本发明的公开
过去，利用重组型仙台病毒，我们已经建立了一个有效的抗原表达系统
(Sev)(Kato，A.等人，1996年，基因细胞第1卷：第569-579页)。1型
小鼠副流感病毒SeV是带有未分区段的负义RNA基因组的有包膜病毒，属
于副粘病毒属(Nagai，Y.1999年，《医学病毒学综述》(Rev.Med.Virol.)第
9卷：第83-99页)。该病毒在小鼠中引起致命的呼吸疾病，但可以相信该病
毒对非人的灵长类和人是不致病的(Nagai，Y.1999年《医学病毒学综述
》(Rev.Med.Virol.)，第9卷：第83-99页；Hurwitz，J.L.等人，《疫苗》，第
15卷：第533-540页，1997年)。
因为SeV的复制发生在核相以外的细胞质中，所以甚至慢病毒的结构
蛋白如Gag，Pol，和Env也可以期望利用重组型SeV载体，通过不依赖
Rev的方式有效地表达。更重要的是，Sev载体可以感染不分裂的细胞，并
在那里强烈地表达外源基因。例如，在培养基上清液中，重组SeV载体
(V(-)SeV)表达的1型人免疫缺陷病毒(HIV-1)Env gp120的量高达6微克/毫升
(相当于每106个细胞6微克)，是哺乳动物细胞培养系统中目前通用的载体
中最高的表达量(Yu，D.等人1997年《基因细胞》，第2卷：457-466页)。
在本发明中，为了利用重组仙台病毒(SeV)载体作为AIDS疫苗，我们已经评
估了该系统在弥猴中引发针对猿猴免疫缺陷病毒(SIV)的保护性免疫的能力。
我们还首创了SeV的副基因，V基因，已经被敲出的突变体SeV，
V(-)SeV(Kato，A.等人1997年《病毒学杂志》，71卷：第7266-7272页；
Kato，A.等人1997年《欧洲分子生物学杂志》(EMBO J.)第16卷：第578
-587页)。在小鼠中，这一V(-)SeV的毒性大大地减弱了，但它的基因表达
却增强了许多。从安全性和有效性两方面考虑，我们已经利用这一V(-)版本
作为载体主链。在这之后，我们利用V(-)SeV制造了表达猿猴免疫缺陷病毒
菌株mac239(SIVmac239)的Gag抗原的重组型V(-)SeV，本文命名为
SeV/SIVgag，并为了检测在弥猴AIDS模型中接种它的保护效力，评估了它
在弥猴中的抗SIV免疫诱导的效力(Johnson，R.P.1996年，《现代免疫学评论
》第8卷：554-560页；Almond，N.M.，和Heeney，J.L.1998年，《艾滋
病》，第12卷：第133-140页)。
将表达SIVGag的重组型SeV，SeV/SIVgag回收。在体外检测
SeV/SIVgag介导的Gag的表达诱导的特异于SIV Gag的细胞免疫应答。在
有细胞毒性的T淋巴细胞实验中，SeV/SIVgag-感染的细胞是作为特异于Gag
的CTL的靶工作的。在外周血液淋巴细胞的培养中，SeV/SIVgag-感染的细
胞诱导了特异于Gag的CTL群体的扩增。在四个食蟹猴的动物实验中，在
鼻内，两个弥猴用SeV/SIVgag接种，另一个接种对照SeV，还有一个是未接
种的对照。在首次接种后22星期时，用100TCID50的SIVmac239静脉内攻
击这些弥猴，激发免疫应答。用SIV激发均一地导致了在急性期，所有的弥
猴的血浆中有高负荷的SIV。但随后的病毒负荷在SeV/SIVgag接种的弥猴
中比对照中(约105拷贝/毫升)少得多，并且最终在可检测水平(100拷贝/毫升)
周围波动。有实验表明，利用表达SIV结构蛋白的SeV接种可以明显地降
低SIV激发后慢性期中的病毒量(调定点)。这些结果暗示了SeV载体在新的
AIDS疫苗中有潜在用途，并且能有效地用于评估细胞免疫应答。
本发明的一个目的是证实重组型SeV系统诱导了有效的SIV Gag表达，
同时被指明的是，在AIDS疫苗的开发中采用这一系统的可行性。与AIDS
疫苗研究中广泛采用的痘病毒载体比较，SeV载体的细胞毒性更小，并且在
哺乳动物细胞中，它的抗原表达水平明显更高(Yu，D.等人，1997年，《
基因细胞》第2卷：457-466页)。用于实施例中的Sev载体的一个特征是
插入的基因能比任何其它起源于该载体的SeV特异基因更准时和更有效地
表达，因为它的调节靠近SeV基因组的3’末端(Nagai，Y.，1999，Rev.Med.
