一种高效水解鞘脂制备溶血鞘脂的方法.pdf

摘要
申请专利号：	CN201410508221.X	申请日：	2014.09.28
公开号：	CN104293843A	公开日：	2015.01.21
当前法律状态：	实审	有效性：	审中
法律详情：	实质审查的生效IPC(主分类):C12P 13/00申请日:20140928\|\|\|公开
IPC分类号：	C12P13/00; C12N9/80; C12N15/70	主分类号：	C12P13/00
申请人：	上海交通大学
发明人：	杨广宇; 冯雁; 黄锋涛; 韩云宾
地址：	200240 上海市闵行区东川路800号
优先权：
专利代理机构：	上海旭诚知识产权代理有限公司 31220	代理人：	郑立
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内容摘要

本发明公开了一种高效水解鞘脂制备溶血鞘脂的方法。首先，本发明对于鞘脂神经酰胺N-去酰基化酶SCDase G8进行了改造，去除了N末端信号肽并截短了C末端，得到了高活力的SCDase G8的突变体SCDase G8-del，并针对宿主细胞对编码基因进行了密码子优化；通过蛋白表达条件的优化，提高了SCDase G8-del的可溶性表达量。在此基础上建立了一种利用SCDase G8-del高效水解鞘脂制备溶血鞘脂的方法。该方法优化了高活力的SCDase G8-del的可溶性表达条件，优化了反应体系中金属离子浓度，优化了表面活性剂的种类和浓度，提高了溶血鞘脂产率，并且优化后的反应体系对高浓度的鞘脂和不同种类的鞘脂都有较好的水解作用。

权利要求书

1.  一种高效水解鞘脂制备溶血鞘脂的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
1)构建SCDase G8截短突变体SCDase G8-del的表达载体；
2)高效表达重组蛋白SCDase G8-del；
3)利用步骤2)中的重组蛋白SCDase G8-del水解鞘脂制备溶血鞘脂。
其中，所述的突变体SCDase G8-del是去除了N端的信号肽，截短了C端30kDa，且对其编码基因依据大肠杆菌中密码子使用频率进行了密码子优化的突变体，其基因序列如SEQ ID NO:1所示；蛋白的氨基酸序如SEQ ID NO:2所示。

2.  如权利要求1所述的高效水解鞘脂制备溶血鞘脂的方法，其特征在于，步骤1)中构建SCDase G8-del的表达载体的具体步骤包括：a.合成目的基因片段；b.PCR扩增目的基因片段；c.将目的基因片段插入表达载体质粒中。

3.  如权利要求2所述的高效水解鞘脂制备溶血鞘脂的方法，其特征在于，步骤b中PCR扩增所使用的引物为：
上游：5’—GTACTTCCATATGACCACGCAAGCCGTCGATT—3’
下游：5’—CCGCTCGAGATGGGCTTCCGCACGTT—3’。

4.  如权利要求1所述的高效水解鞘脂制备溶血鞘脂的方法，其特征在于，步骤2)中所述高效表达是利用IPTG诱导蛋白表达。

5.  如权利要求1所述的高效水解鞘脂制备溶血鞘脂的方法，其特征在于，步骤2)中所述高效表达是利用自动诱导培养基进行培养并在低温条件下诱导蛋白表达。

6.  一种高效水解鞘脂制备溶血鞘脂的方法，其特征在于，所述水解的反应体系包括：表面活性剂、缓冲液、底物鞘脂、SCDase酶和金属离子。

7.  如权利要求6所述的高效水解鞘脂制备溶血鞘脂的方法，其特征在于，所述金属离子为Ca²⁺、Mn²⁺、Co²⁺或Mg²⁺。

8.  如权利要求6所述的高效水解鞘脂制备溶血鞘脂的方法，其特征在于，所述反应体系中的表面活性剂为Triton X-100、牛磺脱氧胆酸钠(TDC)、胆酸钠或吐温80。

9.  如权利要求6-8任一项所述的水解鞘糖脂制备溶血鞘糖脂的方法，其特征在于，所述底物鞘脂为鞘糖脂、鞘磷脂或神经酰胺。

10.  如权利要求6-8任一项所述的水解鞘糖脂制备溶血鞘糖脂的方法，其特征在于，所述SCDase酶为SCDase G8-del酶，其基因序列如SEQ ID NO:1所示；蛋白的氨基酸序如SEQ ID NO:2所示。

