《一种灰树花多糖的提纯方法.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《一种灰树花多糖的提纯方法.pdf（6页珍藏版）》请在专利查询网上搜索。
1、(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201510003250.5(22)申请日 2015.01.04C08B 37/00(2006.01)(71)申请人 华东理工大学地址 200237 上海市徐汇区梅陇路 130 号(72)发明人 韩伟 满宁 罗文锋 韩乐 马迪豆欣欣 汪佳丹(74)专利代理机构 上海新天专利代理有限公司 31213代理人 胡红芳(54) 发明名称一种灰树花多糖的提纯方法(57) 摘要本发明涉及一种灰树花多糖的提纯方法，将灰树花粉碎，去离子水作为溶剂，微波提取 ；采用HD-8 阳离子交换树脂脱蛋白纯化，多糖提取液稀释或浓缩上样，控制一定流速，收集流出液，即得。
2、纯度较高的生物活性物质灰树花多糖提纯液。本方法工艺流程短，操作简便，效率高，能耗少，避免了大量有机试剂的消耗，分离纯化过程可连续化，且树脂可回收再利用，安全环保，制备工艺流程成本低，有利于降低产品价格，很适合大规模工业化生产。(51)Int.Cl.(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请权利要求书1页 说明书4页(10)申请公布号 CN 104497161 A(43)申请公布日 2015.04.08CN 104497161 A1/1 页21.一种灰树花多糖的提纯方法，其特征在于，包括如下步骤 ：(1)将灰树花粉碎，选用粒径为20目的灰树花，在pH为6的去离子水中进行微波提取，得。
3、到灰树花多糖提取液 ；(2) 将树脂用去离子水反复浸洗，然后用 NaOH 溶液浸泡 18 24h，再用盐酸溶液浸泡18 24h，最后用去离子水浸洗，待用 ；(3) 将步骤 (2) 处理过的树脂进行湿法装柱，形成树脂床层后，静置过夜备用 ；使用前用去离子水过柱，将树脂柱活化 ；(4)将步骤(1)得到的灰树花多糖提取液取适量装入步骤(3)的活化树脂柱，收集流出液，即为脱蛋白纯化后灰树花多糖提纯液。2.根据权利要求1所述的提纯方法，其特征在于，步骤(1)中微波提取的装置的输出功率为 500 650W，频率为 2450MHz，辐射过程中鼓泡搅拌 ；液固比为 20 40mL/1g，提取时间为 60 27。
4、0s。3.根据权利要求1所述的提纯方法，其特征在于，步骤(2)所述树脂是氨基酸分离专用树脂 HD-8 阳离子交换树脂。4.根据权利要求1或3所述的提纯方法，其特征在于，步骤(2)中将树脂用去离子水反复浸洗的方法如下 ：浸洗时每隔 5 10 分钟换一次水，并不时搅动，换水 4 5 次后，再每隔 15 20 分钟换水一次，浸洗至浸洗水不褐色为止。5.根据权利要求 1 所述的提纯方法，其特征在于，步骤 (2) 中所述 NaOH 溶液的浓度是0.5 1mol/L，其溶液体积是树脂体积的 3 5 倍，浸泡树脂的前两个小时内不断搅动，用水冲洗，直至浸泡水 pH 值为 6 7。6.根据权利要求 1 所述的提。
5、纯方法，其特征在于，步骤 (2) 中所述盐酸溶液的浓度是0.5 1mol/L，其溶液体积是树脂体积的 3 5 倍，将树脂转成 H+ 型，盐酸浸泡后，用去离子水浸洗，至 pH 值为 6 以上时，即可进行装柱。7.根据权利要求 3 所述的提纯方法，其特征在于，称取 20g 预处理过的 HD-8 阳离子交换树脂湿法上柱，将去离子水注入层析柱内，赶走空气 ；再将经过步骤(2)处理的HD-8阳离子交换树脂加入去离子水混合至适宜稠度，灌注入层析柱内，使其自由沉降 ；沉降结束形成树脂床层后，静置过夜备用。8.根据权利要求 1 所述的提纯方法，其特征在于，步骤 (4) 中将 80 100mL 去离子水以 0.。