Viro.9卷：83-99)。这对于有效地诱导特异于靶抗原的免疫应答必然是有
利的。
在CTL实验中，SeV/SIVgag感染的B-LCL与特异于SIV Gag的CTL
的靶的功能一样好。另外，将正常的外周血液单核细胞(PBMC)与SeV/SIVgag
感染的PBMC共培养导致诱导了IFN-γ和特异于SIV Gag的CTL群体的扩
增。这些结果表明，我们的SeV系统可用于评估特异于抗原的细胞免疫应答。
利用重组的SeV载体，在没有固定或UV辐射时，我们能够容易地进行为了
扩增展CTL的共培养，因为在没有从外源加入将它的失活的包被蛋白质前
体加工成活化形式所需要的类胰蛋白酶时，SeV不能感染共培养细胞(Nagai，
Y.，1993年，微生物学趋势，第1卷：第81-87页)。
正如在最近的报道(Geretti，A.M.等人，1998年，《遗传病毒学杂志》，
第79卷：415-421；Matano，T.等人，1998年，《病毒学杂志》，第72
卷：164-169；Ogg，G.S.等人，1998年，《科学》，第279卷：第2103-
2106页；Rowland-Jones，S.L.等人，1998年，临床研究杂志，第102卷：
第1758-1765页；Jin，X.等人，1999年，《实验方法杂志》，第189卷：
第991-998页；Schmitz，J.E.等人，1999年，《科学》，第283卷：第
857-860页)中已经指出的，诱导特异于病毒的细胞免疫应答具有针对HIV
-1感染的保护性。SeV/SIVgag感染的PBMC诱导了特异于SIV Gag的CTL
的扩展。这表明了我们的系统具有在体内诱导特异于抗原的细胞免疫应答的
能力。
在SIVmac239激发的实验中，在感染的急性期，接种SeV/SIVgag的食
蟹猴的血浆中的SIV负荷是比得上对照中的。但是，随后，接种SeV/SIVgag
的食蟹猴明显表现出更低的SIV负荷。特别值得注意的是，病毒负荷逗留在
最低水平或在可检测水平之下。只利用一个抗原成分(Gag)的明显的感染保
护也是值得注意的。这在慢性期(调定点)中诱导血浆病毒负荷可能是由于特
异于SIV Gag的T细胞群体的高频活化。T细胞前体的活化频率极大地依赖
于病毒感染的天然过程中最初的爆发规模。SeV在外源抗原的生产力中的非
常高的性能可以归功于可推测的高T细胞前体频度。但是，再给药相同的重
组病毒也不足于增强特异于Gag的应答。因此，用SeV/SIVgag激发和用不
同的病毒载体，DNA疫苗，等等强化是可行的。当在实施例中只有Gag抗
原用于免疫时，利用重组型SeV载体表达多个抗原可以提高保护效率。
因为SeV的复制需要加工包被的蛋白酶，所以它的复制的趋性限制于
特定的组织如呼吸道上皮(Nagai，Y.，1993年，《微生物学趋势》(Trends
Microbiol.)，第1卷：第81-87页)。预期在呼吸道以外，没有传播到其它
组织中，暗示了SeV载体甚至在复制活性态形式中也具有安全的优点。另外，