说明书

一种高效水解鞘脂制备溶血鞘脂的方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种制备溶血鞘脂的方法，尤其涉及一种利用鞘脂神经酰胺N-去酰基化酶高效水解鞘脂制备溶血鞘脂的方法。
背景技术
鞘脂(Sphingolipids)包括鞘糖脂(Glycosphingolipids)、鞘磷脂(Sphingomyelin)、神经酰胺(Ceramide)，具有着重要的生物学功能，在信号转导，细胞粘附/识别、胞吞、细胞凋亡与自噬、脑老化、神经退行性病变、神经保护等生理过程中起着重要作用(Merrill AH Jr,J Bio Chem,2002,277(29):25843-25846；Hannun YA,et al.,Nat Rev Mol Cell Biol,2008,9(2):139-150；Posse de Chaves E,et al.,FEBS Lett,2010,584(9):1748-1759；Regina Todeschini A,et al.,Biochim Biophys Acta,2008,1780(3):421-433；Lopez PH,et al.,Curr Opin Struct Biol,2009,19(5):549-557.)。溶血鞘脂是鞘脂N-去酰基化的产物，在正常组织中，溶血鞘脂的含量极低，但在一些溶酶体贮积症中会累积。一些溶血鞘脂可以作为一些溶酶体贮积症的生物标志分子，例如葡糖苷鞘氨醇(溶血葡糖苷神经酰胺)是1型戈谢病(type1 Gaucher disease)的分子标志物；溶血鞘糖脂Gb3是法布瑞氏症(Fabry disease)的分子标志物；溶血鞘糖脂GM2是Tay-Sachs病(Tay-Sachs disease)和Sandhoff病(Sandhoff disease)的分子标志物(Cox TM,et al.,J Pathol,2012,226(2):241-254；Dekker N,et al.,Blood,2011,118(16):e118-127；Kodama T,et al.,PLoS One,2011,6(12):e29074；Aerts JM,et al.,Proc Natl Acad Sci U S A,2008,105(8):2812-2817.)。另外，溶血鞘脂的一个非常重要的应用是可以用来制备各种不同的鞘脂类似物，这些鞘脂类似物可用于合成药物(例如鞘糖脂GM1类似物LIGA20)、研究鞘脂的生物学功能、以及应用于血清学诊断和酶活测定等方面(Manev H,et al.,J Pharmacol Ther,1990,252(1):419-427；Mocchetti I.Cell Mol Life Sci,2005,62(19-20):2283-2294；Panasiewicz M,et al.,Biochemistry,2003,42(21):6608-6619；Nakagawa T,et al.,J Lipid Res,2005,46(6):1103-1112；Nagatsuka T,et al.,ACS Appl Mater Interfaces,2013,5(10):4173-4180；Nakagawa T,J Biochem,1999,126(3):604-611.)。目前，有报道用化学方法水解鞘脂来制备溶血鞘脂(Taketomi T,et al.,J biochem,1996,120(3):573-579；Taketomi T,et al.,J biochem,1997,121(2):264-269；Valiente O,et al.,J Lipid Res,2001,42(8):1318-1324.)，但化学方法存在反应条件剧烈、容易生成副产物、产品分离纯化困难等缺陷，使得产量低并且有一定污染。
鞘脂神经酰胺N-去酰基化酶(SCDase)能够特异水解各种鞘脂，可以用来制备溶血鞘脂。目前报道过的SCDase主要有两种，分别来自假单胞菌TK4(SCDase TK4)和海藻希瓦氏菌G8的(SCDase G8)，这两个酶氨基酸序列没有同源性(Ito M,et al.,J Biol Chem,1995,270(41):24370-24374；Furusato M,et al.,J Bio Chem,2002,277(19):17300-17307.)。目前酶法制备溶血鞘脂用的酶主要是SCDase TK4，但该酶难以在大肠杆菌中可溶性表达，商品化生产SCDase TK4依赖于从原始菌的培养液中提取，导致该酶价格非常昂贵，用来制备溶血鞘脂的成本相当高。另外，由于该酶除水解鞘脂的活性之外还可以催化其逆反应合成鞘脂，使得溶血鞘脂产物的产率低。虽然有报道用含有机溶剂的两相体系优化该酶的水解条件，提高了溶血鞘脂的产量，但该方法复杂，并且不适用于溶血鞘脂的大量制备，难以满足实际需要(Kurita T.,et al.,J Lipid Res,2000,41(5):846-851.)。SCDase G8有报道该蛋白可以在大肠杆菌中可溶性表达，但该酶的可溶性表达量还是很低，使其应用受到较大限制(Furusato M,et al.,J Bio Chem,2002,277(19):17300-17307.)。
因此，本领域的技术人员致力于开发一种能够高效制备溶血鞘脂的方法，而此方法的关键就是实现高活力的SCDase在宿主细胞中高效表达，并提高该酶水解鞘脂制备溶血鞘脂的产率。
发明内容
有鉴于现有技术的上述缺陷，本发明所要解决的技术问题是寻找一种能够在宿主细胞中高效表达的鞘脂神经酰胺N-去酰基化酶(SCDase)，并利用该酶高效水解鞘脂制备溶血鞘脂。
根据前人研究，C末端截短30kDa的突变体SCDase G8活性显著高于长全的酶(Furusato M,et al.,J Bio Chem,2002,277(19):17300-17307.)，但对于其高效表达条件未见报道。本发明依照大肠杆菌密码子偏好性，对SCDase G8基因进行密码子优化，将去掉N端信号肽及C端截短的SCDase G8(SCDase G8-del)基因构建到载体中。将构建好的重组质粒转化到宿主细胞中，通过蛋白表达条件的优化，增强了目的蛋白SCDase G8-del的可溶性表达。
从而为实现高效制备溶血鞘脂的目的，本发明提供了一种高效水解鞘脂制备溶血鞘脂的方法，该方法包括以下步骤：
1)构建SCDase G8截短突变体SCDase G8-del的表达载体；
2)高效表达重组蛋白SCDase G8-del；
3)利用步骤2)中的重组蛋白SCDase G8-del水解鞘脂制备溶血鞘脂。
其中，所述的突变体SCDase G8-del是去除了N端的信号肽，截短了C端30kDa，且对其编码基因依据大肠杆菌中密码子使用频率进行了密码子优化的突变体，其基因序列如SEQ ID NO:1所示；蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
