维生素D3的分离方法 本发明涉及用柱色谱从与其它组分如脱氢胆固醇，速甾醇和光甾醇的混合物中分离维生素D3或前维生素D3的方法。
维生素D是高级动物中调节钙新陈代谢所必需的生物活性物质。不同维生素D的侧链性质有所不同。实际上最重要的两种是维生素D2(麦角钙化甾醇)和维生素D3(胆钙化甾醇)。前维生素D广泛地分布在高级动物和植物中。紫外光照射可以使前维生素D3产生足够的光活化。过去，维生素D3也作为预防佝偻病的维生素而为人所知。在我们这一地区，佝偻病通常不是因为前维生素的缺乏，而是光照不足。如今，工业制备维生素D是通过转化类似于胆固醇的天然前体来进行。
维生素D3不溶于水，难溶于油脂但在乙醇、氯仿，醚和丙酮中有好的溶解性。维生素D3对光、空气，热和酸敏感。维生素D3的熔点在84～87℃。从文献中可得知维生素D3于超临界或亚临界液体中，例如在温度为40～60°而压力为20～35MPa的超临界CO2中的溶解性。工业上合成维生素D3的方法基于光照射来自胆固醇的7-脱氢胆固醇(DHC)。DHC经光照转化成前维生素D3，然后经温和加热异构化成维生素D3。而且在光照射DHC时也产生了光甾醇和速甾醇。前维生素D3以及由此维生素D3的产率主要取决于光照条件。
在光照结束时，各种不同的方法用于纯化母液。由此，例如目前副产物速甾醇经狄尔斯-阿德耳反应转化成速甾醇的二钾盐加合物，后者再分离出来。
传统的方法有许多缺点。产率受光反应平衡态的限制。狄尔斯-阿德耳反应需要添加其它化学试剂，并不能得到基于原料的维生素D3或前维生素D3的百分之百的产率。纯化到晶体级需要使用化学试剂如吡啶和丁酰氯进行附加反应，同时也没有完全的反应。总之，由此存在有价值产物的损失。
本发明的目的是避免从例如当使用光照法时所形成的异构体混合物中制备前维生素D3或维生素D3时地这些缺点。
这个目的根据本发明可以通过用柱色谱从混合物中分离维生素D3或前维生素D3来达到。
优选地，添加有极性改性剂例如乙醇的超临界或液态二氧化碳被用作流动相，并且任选改性的硅胶作为固定相。
本发明一个优选的实施方案将在下面借助附图进行描述。
图1.各个方法步骤的工艺流程图
图2.设备的方框图。
如图1中所示，母液首先进行热异构化，然后进行色谱分离，由此除去残余的7-脱氢胆固醇(DHC)和速甾醇(T3)，并将它们循环到光照反应物中。因为该光化反应是一个平衡反应，循环现有的副产物组分可以阻止副产物的重新形成，从而增加产率。维生素D3可以从所得的有用馏分(馏分2)中结晶。残余在溶液中的部分维生素D3，，前维生素D3(P3)和光甾醇(L3)同样被循环到光照反应物中。如果需要，馏分2可以另外用色谱进行分离。
色谱法具有以下优点：
-避免了狄尔斯-阿德耳反应，
-副产物馏分可循环进入工艺中，
-更高的产率。
-更纯的产物：
特别是在使用SFC(用超临界气体的色谱)时，
-无溶剂过程步骤，
-用卸压进行简单的分离，
-洗脱液的顺利循环。
原则上，本发明的方法按如下步骤进行：将异构体混合物和超临界或液体流动相进行混合(如果需要异构体混合物处于加压状态)，将所有的混合物输入到填充有上述固定相的色谱柱中(可以随后用更多的流动相)，然后让它流过(洗脱)，其中洗脱在所选温度和压力条件下进行，以及基于固定相和混合物的各种组分间的强相互作用，这些组分每单位时间被分离开，并且先后从柱中洗脱出来，溶解在流动相(洗脱液)中的组分在连续检测(测定)后被收集在由检测剂确定的接受器中，二氧化碳通过卸压(挥发)从所收集的材料中除去，使得最终所得的分离组分或“馏分”(尤其所需的维生素D3或前维生素D3)在各自的接受器中没有了二氧化碳。如果需要，在洗脱和从柱中排出后洗脱液可以进行一个或多个附加的类似色谱过程以获得组分间的更好的分离。同样的过程适用不具有理想的纯度的任何特定馏分。
任何含有维生素D3或前维生素D3的适当混合物可以用作本发明方法中的维生素D3异构体混合物。因此，例如可以使用热异构化之前或之后的合成混合物。
含有维生素D3和/或前维生素D3的异构体混合物通常不用稀释就与超临界或液态流动相一起施加到填充有本发明所用的固定相的色谱柱，虽然它可以预先溶解在一种适当的溶剂中，例如低级醇，优选乙醇。但是，优选使用不加稀释的混合物。