通过鼻内给药重组SeV载体可以期望诱导全身的粘膜的免疫。这可能是SeV
载体在预防HIV-1感染中的另一个优点。
本发明首先公开了灵长类中SeV的原代复制的分析。在临床研究以前，
评估它在灵长类中的效率，效力和安全性是必需的，因为基于病毒载体的基
因诱导的效力依赖于宿主。虽然有报告检测了鼻内接种SeV后非洲绿猴的鼻
棉拭样品，但灵长类中SeV的复制还没有很好地鉴定(Hurwitz，J.L.等人，1997
年，《疫苗》，第15卷：第533-540页)。在我们过去的研究中，在
SeV/SIVgag接种后不到一年的弥猴组织中，包括尸体解剖得到的鼻粘膜和
肺中是检测不到SeV/SIVgag的表达的(数据未显示)。在这一研究中，我们检
测了用重组的SeV载体接种的弥猴中初发时期的抗原表达和细胞免疫应答。
在用表达SIV Gag的重组SeV(SeV/SIVgag)鼻内接种弥猴后，检测了各种组
织中gag的表达和细胞免疫应答。SeV的复制是得到控制的，并且Gag的表
达主要限制在鼻粘膜和它的局部的淋巴结(LN)中。在鼻粘膜内观察到了旺盛
的gag表达，在局部的咽后的和下颌下的淋巴结(LN)中，观察到了降低的但
仍然明显的gag表达。在免疫后不到一星期表达达到峰值，并且至少持续到
第13天。在第4天时从鼻棉拭毫无疑问地分离到了SeV/SIVgag，在第7天
时却不经常分离到了，在13天时完全分离不到了。在另一方面，在远处的
淋巴组织如胸腺，脾和腹股沟的LN中不能检测到抗原的表达。猴子中，SeV
表达的这样的组织局限性和发展顺序是和天然宿主，小鼠中SeV的复制方式
相一致的，可见小鼠中的呼吸道上皮的急性粘膜感染定位于呼吸道而不是普
遍性的感染。但是，与小鼠相比，气管和肺中十分缺乏抗原，表明在弥猴中，
该病毒的传播是受限制的。另外，分析第7天时的细胞免疫应答显示很快出
现特异于SeV的CD8+T细胞。在免疫后，没有猴子展现出可喜的临床现象。
在弥猴的鼻腔中接种SeV/SIVgag导致有效地诱导了特异于Gag的CD8+T
细胞。在咽后LN以及周边血液单核细胞中检测到明显频度的特异于Gag的
CD8+T细胞，表明甚至在灵长类中SeV也具有能有效地诱导特异于抗原的
细胞免疫应答的潜力。在免疫后，系统地和局部地检测到了非常高的特异于
Gag的CD8+T细胞的频度。这些结果进一步支持了利用重组的SeV载体作
为AIDS疫苗的可行性。
如上所述，可见在SeV/SIVgag接种的弥猴中，有效的SeV/SIVgag的表
达在鼻粘膜和弥猴的局部LN中是明显的。当将检测的gag RNA包括在基因
组RNA和mRNA中时，我们利用过去建立的系统不是检测SeV基因组N
RNA而只是检测SeV NmRNA，证实了该mRNA的表达(Kato，A.等人，2001
年，病毒学杂志，出版中)。gag RNA水平比SeV NmRNA水平更高，可能
是因为前者除了mRNA还含有基因组RNA。另一个解释是gag mRNA水平
期望比后者更高因为gag的位置在基因组中在N位点的上游(Nagai，Y.1999.