进一步地，步骤1)中构建SCDase G8-del的表达载体的具体步骤包括：a.合成目的基因片段；b.PCR扩增目的基因片段；c.将目的基因片段插入表达载体质粒中；其中优选地，PCR扩增所使用的引物为：
上游：5’—GTACTTCCATATGACCACGCAAGCCGTCGATT—3’(下划线标注的为Nde I酶切位点)
下游：5’—CCGCTCGAGATGGGCTTCCGCACGTT—3’(下划线标注的为Xho I酶切位点)；
优选的表达载体质粒为pET-23b(+)。
进一步地，步骤2)中所述的高效表达是指将构建好的重组质粒转化到宿主细胞中并通过一定的诱导条件诱导增强蛋白的表达，包括但不限于利用IPTG诱导表达或利用自动诱导培养基进行培养并在低温条件下诱导蛋白表达。
优选地，所述宿主细胞为大肠杆菌BL21(DE3)。
本发明还提供了一种高效水解鞘脂制备溶血鞘脂的反应体系，包括：表面活性剂、缓冲液、底物鞘脂、SCDase酶和金属离子。
优选地，上述反应体系中所述金属离子包括但不限于：Ca²⁺、Mn²⁺、Co²⁺、Mg²⁺，其中最优选为Ca²⁺。
优选地，反应体系中金属离子浓度为1-1000mM，其中最优选Ca²⁺的浓度为100mM。
优选地，上述反应体系中的表面活性剂包括但不限于Triton X-100、牛磺脱氧胆酸钠(TDC)、胆酸钠或吐温80，其中最优选为牛磺脱氧胆酸钠(TDC)。
优选地，上述反应体系中表面活性剂的浓度为0.01-2％(v/v或w/v)。
优选地，上述体系中的底物鞘脂为鞘糖脂、鞘磷脂或神经酰胺。
优选地，上述反应体系中的底物鞘脂浓度为0.01-50mM，最优选浓度为0.5-8mM。
优选地，上述反应体系中用到的酶为SCDase G8-del。
优选地，上述反应体系中酶的用量为不少于1U/L，最优选用量为不少于30U/L。
利用以上技术方案，本发明具有以下优点：
1、相比之前的方法，本发明获得的SCDase G8-del表达量高、成本低，对于高浓度的鞘脂和不同种类的鞘脂都有很好的水解作用。
2、利用本发明提供制备溶血鞘脂的方法，具有操作简便、成本低、鞘脂产率高、易于大量制备等特点。
以下将结合附图和实施例对本发明的构思、具体实施方式及产生的技术效果作进一步说明，以充分地了解本发明的目的、特征和效果。
附图说明
图1是自动诱导培养基增强SCDase G8-del的可溶性表达；
图2是各种浓度的钙离子对酶法制备溶血GM1的促进作用；
图3是100mM的不同金属离子对酶法制备溶血GM1的促进作用；
图4是比较不同表面活性剂与高浓度钙离子联用对制备溶血GM1的促进作用；
图5是高浓度表面活性剂TDC与高浓度钙离子联用对制备溶血GM1的促进作用；
图6是不同反应体系对不同浓度底物GM1的水解作用；
图7是比较优化前后的反应体系对不同鞘糖脂的水解。1，4，7：鞘糖脂标准品；2，5，8：优化前的反应体系；3，6，9：优化后的反应体系。
具体实施方式
实施例1：SCDase G8截短突变体表达载体的构建
(1)SCDase G8截短突变体基因的获得
通过以前的关于SCDase G8的报道，并通过NCBI进行检索，可以获得该蛋白基因的全长序列(GenBank:AB079849.1)。由于去掉C端30kDa的SCDase G8具有更高的活性，因而截短的SCDase G8基因依据大肠杆菌中密码子使用频率进行密码子优化，并合成基因，合成的基因片段插入pUC18载体中。
(2)重组表达载体的构建
目的基因通过PCR方法扩增获得，为有效表达重组蛋白，去掉了蛋白N端的信号肽(38个氨基酸)。基因两端的酶切位点与表达载体pET-23b(+)的Nde I和Xho I相对应，用于将目的基因插入该表达载体。PCR产物经PCR回收试剂盒纯化回收，纯化后的产物进行限制性双酶切和Dpn I消化质粒模板。在100μl的反应体系中含纯化的PCR产物20μl，Nde I与Xho I各5μl，Dpn I 1μl，10×buffer 10μl，水59μl。反应混合液在37℃中水浴1h，然后纯化回收，用1％琼脂糖凝胶电泳检测，测定其纯度与浓度，于-20℃保存，备用。
pET-23b(+)质粒载体用质粒提取试剂盒从含pET-23b(+)质粒的E.coli DH5α菌中提取，载体同样用限制性内切酶Nde I和Xho I双酶切并用碱性磷酸酶去磷酸化。30μl的反应体系中包含有pET-23b(+)载体8μl，Nde I与Xho I各1μl，APase 1μl，10×buffer 3μl，水16μl。反应混合液置于37℃水浴，保温10min，并用0.8％琼脂糖凝胶电泳检测。纯化回收双酶切后的线性质粒大片断，用0.8％琼脂糖凝胶电泳检测，测定其纯度和浓度，分装后于-20℃保存，备用。
利用TAKARA快速连接试剂盒将酶切纯化后的目的基因与酶切纯化后的pET-23b(+)线性载体进行连接。20μl的反应体系包含线性化的pET-23b(+)载体3μl，酶切纯化后的目的基因7μl及solution I 10μl。将反应混合液置于16℃孵育30min，然后于冰上放置5min，即可用于转化。将连接产物转入克隆菌株E.coli XL-Blue，选择1-3个阳性克隆进行测序验证。将测序正确的含有目的基因的重组质粒从E.coliXL-Blue中提取出来。
实施例2：重组蛋白SCDase G8-del的表达
利用IPTG诱导表达时，将重组质粒转入表达宿主细胞E.coli BL21(DE3)中，挑取单克隆于LB培养基(1％Tryptone，0.5％Yeast Extract和1％NaCl)中培养，约培养7-8h，将菌液1：100转至新鲜的LB培养基中于37℃继续培养，当OD₆₀₀达到0.6-0.8时，加入终浓度为0.2mM的IPTG，并转移至16℃培养20h。
自动诱导表达时，将培养于LB培养基的菌液，1：100接于自动诱导培养基ZYM-5052(1％ tryptone，0.5％ yeast extract，0.5％ glycerol，0.05％ glucose，0.2％ α-lactose，25mM Na₂HPO₄，25mM KH₂PO₄，50mM NH₄Cl，5mM Na₂SO₄和2mM MgSO₄)于37℃继续培养，当OD₆₀₀达到2.2-2.4时(培养约3h)，降至16℃继续培养20h。
诱导后的菌液在4℃下8000rpm离心10min收集菌体，然后重悬于含500mM NaCl和20mM咪唑的20mM Tris-HCl(pH 8.0)裂解缓冲液中(1g湿菌用20ml裂解缓冲液重悬)。重悬后的菌液用超声破碎，并在4℃下12000rpm离心30min，收集上清，过0.45μm滤膜，然后使用镍亲和层析(Ni-NTA Agarose)进行纯化。具体步骤为：上清挂柱两次，用10ml wash buffer(20mM Tris-HCl(pH 8.0)，500mM NaCl和40mM咪唑)洗掉挂上的杂蛋白，用10ml elute buffer(20mM Tris-HCl(pH 8.0)，500mM NaCl和80mM咪唑)洗下目的蛋白。为比较自动诱导培养基ZYM-5052与LB培养基对蛋白的可溶性表达的影响，取等量(1g)湿菌，按上述步聚纯化蛋白，并跑SDS-PAGE胶，可以看到用自动诱导培养基，能显著增加重组蛋白的可溶性表达量(如图1所示)。为水解鞘脂制备溶血鞘脂，按上述步骤纯化的蛋白装于透析袋中，用含10％甘油的25mM Tris-HCl(pH 7.4)的缓冲液4℃透析两次。透析后的酶液分装于1.5ml EP管中，于-80℃保存。
