，使凋亡细胞被特异性地说 明 书CN 104497106 A8/9 页10标记和显示出来。缺血再灌注第 7 天，麻醉小鼠后经心脏主动脉灌流，灌流、后固定、脱水、切片的方法同上述 FJ-C 染色所述。切好的脑片进行随后 TUNEL 染色。具体操作方法如下 ：冰冻切片贴于明胶载玻片后晾干，先用 PBS 润洗，随后用含 0.1 Trition-X-100 的 0.1的柠。
38、檬酸钠溶液在冰上孵育细胞 2 分钟，新鲜配制 TUNEL 反应液 ( 酶溶液 / 标记溶液，1:9混合 ) 后，按每张脑切片加入 50l 反应液在 37 摄氏度条件下避光孵育 1 小时，最后直接在荧光显微镜下以 532nm 激发光照射下观察拍照。红色标记细胞核为阳性凋亡细胞。0069 分别运用修改后的 7 分制行为障碍评分和转棒仪实验以及旷场对 MCAO 模型小鼠运动功能进行检测。具体为 ：修改后的 7 分制行为障碍评分 ：0 分，无神经功能缺失症状 ；1 分，躯干向缺血侧弯曲 ；2 分，爬行时倾斜，但休息时正常 ；3 分，行走时身体向对侧倾倒 ；4分，向缺血侧转圈，5 分，休息时向缺血侧倾斜。
39、 ；6 分，径向打滚 ；7 分，不能自行行走，意识丧失或死亡。得分越高表明动物行为障碍越严重，小鼠 MCAO 术后第 7 天进行行为障碍评分。转棒仪试验 ：MCAO 手术前 ( 第 0 天 ), 手术后第 7 天 ,14 天，21 天和 28 天运用小鼠转棒仪(Ugo Basile,Italy)测试手术前后动物的运动功能。转棒仪工作模式如下 ：小鼠放置在一个加速的转速仪上，五分钟内，转速从2rpm/分逐渐加速到20rpm/分，从放置动物到动物落下的时间被记录下来作为滞留时间，反映动物的四肢肌力及运动协调能力，若五分钟内，小鼠都没有落下，则记为 5 分钟。实验前，动物训练两天，每天训练 3 次，。
40、记录并计算平均滞留时间以获得稳定的基础值。转棒仪正式实验每天进行 3 次，间隔检测 28 天。滞留时间 RT值越低，表明动物运动功能越差。旷场，旷场也被用来检测小鼠 MCAO 后的运动能力，MCAO前 3 天，小鼠放置在检测盒 (30x30x40cm3) 中 10 分钟，连续 3 天。3 天适应过后进行 MCAO手术，术后第 25 天 , 再次适应环境 3 天，第 28 天检测 5 分钟内小鼠运动的距离，以评估其运动功能。0070 对动物缺血再灌注后 3 小时的小鼠股静脉注射 1mg/ml 实施例 1 中制备的小分子多肽溶液 (2mg/kg 体重 )，动物缺血再灌注第 3 天处死，取出脑组织，。
41、TTC 染色显示小鼠脑缺血梗死体积 (infarction,mm3)，给予实施例 1 中制备的小分子多肽后脑缺血梗死体积为21.72.97mm3，显著低于对照组实施例1中制备的对照用小分子多肽的40.32.1mm3或生理盐水 Vehicle 组的 42.33.8mm3( 图 7A)。FJ-C 与 TUNEL 染色显示，给予实施例 1 中制备的小分子多肽的小鼠神经细胞坏死与凋亡数量分别为 ：29.142.3 和 12.141.1 个每 40倍视野，显著低于对照组实施例 1 中制备的对照用小分子多肽的 51.719.3 和 25.576个或生理盐水 vehicle 组 56.286.1 和 30.。
42、573.3 个 ( 图 7B)。此外，缺血后第 7 天的神经功能评分(N.S)的结果显示，实施例1中制备的小分子多肽注射小鼠的评分为2.50.4，但显著低于实施例 1 中制备的对照用小分子多肽注射组小鼠的 5.00.5 与 Vehicle 注射组小鼠的5.40.7(图8A)，证明实施例1中制备的小分子多肽具有显著的改善神经系统症状的效果。缺血后第 28 天的旷场行为学检测结果表明，实施例 1 中制备的小分子多肽注射小鼠 5 分钟内运动速度较实施例 1 中制备的对照用小分子多肽或 Vehicle 组显著增快 ( 图8B) ；小鼠转棒行为学结果显示，缺血后第 7 天，实施例 1 中制备的小分子多肽注射的小鼠停留在转轮上的时间 (Stay on rotarod) 为 134.6713 秒，虽然低于 Sham 组 229.3315秒，但较实施例 1 中制备的对照用小分子多肽注射小鼠的 68.677 秒与 Vehicle 注射小鼠的 62.610 秒显著延长，且一直持续到第 28 天 ( 图 8C)。上述组织学与行为学的实验研究统计结果一致表明，在缺血性卒中动物模型，小分子多肽实施例 1 中制备的小分子多肽静说 明 书CN 104497106 A。