医学病毒学评述9卷：第83-99页)。
鼻内接种具有可以诱导粘膜免疫应答的优点。咽后LN和下颌下LN接
受了来自鼻腔的初生淋巴细胞流(Suen，J.Y.，和Stern，S.J.1996年《在头和
颈癌》第三版，E.N.Myers和J.Y.Suen，编辑者，W.B.Saunders公司，
Philadelaphia，第462-484页，颈的癌症)。这些LN很可能参与了粘膜免疫应
答。最近，已经表明，与鼻相关的淋巴组织(NALT)在小鼠的粘膜免疫应答中
有作用(Yangagita，M.等人，1999年，免疫学杂志162卷“3559-3565)。
分析从小鼠的对应于NALT的Waldeyer环制备的细胞，可以证实在该组织
中有SeV/SIVgag的表达和免疫应答。但是，在检测咽后LN和下颌下LN中
的SeV/SIVgag的表达时，在两种组织中都检测到了显著的gagRNA水平。
在这些LN中，由于缺乏SeV蛋白质加工所必需的蛋白酶，没有期望有SeV
的复制(Nagai，Y.1993年，微生物学趋势第1卷：81-87)。并且在LN中
的gag mRNA是从鼻腔流出SeV/SIVgag感染的淋巴细胞中得到的。利用鼻
内SeV/SIVgag接种，在局部LN以及鼻粘膜有效地表达抗原表明了SeV在
诱导粘膜免疫性中的潜力(Gallichan，W.S.，和Rosenthal，K.L.1996年，实验
方法杂志第184卷，1879-90)。
已经表明，细胞免疫应答在控制人和非人灵长类慢病毒如HIV-1和
SIV中起了重要作用(Ogg，G.S.等人，1998年《科学》279：第2103-2106
页；Rowland-Jones，S.L.等人，1998年《临床研究杂志》102卷：第1758
-1765页；Brander，C.，和Walker，B.D.1999年《现代免疫学评论》11卷：
第451-459页；Seder，R.A.，和Hill，A.V.S.2000年《自然》406：第793-798
页)。在弥猴AIDS模型中，利用体内的抗CD8的抗体，由于CD8+T细胞
减少已经表明了CD8+T细胞在控制初次和慢性感染中的重要性(Matano，T.
等人1998年《病毒学杂志》72卷：164-169；Schmitz，J.E.等人1999年
《科学》283卷：第857-860页；Jin，X.等人1999年《实验方法杂志》189：
第991-998页)。所以，诱导特异于病毒的CD8+T细胞应答在针对HIV-1
感染的保护中有很高价值。虽然并不总是与特异于抗原的细胞毒力活性相
关，但用针对细胞内细胞因子的诱导进行的流动细胞计数分析检测到的特异
于抗原的T细胞频率可以考虑为特异于抗原的细胞免疫应答的指标(Lavini，
A.等人1997年《实验方法杂志》186：第859-865页；Butz，E.A.，和Bevan，
M.J.1998年《免疫学》8：167-175；Murali--Krishna，K.等人1998年《免
疫学》8：177-187；Donahoe，S.M.等人2000年《病毒学》272卷：第347
-356页；Appay，V.等人2000年《实验方法杂志》192：63-75)。利用这一
技术，我们的研究表明SeV/SIVgag感染的细胞可以在体外刺激特异于Gag
的CD8+T细胞。另外，所有三种用SeV/SIVgag接种的弥猴检测到了在PBMC
中有高水平的特异于GagCD8+T细胞。在咽后LN中也观察到了有效地诱导
了特异于Gag的CD8+T细胞。这些结果表明SeV/SIVgag接种系统地和局
部地诱导了特异于Gag的细胞免疫应答。
在鼻内接种了SeV/SIVgag之后，没有猴子展现出可喜的临床症状。
SeV/SIVgag的表达主要定位于鼻粘膜和它的局部的LN中，它的表达水平在
接种后不到一星期达到峰值。这样的表达方式与天然宿主小鼠中的SeV的特