实施例3：金属离子对酶法水解GM1制备溶血GM1的促进作用
酶法水解GM1制备溶血GM1的反应体系为：100μl的反应混合液中，有70μl含0.1％Triton X-100的50mM乙酸-乙酸钠缓冲液(pH 5.8)，10μl的酶溶液(～74.2mU)，以及终浓度为1mM的鞘糖脂GM1和各种浓度的金属离子Ca²⁺或100mM的金属离子Ca²⁺、Mn²⁺、Co²⁺、Mg²⁺，以不加金属离子的反应体系作对照，反应混合液于37℃孵育12h，充分水解GM1。通过高效液相色谱(HPLC)检测剩余GM1的含量来计算转化率。HPLC的检测条件如下：流动相为0.03％的三乙胺(A)和乙腈(B)，0–2min用20％A和80％B，2–7min用20％–15％A和80％–85％B，7–9min用15％A和85％B，9–13min用20％A和80％B，流速为1ml/min，柱温为30℃，紫外检测波长为205nm，柱子为Eclipse Plus C18，HPLC仪器型号为Agilent 1260。
结果显示，高浓度的金属离子，可以显著提高酶对GM1的水解率，使得溶血GM1产率从40.7％提高到81.6％(如图2和图3所示)。
实施例4：表面活性剂对酶法水解GM1制备溶血GM1的促进作用
酶法水解GM1制备溶血GM1的反应体系为：100μl的反应混合液中，有70μl含0.1％不同表面活性剂(Triton X-100(v/v)、TDC(w/v)、胆酸钠(w/v)、吐温80(v/v))的50mM乙酸-乙酸钠缓冲液(pH 5.8)，10μl的酶溶液(～74.2mU)，以及终浓度为1mM的鞘糖脂GM1和100mM的金属离子Ca²⁺，反应混合液于37℃孵育12h，充分水解GM1。通过HPLC检测剩余GM1的含量来计算转化率。HPLC的检测条件如下：流动相为0.03％的三乙胺(A)和乙腈(B)，0–2min用20％A和80％B，2–7min用20％–15％A和80％–85％B，7–9min用15％A和85％B，9–13min用20％A和80％B，流速为1ml/min，柱温为30℃，紫外检测波长为205nm，柱子为Eclipse Plus C18，HPLC仪器型号为Agilent 1260。
结果显示，在终浓度为100mM的Ca²⁺的基础上，用含0.07％TDC(w/v)的反应混合液，进一步促进GM1的水解，使溶血GM1产率达到88.2％(如图4所示)。
实施例5：高浓度的表面活性剂TDC对酶法水解GM1制备溶血GM1的促进作用
酶法水解GM1制备溶血GM1的反应体系为：100μl的反应混合液中，有70μl含不同浓度的表面活性剂TDC(w/v)的50mM乙酸-乙酸钠缓冲液(pH 5.8)，10μl的酶溶液(～74.2mU)，以及终浓度为1mM的鞘糖脂GM1和100mM的金属离子Ca²⁺，反应混合液于37℃孵育12h，充分水解GM1。通过HPLC检测剩余GM1的含量来计算转化率。HPLC的检测条件如下：流动相为0.03％的三乙胺(A)和乙腈(B)，0–2min用20％A和80％B，2–7min用20％–15％A和80％–85％B，7–9min用15％A和85％B，9–13min用20％A和80％B，流速为1ml/min，柱温为30℃，紫外检测波长为205nm，柱子为Eclipse Plus C18，HPLC仪器型号为Agilent 1260。
结果显示，在终浓度为100mM的Ca²⁺的基础上，随着TDC的浓度的增加，溶血GM1产率进一步增大，当反应混合液中TDC的浓度达到0.28％时，产率达到94.7％，进一步增加TDC浓度至0.7％，产率基本保持不变(如图5所示)。
实施例6：酶法水解高浓度GM1制备溶血GM1
酶法水解GM1制备溶血GM1的反应体系为：100μl的反应混合液中，有70μl含不同浓度的表面活性剂TDC(w/v)的50mM乙酸-乙酸钠缓冲液(pH 5.8)，10μl的酶溶液(～74.2mU)，以及终浓度为100mM的金属离子Ca²⁺和不同浓度的鞘糖脂GM1(0.5-8mM)，反应混合液于37℃孵育12h，充分水解GM1。通过HPLC检测剩余GM1的含量来计算转化率。HPLC的检测条件如下：流动相为0.03％的三乙胺(A)和乙腈(B)，0–2min用20％A和80％B，2–7min用20％–15％A和80％–85％B，7–9min用15％A和85％B，9–13min用20％A和80％B，流速为1ml/min，柱温为30℃，紫外检测波长为205nm，柱子为Eclipse Plus C18，HPLC仪器型号为Agilent 1260。
结果显示，在终浓度为100mM的Ca²⁺的基础上，高浓度的TDC有利于高浓度的GM1的水解，当反应混合液中TDC的浓度为0.56％时，即使底物GM1浓度达到8mM，溶血GM1产率仍然达到91.3％(如图6所示)。
实施例7：酶法高效水解不同鞘糖脂制备对应的溶血鞘糖脂。
酶法水解不同鞘糖脂制备溶血鞘糖脂的优化前的反应体系为：100μl的反应混合液中，有70μl含0.1％(v/v)表面活性剂Triton X-100的50mM乙酸-乙酸钠缓冲液(pH 5.8)，10μl的酶溶液(～74.2mU)，以及终浓度为0.2mM的不同鞘糖脂(GM1，GM3，Sulfatide)，反应混合液于37℃孵育12h，充分水解鞘糖脂，通过薄层层析(TLC)来检测鞘糖脂的水解程度；优化后的反应体系为：100μl的反应混合液中，有70μl含0.8％(w/v)表面活性剂TDC的50mM乙酸-乙酸钠缓冲液(pH 5.8)，10μl的酶溶液，以及终浓度为0.2mM的不同鞘糖脂(GM1，GM3，Sulfatide)和100mM的金属离子Ca²⁺，反应混合液于37℃孵育12h，充分水解鞘糖脂，通过TLC来检测鞘糖脂的水解程度。TLC的展开剂为氯仿、甲醇、0.02％CaCl₂(5:4:1)，显色试剂为地衣酚-硫酸(Orcinol-H₂SO₄)试剂(使用前将7.5ml 60％H₂SO₄加到1ml的1.6％的地衣酚水溶液中)。
结果显示，优化后的反应体系能显著提高酶对不同鞘糖脂的水解率(如图7所示)。
以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术人员无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。