6、5 2.5mL/min 的流速流过树脂柱，重复操作 3 遍，即可上样。9.根据权利要求1所述的提纯方法，其特征在于，步骤(4)中所述灰树花多糖提取液中蛋白质的浓度为 0.15 0.5mg/mL。权 利 要 求 书CN 104497161 A1/4 页3一种灰树花多糖的提纯方法技术领域0001 本发明涉及一种从食用菌中提纯生物活性物质的方法，特别涉及一种利用微波提取HD-8 阳离子交换树脂纯化集成工艺提纯灰树花多糖的方法。背景技术0002 灰树花又名栗子蘑、莲花菌、千佛菌等，是一种珍贵的药食兼用真菌，口味鲜美，富含多种生物活性物质、矿物质与维生素等。其主要生物活性物质灰树花多糖是近年来研究的热点。
7、。0003 众多药理与临床试验证实，灰树花多糖具有抗肿瘤，降血压，调节血糖、血脂水平，抗 HIV 病毒，增强免疫系统功能的作用，尤其是抗肿瘤活性，日本医学专家实验发现灰树花多糖肿瘤抑制率可达 86.2，比国际公认的抗癌新药香菇多糖抑制率高 32。对癌细胞生成和转移防治、高血压、糖尿病、艾滋病及免疫系统功能紊乱均有一定的疗效，且无毒副作用。因此，灰树花多糖的制备工艺备受关注，具有良好的开发前景。0004 目前，国内外灰树花多糖提取物产品还很少见，文献中更多是用水提醇沉工艺法提取和脱蛋白及色素等杂质，或者是用传统的提取方法如热水提取法、酸提法、碱提法等联合一般的脱蛋白纯化方法如醇沉法、Sevage。
8、 法，三氯乙酸法等提纯多糖，存在操作时间长、有机试剂用量大、效率低、效果差等缺点，多糖的得率和纯度都受到很大的限制，不利于工业化生产制备多糖产品。0005 因此，研究灰树花多糖提纯方法，开发操作便捷，高效，低成本的灰树花多糖的制备工艺，对于降低产品价格，增加产品附加值具有重大的经济效益，并满足市场需求，为社会增益。发明内容0006 本发明的目的是提供一种操作便捷、成本低即经济高效的提纯药食两用真菌灰树花多糖的方法，以满足工业化生产需要。该发明提纯工艺亦可应用于其他食用菌。具体技术方案如下 ：0007 一种灰树花多糖的提纯方法，其特征在于，包括如下步骤 ：0008 (1) 将灰树花粉碎，选用粒径。
9、为 20 目的灰树花，在 pH 为 6 的去离子水中进行微波提取，得到灰树花多糖提取液 ；0009 (2) 将树脂用去离子水反复浸洗，然后用 NaOH 溶液浸泡 18 24h，再用盐酸溶液浸泡 18 24h，最后用去离子水浸洗，待用 ；0010 (3) 将步骤 (2) 处理过的树脂进行湿法装柱，形成树脂床层后，静置过夜备用 ；使用前用去离子水过柱，将树脂柱活化 ；0011 (4)将步骤(1)得到的灰树花多糖提取液取适量装入步骤(3)的活化树脂柱，收集流出液，即为脱蛋白纯化后灰树花多糖提纯液。0012 步骤 (1) 中微波提取的装置的输出功率为 500 650W，频率为 2450MHz，辐射过程。
10、说 明 书CN 104497161 A2/4 页4中鼓泡搅拌 ；液固比为 20 40mL/1g，提取时间为 60s 270s。0013 微波提取一段时间，提取液冷却至室温后，需要进行称重补水，再抽滤。0014 预处理的树脂是氨基酸分离专用树脂 HD-8 阳离子交换树脂。0015 步骤(2)中将树脂用去离子水反复浸洗的方法如下 ：浸洗时每隔510分钟换一次水，并不时搅动，换水 4 5 次后，再每隔 15 20 分钟换水一次，浸洗至浸洗水不褐色为止。0016 步骤(2)中所述NaOH溶液的浓度是0.51mol/L，其溶液体积是树脂体积的35 倍，浸泡树脂的前两个小时内不断搅动，用水冲洗，直至浸泡水。
11、 pH 值为 6 7。0017 步骤 (2) 中所述盐酸溶液的浓度是 0.5 1mol/L，其溶液体积是树脂体积的 3 5 倍，将树脂转成 H+型，盐酸浸泡后，用去离子水浸洗，至 pH 值为 6 以上时，即可进行装柱。0018 称取 20g 预处理过的 HD-8 阳离子交换树脂湿法上柱，将去离子水注入层析柱内(1.550cm)，赶走空气 ；再将经过步骤(2)处理的HD-8阳离子交换树脂加入去离子水混合至适宜稠度，灌注入层析柱内，使其自由沉降 ；沉降结束形成树脂床层后，静置过夜备用。0019 步骤 (4) 中将 80 100mL 去离子水以 0.5 2.5mL/min 的流速流过树脂柱，重复操作。