在本发明方法中所用的超临界二氧化碳众所周知是一种温度至少约31℃和压力至少约7.3MPa的二氧化碳形式，并且它既不是完全的液态也不是完全气态而是两种物态的混合体。本发明方法中作为另一替代方案所用的液态二氧化碳温度小于约31℃而压力大于约7.3Mpa。使用二氧化碳的优点是它无毒，不燃烧，易通过卸压收集的洗脱液去除，并且在所分离的馏分(例如维生素D3和前维生素D3)中不留下有害的残余物。另外，可以广泛地得到十分纯的二氧化碳而且不贵。如果需要可以与作为流动相一部分的一种有机共溶剂(改性剂)，例如已提到的乙醇或与其它醇(例如甲醇)或烷烃(例如n-己烷)或酮(例如丙酮)一起使用。因为二氧化碳的临界温度并不比室温高多少以及用本发明所得到的物质都是对温度敏感(热敏性的)，由于这些理由，二氧化碳也是十分适合作为本发明方法中的流动相。
在本发明方法中用作固定相的改性硅胶基本上以均匀的填充的，颗粒尺寸约为5～25μm的非均一的或优选球状的颗粒形式存在是有利的。Zorbax和Hyperprep是可购得的硅胶的实例。前者的比表面积SBET为350m2/g，孔体积Vp为0.53ml/g，孔直径D为60-150A以及颗粒尺寸dp50为10μm，而后者SBET为300m2/g，Vp为0.7ml/g，D为100A以及颗粒尺寸dp50为12μm。
为了使本发明方法中用作流动相的二氧化碳保持在超临界或液态范围，必须保持一定的温度和压力条件，这不仅在将二氧化碳加入填充有固定相的色谱柱中时而且在接着的洗脱过程中也是如此。本方法适宜在0～约100°的温度范围内和约7.5～约32.0MPa的压力下进行。优选温度范围为约30～约60℃以及相应压力范围为7.5～15.0MPa。二氧化碳的密度可以通过在前面提到的温度范围和压力范围内的压力和温度进行调节并在约170kg/m3～约850kg/m3内。
不仅是进行本发明方法的温度和压力条件，而且对固定相和流动相的选择对分离结果产生影响。通常，增加温度或减少压力使不同的洗脱异构体在时间分开，而增加压力或减少温度使各洗脱物挤到一起，由此这些参数的可选变量可以确定单位时间本发明方法的进程。
流动相不同混合物的任选影响。
在色谱柱中连接洗脱出来并溶解在二氧化碳(洗脱液)中的组分的检测是同时，优选用紫外光检测仪和火焰离子检测仪(FID)进行的。检测是一种对接受器中的不同洗脱液分布进行电子学控制的方法。这种技术本身为大家所熟悉，从各自收集材料中去除二氧化碳(通过卸压)的方法也是如此。
基于下面的实施例对本发明进行阐述。实施例：
惠普公司的设备(HP G 1205A SFC)用于研究由异构体混合物色谱法制备各组分(特别是维生素D3或前维生素D3)。该设备包含的基本元件有泵，带有气相检测仪的炉，外部检测仪和自动取样器。图1显示了设备的工艺流程图，连续地向设备加入液态二氧化碳。取决于所选的压力和温度条件，流动相可以在超临界范围(在纯的CO2情况下大于约31℃和7.3MPa)或在亚临界范围内进行操作。
设备以“顺流”模式进行操作。这种操作过程表示当使用内径大于1mm的填充柱时，除了液流，系统中的柱反压力用作固定的调节器。高压液态CO2(P＞＞35MPa)的泵输送是通过内部的气体网络实现的。用减压器将泵的进口压力降至Pinput＞＞10MPa。这种设置可以在某一范围内变化，由此确保向泵输送液相。输送和压缩到所需的柱前压是用活塞泵实现的。泵头温度为278k是为了驱散压缩所产生的热量。分析柱位于炉中，在此流动相加热到测试温度。进样是用一个装有5μl内部回路管的气动式控制四通Rheodyne阀来实现的。装有-50μl注射器的自动进样器从注射口往内部回路管注入样品液。随后样品随流动相流入柱中。在此，混合物的分离是基于固定相和样品液的各组分之间作用强度的差异而发生的。混合物的各组分(在理想情况中)先后地从柱中洗脱出来。经过分析柱后洗脱液流实现了永久的分流。这种分流是用固定的限流器达到的，限流器将分流的液流传送到气相检测仪，一种火焰离子检测仪(FID)。更大部分在分流后剩余的洗脱液流经过二极管阵列检测仪(DAD)。在DAD后连接一个SFC卸压单元。
色谱图用数据系统进行记录。SFC分析测试表明成功地分离维生素D3异构体。用CO2作为洗脱液而没有改性剂的分离在这种情况下是不可能的。另一方面，CO2中加入少量醇可得到极其好的结果。许多不同的并都基于二氧化硅的正相材料被用作固定相。维生素D3和速甾醇(例如在氰基相上)的选择性约为＞＞1.5(见图2)，这任选用于制备分离。醇的性质(甲醇，乙醇，异丙醇)实际上没有影响。选择性随同时的保留时间延长和改性剂比例越少而增加。可以通过增加CO2的密度(或流动相的密度)在一定程度上缩短保留时间。