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1、10申请公布号CN104293843A43申请公布日20150121CN104293843A21申请号201410508221X22申请日20140928C12P13/00200601C12N9/80200601C12N15/7020060171申请人上海交通大学地址200240上海市闵行区东川路800号72发明人杨广宇冯雁黄锋涛韩云宾74专利代理机构上海旭诚知识产权代理有限公司31220代理人郑立54发明名称一种高效水解鞘脂制备溶血鞘脂的方法57摘要本发明公开了一种高效水解鞘脂制备溶血鞘脂的方法。首先，本发明对于鞘脂神经酰胺N去酰基化酶SCDASEG8进行了改造，去除了N末端信号肽并截短了C。

2、末端，得到了高活力的SCDASEG8的突变体SCDASEG8DEL，并针对宿主细胞对编码基因进行了密码子优化；通过蛋白表达条件的优化，提高了SCDASEG8DEL的可溶性表达量。在此基础上建立了一种利用SCDASEG8DEL高效水解鞘脂制备溶血鞘脂的方法。该方法优化了高活力的SCDASEG8DEL的可溶性表达条件，优化了反应体系中金属离子浓度，优化了表面活性剂的种类和浓度，提高了溶血鞘脂产率，并且优化后的反应体系对高浓度的鞘脂和不同种类的鞘脂都有较好的水解作用。51INTCL权利要求书1页说明书6页序列表6页附图4页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书6页序列表。

3、6页附图4页10申请公布号CN104293843ACN104293843A1/1页21一种高效水解鞘脂制备溶血鞘脂的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤1构建SCDASEG8截短突变体SCDASEG8DEL的表达载体；2高效表达重组蛋白SCDASEG8DEL；3利用步骤2中的重组蛋白SCDASEG8DEL水解鞘脂制备溶血鞘脂。其中，所述的突变体SCDASEG8DEL是去除了N端的信号肽，截短了C端30KDA，且对其编码基因依据大肠杆菌中密码子使用频率进行了密码子优化的突变体，其基因序列如SEQIDNO1所示；蛋白的氨基酸序如SEQIDNO2所示。2如权利要求1所述的高效水解鞘脂制备溶血鞘脂的方。

4、法，其特征在于，步骤1中构建SCDASEG8DEL的表达载体的具体步骤包括A合成目的基因片段；BPCR扩增目的基因片段；C将目的基因片段插入表达载体质粒中。3如权利要求2所述的高效水解鞘脂制备溶血鞘脂的方法，其特征在于，步骤B中PCR扩增所使用的引物为上游5GTACTTCCATATGACCACGCAAGCCGTCGATT3下游5CCGCTCGAGATGGGCTTCCGCACGTT3。4如权利要求1所述的高效水解鞘脂制备溶血鞘脂的方法，其特征在于，步骤2中所述高效表达是利用IPTG诱导蛋白表达。5如权利要求1所述的高效水解鞘脂制备溶血鞘脂的方法，其特征在于，步骤2中所述高效表达是利用自动诱导培养。

5、基进行培养并在低温条件下诱导蛋白表达。6一种高效水解鞘脂制备溶血鞘脂的方法，其特征在于，所述水解的反应体系包括表面活性剂、缓冲液、底物鞘脂、SCDASE酶和金属离子。7如权利要求6所述的高效水解鞘脂制备溶血鞘脂的方法，其特征在于，所述金属离子为CA2、MN2、CO2或MG2。8如权利要求6所述的高效水解鞘脂制备溶血鞘脂的方法，其特征在于，所述反应体系中的表面活性剂为TRITONX100、牛磺脱氧胆酸钠TDC、胆酸钠或吐温80。9如权利要求68任一项所述的水解鞘糖脂制备溶血鞘糖脂的方法，其特征在于，所述底物鞘脂为鞘糖脂、鞘磷脂或神经酰胺。10如权利要求68任一项所述的水解鞘糖脂制备溶血鞘糖脂的方。

6、法，其特征在于，所述SCDASE酶为SCDASEG8DEL酶，其基因序列如SEQIDNO1所示；蛋白的氨基酸序如SEQIDNO2所示。权利要求书CN104293843A1/6页3一种高效水解鞘脂制备溶血鞘脂的方法技术领域0001本发明属于生物技术领域，涉及一种制备溶血鞘脂的方法，尤其涉及一种利用鞘脂神经酰胺N去酰基化酶高效水解鞘脂制备溶血鞘脂的方法。背景技术0002鞘脂SPHINGOLIPIDS包括鞘糖脂GLYCOSPHINGOLIPIDS、鞘磷脂SPHINGOMYELIN、神经酰胺CERAMIDE，具有着重要的生物学功能，在信号转导，细胞粘附/识别、胞吞、细胞凋亡与自噬、脑老化、神经退行性病。

7、变、神经保护等生理过程中起着重要作用MERRILLAHJR,JBIOCHEM,2002,277292584325846；HANNUNYA,ETAL,NATREVMOLCELLBIOL,2008,92139150；POSSEDECHAVESE,ETAL,FEBSLETT,2010,584917481759；REGINATODESCHINIA,ETAL,BIOCHIMBIOPHYSACTA,2008,17803421433；LOPEZPH,ETAL,CURROPINSTRUCTBIOL,2009,195549557。溶血鞘脂是鞘脂N去酰基化的产物，在正常组织中，溶血鞘脂的含量极低，但在一些溶酶体贮。

8、积症中会累积。一些溶血鞘脂可以作为一些溶酶体贮积症的生物标志分子，例如葡糖苷鞘氨醇溶血葡糖苷神经酰胺是1型戈谢病TYPE1GAUCHERDISEASE的分子标志物；溶血鞘糖脂GB3是法布瑞氏症FABRYDISEASE的分子标志物；溶血鞘糖脂GM2是TAYSACHS病TAYSACHSDISEASE和SANDHOFF病SANDHOFFDISEASE的分子标志物COXTM,ETAL,JPATHOL,2012,2262241254；DEKKERN,ETAL,BLOOD,2011,11816E118127；KODAMAT,ETAL,PLOSONE,2011,612E29074；AERTSJM,ETAL,。