12、 3 遍，即可上样。0020 步骤 (4) 中所述灰树花多糖提取液中蛋白质的浓度为 0.15 0.5mg/mL。0021 所述的灰树花多糖溶液的上样量为200500mL，上样浓度：蛋白质浓度为0.15 05mg/mL，采用苯酚硫酸法检测多糖浓度，用考马斯亮蓝 G-250 染色法测定蛋白含量。0022 本发明的方法，与其他工艺相比，具有如下优点 ：0023 (1) 避免使用有机溶剂，液固比 30mL/g，微波提取，提取率高达 22.75，与酶法提取率相当，但微波提取更节省时间 ( 只有 210s)，不使用酶制剂，减少杂质的带入，比传统热水浸提法的得率提高了 50多，具有省时高效，减少耗能，提升产。
13、率等优点。0024 (2)HD-8 阳离子交换树脂为氨基酸分离专用树脂，纯化效果与常规的 Sevage 法(脱蛋白率为37.95，多糖含量为78.32)相比，灰树花多糖的保留率和脱蛋白率均高达90以上，纯度近 60，且可回收再利用，安全环保，并适用于连续化操作，处理量大。0025 (3) 微波提取HD-8 阳离子交换树脂纯化集成工艺对提纯灰树花多糖具有操作便捷，高效，成本低，产品质量好等优势，工艺简短有利于工业化生产，并且该工艺可应用于其他食用菌多糖的提纯与制备，具有较高的实用价值，开发意义大。具体实施方式0026 实施例 10027 从灰树花中提取纯化多糖 ：0028 (1) 将干燥的灰树花。
14、粉碎过筛，精确称取粒径为 20 目的药材 3g，置于 250mL 三口烧瓶中，加入 90mL 的去离子水，称重，微波提取 210s，冷却至室温，再称重补水，抽滤，即得到灰树花多糖提取液。0029 (2)称取200g HD-8树脂，用去离子水反复浸洗5次，期间不时搅动每隔15分钟换一次水，再隔 30 分钟换一次水，浸洗 2 次。然后用 400mL，1mol/L NaOH 浸泡 24h，用去离子水浸洗 7 遍，再用 400mL，1mol/L 的盐酸浸泡 24h，用去离子水浸洗 8 次。说 明 书CN 104497161 A3/4 页50030 (3) 称取 20g 经过预处理的树脂进行湿法装柱，将。
15、大约 40mL 去离子水注入层析柱内 (1.550cm)，赶走空气 ；再将经过预处理的 HD-8 阳离子交换树脂加入少量去离子水混合至适宜稠度，灌注入层析柱内，使其自由沉降 ；沉降结束形成树脂床层后，静止过夜备用。0031 (4) 将 80mL 去离子水以 1mL/min 的流速流过树脂柱，操作 3 遍。0032 (5)将400mL，蛋白质含量为0.33mg/mL微波提取的灰树花子实体多糖溶液以1mL/min 流速通过 HD-8 阳离子交换树脂柱，收集流出液，测定流出液中多糖和蛋白质含量。0033 灰树花多糖微波提取得率为 22.61，HD-8 阳离子交换树脂纯化后，多糖保留率为 95.94，。
16、脱蛋白率为 92.02，纯度为 58.7，并通过抗氧化活性测试，所得灰树花多糖液抗氧化生物活性功能良好。0034 实施例 20035 从灰树花中提取纯化多糖 ：0036 (1) 将干燥的灰树花粉碎过筛，精确称取粒径为 20 目的药材 3g，置于 250mL 三口烧瓶中，加入 90mL 的去离子水，称重，微波提取 180s，冷却至室温，再称重补水，抽滤，即得到灰树花多糖提取液。0037 (2)称取200g HD-8树脂，用去离子水反复浸洗5次，期间不时搅动每隔15分钟换一次水，再隔 30 分钟换一次水，浸洗 2 次。然后用 400mL，1mol/L NaOH 浸泡 24h，用去离子水浸洗 7 遍。