9、PROCNATLACADSCIUSA,2008,105828122817。另外，溶血鞘脂的一个非常重要的应用是可以用来制备各种不同的鞘脂类似物，这些鞘脂类似物可用于合成药物例如鞘糖脂GM1类似物LIGA20、研究鞘脂的生物学功能、以及应用于血清学诊断和酶活测定等方面MANEVH,ETAL,JPHARMACOLTHER,1990,2521419427；MOCCHETTIICELLMOLLIFESCI,2005,62192022832294；PANASIEWICZM,ETAL,BIOCHEMISTRY,2003,422166086619；NAKAGAWAT,ETAL,JLIPIDRES,2005,。

10、46611031112；NAGATSUKAT,ETAL,ACSAPPLMATERINTERFACES,2013,51041734180；NAKAGAWAT,JBIOCHEM,1999,1263604611。目前，有报道用化学方法水解鞘脂来制备溶血鞘脂TAKETOMIT,ETAL,JBIOCHEM,1996,1203573579；TAKETOMIT,ETAL,JBIOCHEM,1997,1212264269；VALIENTEO,ETAL,JLIPIDRES,2001,42813181324，但化学方法存在反应条件剧烈、容易生成副产物、产品分离纯化困难等缺陷，使得产量低并且有一定污染。0003鞘脂。

11、神经酰胺N去酰基化酶SCDASE能够特异水解各种鞘脂，可以用来制备溶血鞘脂。目前报道过的SCDASE主要有两种，分别来自假单胞菌TK4SCDASETK4和海藻希瓦氏菌G8的SCDASEG8，这两个酶氨基酸序列没有同源性ITOM,ETAL,JBIOLCHEM,1995,270412437024374；FURUSATOM,ETAL,JBIOCHEM,2002,277191730017307。目前酶法制备溶血鞘脂用的酶主要是SCDASETK4，说明书CN104293843A2/6页4但该酶难以在大肠杆菌中可溶性表达，商品化生产SCDASETK4依赖于从原始菌的培养液中提取，导致该酶价格非常昂贵，用来。

12、制备溶血鞘脂的成本相当高。另外，由于该酶除水解鞘脂的活性之外还可以催化其逆反应合成鞘脂，使得溶血鞘脂产物的产率低。虽然有报道用含有机溶剂的两相体系优化该酶的水解条件，提高了溶血鞘脂的产量，但该方法复杂，并且不适用于溶血鞘脂的大量制备，难以满足实际需要KURITAT,ETAL,JLIPIDRES,2000,415846851。SCDASEG8有报道该蛋白可以在大肠杆菌中可溶性表达，但该酶的可溶性表达量还是很低，使其应用受到较大限制FURUSATOM,ETAL,JBIOCHEM,2002,277191730017307。0004因此，本领域的技术人员致力于开发一种能够高效制备溶血鞘脂的方法，而此方。

13、法的关键就是实现高活力的SCDASE在宿主细胞中高效表达，并提高该酶水解鞘脂制备溶血鞘脂的产率。发明内容0005有鉴于现有技术的上述缺陷，本发明所要解决的技术问题是寻找一种能够在宿主细胞中高效表达的鞘脂神经酰胺N去酰基化酶SCDASE，并利用该酶高效水解鞘脂制备溶血鞘脂。0006根据前人研究，C末端截短30KDA的突变体SCDASEG8活性显著高于长全的酶FURUSATOM,ETAL,JBIOCHEM,2002,277191730017307，但对于其高效表达条件未见报道。本发明依照大肠杆菌密码子偏好性，对SCDASEG8基因进行密码子优化，将去掉N端信号肽及C端截短的SCDASEG8SCDA。

14、SEG8DEL基因构建到载体中。将构建好的重组质粒转化到宿主细胞中，通过蛋白表达条件的优化，增强了目的蛋白SCDASEG8DEL的可溶性表达。0007从而为实现高效制备溶血鞘脂的目的，本发明提供了一种高效水解鞘脂制备溶血鞘脂的方法，该方法包括以下步骤00081构建SCDASEG8截短突变体SCDASEG8DEL的表达载体；00092高效表达重组蛋白SCDASEG8DEL；00103利用步骤2中的重组蛋白SCDASEG8DEL水解鞘脂制备溶血鞘脂。0011其中，所述的突变体SCDASEG8DEL是去除了N端的信号肽，截短了C端30KDA，且对其编码基因依据大肠杆菌中密码子使用频率进行了密码子优化。

15、的突变体，其基因序列如SEQIDNO1所示；蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO2所示。0012进一步地，步骤1中构建SCDASEG8DEL的表达载体的具体步骤包括A合成目的基因片段；BPCR扩增目的基因片段；C将目的基因片段插入表达载体质粒中；其中优选地，PCR扩增所使用的引物为0013上游5GTACTTCCATATGACCACGCAAGCCGTCGATT3下划线标注的为NDEI酶切位点0014下游5CCGCTCGAGATGGGCTTCCGCACGTT3下划线标注的为XHOI酶切位点；0015优选的表达载体质粒为PET23B。0016进一步地，步骤2中所述的高效表达是指将构建好的重组质粒转化到宿。

16、主细胞说明书CN104293843A3/6页5中并通过一定的诱导条件诱导增强蛋白的表达，包括但不限于利用IPTG诱导表达或利用自动诱导培养基进行培养并在低温条件下诱导蛋白表达。0017优选地，所述宿主细胞为大肠杆菌BL21DE3。0018本发明还提供了一种高效水解鞘脂制备溶血鞘脂的反应体系，包括表面活性剂、缓冲液、底物鞘脂、SCDASE酶和金属离子。0019优选地，上述反应体系中所述金属离子包括但不限于CA2、MN2、CO2、MG2，其中最优选为CA2。0020优选地，反应体系中金属离子浓度为11000MM，其中最优选CA2的浓度为100MM。0021优选地，上述反应体系中的表面活性剂包括但不。

17、限于TRITONX100、牛磺脱氧胆酸钠TDC、胆酸钠或吐温80，其中最优选为牛磺脱氧胆酸钠TDC。0022优选地，上述反应体系中表面活性剂的浓度为0012V/V或W/V。0023优选地，上述体系中的底物鞘脂为鞘糖脂、鞘磷脂或神经酰胺。0024优选地，上述反应体系中的底物鞘脂浓度为00150MM，最优选浓度为058MM。0025优选地，上述反应体系中用到的酶为SCDASEG8DEL。0026优选地，上述反应体系中酶的用量为不少于1U/L，最优选用量为不少于30U/L。0027利用以上技术方案，本发明具有以下优点00281、相比之前的方法，本发明获得的SCDASEG8DEL表达量高、成本低，对于。

18、高浓度的鞘脂和不同种类的鞘脂都有很好的水解作用。00292、利用本发明提供制备溶血鞘脂的方法，具有操作简便、成本低、鞘脂产率高、易于大量制备等特点。0030以下将结合附图和实施例对本发明的构思、具体实施方式及产生的技术效果作进一步说明，以充分地了解本发明的目的、特征和效果。附图说明0031图1是自动诱导培养基增强SCDASEG8DEL的可溶性表达；0032图2是各种浓度的钙离子对酶法制备溶血GM1的促进作用；0033图3是100MM的不同金属离子对酶法制备溶血GM1的促进作用；0034图4是比较不同表面活性剂与高浓度钙离子联用对制备溶血GM1的促进作用；0035图5是高浓度表面活性剂TDC与高。

19、浓度钙离子联用对制备溶血GM1的促进作用；0036图6是不同反应体系对不同浓度底物GM1的水解作用；0037图7是比较优化前后的反应体系对不同鞘糖脂的水解。1，4，7鞘糖脂标准品；2，5，8优化前的反应体系；3，6，9优化后的反应体系。具体实施方式0038实施例1SCDASEG8截短突变体表达载体的构建00391SCDASEG8截短突变体基因的获得0040通过以前的关于SCDASEG8的报道，并通过NCBI进行检索，可以获得该蛋白基因的全长序列GENBANKAB0798491。由于去掉C端30KDA的SCDASEG8具有更高的活性，因而截短的SCDASEG8基因依据大肠杆菌中密码子使用频率进行。

20、密码子优化，并合成基因，说明书CN104293843A4/6页6合成的基因片段插入PUC18载体中。00412重组表达载体的构建0042目的基因通过PCR方法扩增获得，为有效表达重组蛋白，去掉了蛋白N端的信号肽38个氨基酸。基因两端的酶切位点与表达载体PET23B的NDEI和XHOI相对应，用于将目的基因插入该表达载体。PCR产物经PCR回收试剂盒纯化回收，纯化后的产物进行限制性双酶切和DPNI消化质粒模板。在100L的反应体系中含纯化的PCR产物20L，NDEI与XHOI各5L，DPNI1L，10BUFFER10L，水59L。反应混合液在37中水浴1H，然后纯化回收，用1琼脂糖凝胶电泳检测，。

21、测定其纯度与浓度，于20保存，备用。0043PET23B质粒载体用质粒提取试剂盒从含PET23B质粒的ECOLIDH5菌中提取，载体同样用限制性内切酶NDEI和XHOI双酶切并用碱性磷酸酶去磷酸化。30L的反应体系中包含有PET23B载体8L，NDEI与XHOI各1L，APASE1L，10BUFFER3L，水16L。反应混合液置于37水浴，保温10MIN，并用08琼脂糖凝胶电泳检测。纯化回收双酶切后的线性质粒大片断，用08琼脂糖凝胶电泳检测，测定其纯度和浓度，分装后于20保存，备用。0044利用TAKARA快速连接试剂盒将酶切纯化后的目的基因与酶切纯化后的PET23B线性载体进行连接。20L的。

22、反应体系包含线性化的PET23B载体3L，酶切纯化后的目的基因7L及SOLUTIONI10L。将反应混合液置于16孵育30MIN，然后于冰上放置5MIN，即可用于转化。将连接产物转入克隆菌株ECOLIXLBLUE，选择13个阳性克隆进行测序验证。将测序正确的含有目的基因的重组质粒从ECOLIXLBLUE中提取出来。0045实施例2重组蛋白SCDASEG8DEL的表达0046利用IPTG诱导表达时，将重组质粒转入表达宿主细胞ECOLIBL21DE3中，挑取单克隆于LB培养基1TRYPTONE，05YEASTEXTRACT和1NACL中培养，约培养78H，将菌液1100转至新鲜的LB培养基中于37。

23、继续培养，当OD600达到0608时，加入终浓度为02MM的IPTG，并转移至16培养20H。0047自动诱导表达时，将培养于LB培养基的菌液，1100接于自动诱导培养基ZYM50521TRYPTONE，05YEASTEXTRACT，05GLYCEROL，005GLUCOSE，02LACTOSE，25MMNA2HPO4，25MMKH2PO4，50MMNH4CL，5MMNA2SO4和2MMMGSO4于37继续培养，当OD600达到2224时培养约3H，降至16继续培养20H。0048诱导后的菌液在4下8000RPM离心10MIN收集菌体，然后重悬于含500MMNACL和20MM咪唑的20MMTR。

24、ISHCLPH80裂解缓冲液中1G湿菌用20ML裂解缓冲液重悬。重悬后的菌液用超声破碎，并在4下12000RPM离心30MIN，收集上清，过045M滤膜，然后使用镍亲和层析NINTAAGAROSE进行纯化。具体步骤为上清挂柱两次，用10MLWASHBUFFER20MMTRISHCLPH80，500MMNACL和40MM咪唑洗掉挂上的杂蛋白，用10MLELUTEBUFFER20MMTRISHCLPH80，500MMNACL和80MM咪唑洗下目的蛋白。为比较自动诱导培养基ZYM5052与LB培养基对蛋白的可溶性表达的影响，取等量1G湿菌，按上述步聚纯化蛋白，并跑SDSPAGE胶，可以看到用自动诱导。

25、培养基，能显著增加重组蛋白的可溶性表达量如图1所示。为水解鞘脂制备溶血鞘脂，按上述步骤纯化的蛋白装于透说明书CN104293843A5/6页7析袋中，用含10甘油的25MMTRISHCLPH74的缓冲液4透析两次。透析后的酶液分装于15MLEP管中，于80保存。0049实施例3金属离子对酶法水解GM1制备溶血GM1的促进作用0050酶法水解GM1制备溶血GM1的反应体系为100L的反应混合液中，有70L含01TRITONX100的50MM乙酸乙酸钠缓冲液PH58，10L的酶溶液742MU，以及终浓度为1MM的鞘糖脂GM1和各种浓度的金属离子CA2或100MM的金属离子CA2、MN2、CO2、M。