17、，再用 400mL，1mol/L 的盐酸浸泡 24h，用去离子水浸洗 8 次。0038 (3) 称取 20g 经过预处理的树脂进行湿法装柱，将大约 40mL 去离子水注入层析柱内 (1.550cm)，赶走空气 ；再将经过预处理的 HD-8 阳离子交换树脂加入少量去离子水混合至适宜稠度，灌注入层析柱内，使其自由沉降 ；沉降结束形成树脂床层后，静止过夜备用。0039 (4) 将 80mL 去离子水以 1mL/min 的流速流过树脂柱，操作 3 遍。0040 (5) 将 400mL，蛋白质含量为 0.309mg/mL 微波提取的灰树花子实体多糖溶液以1mL/min 流速通过 HD-8 阳离子交换树脂。
18、柱，收集流出液，测定流出液中多糖和蛋白质含量。0041 灰树花多糖微波提取得率为 21.95，HD-8 阳离子交换树脂纯化后，多糖保留率为 93.94，脱蛋白率为 94.08，纯度为 56.01，并通过抗氧化活性测试，所得灰树花多糖液抗氧化生物活性功能良好。0042 实施例 30043 从灰树花中提取纯化多糖 ：0044 (1) 将干燥的灰树花粉碎过筛，精确称取粒径为 20 目的药材 3g，置于 250mL 三口烧瓶中，加入 90mL 的去离子水，称重，微波提取 210s，冷却至室温，再称重补水，抽滤，即得到灰树花多糖提取液。0045 (2)称取200g HD-8树脂，用去离子水反复浸洗5次，。
19、期间不时搅动每隔15分钟换一次水，再隔 30 分钟换一次水，浸洗 2 次。然后用 400mL，1mol/L NaOH 浸泡 24h，用去离子水浸洗 7 遍，再用 400mL，1mol/L 的盐酸浸泡 24h，用去离子水浸洗 8 次。0046 (3) 称取 20g 经过预处理的树脂进行湿法装柱，将大约 40mL 去离子水注入层析柱内 (1.550cm)，赶走空气 ；再将经过预处理的 HD-8 阳离子交换树脂加入少量去离子水混合至适宜稠度，灌注入层析柱内，使其自由沉降 ；沉降结束形成树脂床层后，静止过夜备用。0047 (4) 将 80mL 去离子水以 1mL/min 的流速流过树脂柱，操作 3 遍。
20、。0048 (5) 将 300mL，蛋白质含量为 0.248mg/mL 微波提取的灰树花子实体多糖溶液以说 明 书CN 104497161 A4/4 页61mL/min 流速通过 HD-8 阳离子交换树脂柱，收集流出液，测定流出液中多糖和蛋白质含量。0049 灰树花多糖微波提取得率为 22.57，HD-8 阳离子交换树脂纯化后，多糖保留率为 90.08，脱蛋白率为 95.56，纯度为 54.13，并通过抗氧化活性测试，所得灰树花多糖液抗氧化生物活性功能良好。0050 实施例 40051 从灰树花中提取纯化多糖 ：0052 (1) 将干燥的灰树花粉碎过筛，精确称取粒径为 20 目的药材 3g，置。
21、于 250mL 三口烧瓶中，加入 90mL 的去离子水，称重，微波提取 210s，冷却至室温，再称重补水，抽滤，即得到灰树花多糖提取液。0053 (2)称取200g HD-8树脂，用去离子水反复浸洗5次，期间不时搅动每隔15分钟换一次水，再隔 30 分钟换一次水，浸洗 2 次。然后用 400mL，1mol/L NaOH 浸泡 24h，用去离子水浸洗 7 遍，再用 400mL，1mol/L 的盐酸浸泡 24h，用去离子水浸洗 8 次。0054 (3) 称取 20g 经过预处理的树脂进行湿法装柱，将大约 40mL 去离子水注入层析柱内 (1.550cm)，赶走空气 ；再将经过预处理的 HD-8 阳。
22、离子交换树脂加入少量去离子水混合至适宜稠度，灌注入层析柱内，使其自由沉降 ；沉降结束形成树脂床层后，静止过夜备用。0055 (4) 将 80mL 去离子水以 1mL/min 的流速流过树脂柱，操作 3 遍。0056 (5) 将 500mL，蛋白质含量为 0.149mg/mL 微波提取的灰树花子实体多糖溶液以1mL/min 流速通过 HD-8 阳离子交换树脂柱，收集流出液，测定流出液中多糖和蛋白质含量。0057 灰树花多糖微波提取得率为 22.68，HD-8 阳离子交换树脂纯化后，多糖保留率为 94.03，脱蛋白率为 94.56，纯度为 55.02，并通过抗氧化活性测试，所得灰树花多糖液抗氧化生物活性功能良好。说 明 书CN 104497161 A。