26、G2，以不加金属离子的反应体系作对照，反应混合液于37孵育12H，充分水解GM1。通过高效液相色谱HPLC检测剩余GM1的含量来计算转化率。HPLC的检测条件如下流动相为003的三乙胺A和乙腈B，02MIN用20A和80B，27MIN用2015A和8085B，79MIN用15A和85B，913MIN用20A和80B，流速为1ML/MIN，柱温为30，紫外检测波长为205NM，柱子为ECLIPSEPLUSC18，HPLC仪器型号为AGILENT1260。0051结果显示，高浓度的金属离子，可以显著提高酶对GM1的水解率，使得溶血GM1产率从407提高到816如图2和图3所示。0052实施例4表面。

27、活性剂对酶法水解GM1制备溶血GM1的促进作用0053酶法水解GM1制备溶血GM1的反应体系为100L的反应混合液中，有70L含01不同表面活性剂TRITONX100V/V、TDCW/V、胆酸钠W/V、吐温80V/V的50MM乙酸乙酸钠缓冲液PH58，10L的酶溶液742MU，以及终浓度为1MM的鞘糖脂GM1和100MM的金属离子CA2，反应混合液于37孵育12H，充分水解GM1。通过HPLC检测剩余GM1的含量来计算转化率。HPLC的检测条件如下流动相为003的三乙胺A和乙腈B，02MIN用20A和80B，27MIN用2015A和8085B，79MIN用15A和85B，913MIN用20A和。

28、80B，流速为1ML/MIN，柱温为30，紫外检测波长为205NM，柱子为ECLIPSEPLUSC18，HPLC仪器型号为AGILENT1260。0054结果显示，在终浓度为100MM的CA2的基础上，用含007TDCW/V的反应混合液，进一步促进GM1的水解，使溶血GM1产率达到882如图4所示。0055实施例5高浓度的表面活性剂TDC对酶法水解GM1制备溶血GM1的促进作用0056酶法水解GM1制备溶血GM1的反应体系为100L的反应混合液中，有70L含不同浓度的表面活性剂TDCW/V的50MM乙酸乙酸钠缓冲液PH58，10L的酶溶液742MU，以及终浓度为1MM的鞘糖脂GM1和100MM。

29、的金属离子CA2，反应混合液于37孵育12H，充分水解GM1。通过HPLC检测剩余GM1的含量来计算转化率。HPLC的检测条件如下流动相为003的三乙胺A和乙腈B，02MIN用20A和80B，27MIN用2015A和8085B，79MIN用15A和85B，913MIN用20A和80B，流速为1ML/MIN，柱温为30，紫外检测波长为205NM，柱子为ECLIPSEPLUSC18，HPLC仪器型号为AGILENT1260。0057结果显示，在终浓度为100MM的CA2的基础上，随着TDC的浓度的增加，溶血GM1产率进一步增大，当反应混合液中TDC的浓度达到028时，产率达到947，进一步增加TD。

30、C浓度至07，产率基本保持不变如图5所示。0058实施例6酶法水解高浓度GM1制备溶血GM10059酶法水解GM1制备溶血GM1的反应体系为100L的反应混合液中，有70L含不说明书CN104293843A6/6页8同浓度的表面活性剂TDCW/V的50MM乙酸乙酸钠缓冲液PH58，10L的酶溶液742MU，以及终浓度为100MM的金属离子CA2和不同浓度的鞘糖脂GM1058MM，反应混合液于37孵育12H，充分水解GM1。通过HPLC检测剩余GM1的含量来计算转化率。HPLC的检测条件如下流动相为003的三乙胺A和乙腈B，02MIN用20A和80B，27MIN用2015A和8085B，79MI。

31、N用15A和85B，913MIN用20A和80B，流速为1ML/MIN，柱温为30，紫外检测波长为205NM，柱子为ECLIPSEPLUSC18，HPLC仪器型号为AGILENT1260。0060结果显示，在终浓度为100MM的CA2的基础上，高浓度的TDC有利于高浓度的GM1的水解，当反应混合液中TDC的浓度为056时，即使底物GM1浓度达到8MM，溶血GM1产率仍然达到913如图6所示。0061实施例7酶法高效水解不同鞘糖脂制备对应的溶血鞘糖脂。0062酶法水解不同鞘糖脂制备溶血鞘糖脂的优化前的反应体系为100L的反应混合液中，有70L含01V/V表面活性剂TRITONX100的50MM乙。

32、酸乙酸钠缓冲液PH58，10L的酶溶液742MU，以及终浓度为02MM的不同鞘糖脂GM1，GM3，SULFATIDE，反应混合液于37孵育12H，充分水解鞘糖脂，通过薄层层析TLC来检测鞘糖脂的水解程度；优化后的反应体系为100L的反应混合液中，有70L含08W/V表面活性剂TDC的50MM乙酸乙酸钠缓冲液PH58，10L的酶溶液，以及终浓度为02MM的不同鞘糖脂GM1，GM3，SULFATIDE和100MM的金属离子CA2，反应混合液于37孵育12H，充分水解鞘糖脂，通过TLC来检测鞘糖脂的水解程度。TLC的展开剂为氯仿、甲醇、002CACL2541，显色试剂为地衣酚硫酸ORCINOLH2S。

33、O4试剂使用前将75ML60H2SO4加到1ML的16的地衣酚水溶液中。0063结果显示，优化后的反应体系能显著提高酶对不同鞘糖脂的水解率如图7所示。0064以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术人员无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。说明书CN104293843A1/6页900010002序列表CN104293843A2/6页100003序列表CN104293843A103/6页110004序列表CN104293843A114/6页120005序列表CN104293843A125/6页130006序列表CN104293843A136/6页14序列表CN104293843A141/4页15图1图2说明书附图CN104293843A152/4页16图3图4说明书附图CN104293843A163/4页17图5图6说明书附图CN104293843A174/4页18图7说明书附图CN104293843A18。

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