性是一致的。但是，在气管和肺中的抗原的小的表达表明病毒在弥猴中的传
播局限性更严。分析特异于抗原的IFN-γ的诱导显示在诱导后1星期很快出
现了特异于SeV的CD8+T细胞，表明控制SeV复制的细胞，免疫应答的
潜力。所以，SeV/SIVgag复制在弥猴中是定位的并且控制得很好。这些结
果支持了我们的系统在灵长类中是安全的观点。另外，可以构建利用非复制
活性的SeV的安全系统。
具体地说，本发明首先公开了在重组SeV介导的免疫后，弥猴中的初
级抗原表达和细胞免疫应答。我们的结果表明在所有鼻内免疫的弥猴中，不
仅有有效的抗原表达而且有效地诱导了特异于抗原的细胞免疫应答。局部地
并且控制很好的抗原表达方式支持了本载体在灵长类中是安全的。同时，本
研究指出SeV系统可以作为有前途的AIDS疫苗的工具。
本发明的目的是提供含有编码免疫缺陷病毒的病毒蛋白质的仙台病毒
载体的疫苗。本发明的疫苗可以很好地用作预防和治疗AIDS的疫苗。另外，
本发明的又一目的是提供给药本发明的疫苗的接种方法。具体地说，本发明
涉及：
(1)含有编码免疫缺陷病毒的病毒蛋白质的仙台病毒载体的疫苗；
(2)(1)中的疫苗，其中病毒蛋白质含有Gag蛋白质或它的一部分；
(3)(1)或(2)的疫苗，其中仙台病毒载体是缺损V基因的；
(4)接种的方法，该方法包括接种含有编码免疫缺陷病毒的病毒蛋白
质的仙台病毒载体的疫苗；
(5)(4)的方法，其中通过鼻内给药接种疫苗；
(6)(4)或(5)的方法，其中在多个疫苗的接种中本疫苗至少接种一次；
和
(7)诱导特异于免疫缺陷病毒的病毒蛋白质的细胞免疫应答的方法，
该方法包括步骤(a)在能够表现抗原的细胞中导入编码免疫缺陷病毒的病
毒蛋白质的仙台病毒载体和(b)将能够表现抗原的细胞与T辅助细胞和细胞
毒性T细胞接触。
本文所用的术语“疫苗”是指用于预防或治疗感染疾病的组合物。疫苗
含有抗体或者可以表达抗体，所以，它可以针对抗原诱导免疫应答。本发明
的疫苗含有仙台病毒载体，可以以需要的形式用于病原微生物的感染，传播
和流行的预防或治疗。
本文所用的术语“接种”是指通过接种疫苗在活体或培养系统中有活性
地产生免疫性(人免疫性，细胞免疫性，或两者)。这可以预防病原体的感染，
繁殖，传播和/或流行。这也可以阻止感染了病原体后病症的发作和/或发展。
本文所用的术语“抗体”指含有一个或多个表位并且可以通过刺激宿主
的免疫系统诱导特异于抗原的免疫应答的分子。免疫应答可以是肿瘤性的免
疫应答和/或细胞性的免疫应答。虽然3个到几个氨基酸可以构成表位，在蛋
白质中，一个表位通常含有约7到约15个氨基酸，例如8，9，10，12或14
个氨基酸。一个抗原称为免疫原。在本发明中，当编码抗原蛋白质的聚核苷
酸或载体用于表达抗原时，该聚核苷酸或载体定义为抗原。这可以用作疫苗
的组成。
本文所用的术语“免疫应答”或“免疫学应答”指针对抗原或疫苗的体
液免疫应答和/或细胞免疫应答。体液免疫应答指抗体分子介导的免疫应答。
细胞免疫应答指T淋巴细胞和/或其它白细胞介导的免疫应答。细胞免疫应
答包括CTL的产生，辅助T细胞的产生或活化，或诸如此类。通过检测活
化的T细胞如CD8+T细胞或其它白细胞产生的细胞因子或化学因子可以检
测细胞免疫应答。另外，这一细胞免疫应答可以通过已知的淋巴细胞增殖测
试，CTL测试，特异于抗原的T细胞测试或诸如此类来确定。
本文所用的术语“重组”指通过重组的聚核苷酸产生的化合物或组合物。
重组聚核苷酸是其中的核苷酸残基非天然结合的聚核苷酸。表达重组聚核苷
酸可以得到重组蛋白质。另外，“重组”病毒载体的定义是通过基因工程组
成重组聚核苷酸或它的扩增产物构建的病毒载体。
本文所用的术语“副粘病毒”定义为Paramyxoviridae家族的病毒。副
粘病毒包括，但不限于例如，仙台病毒，新城病病毒，流行性腮腺炎病毒，
麻疹病毒，呼吸多核(RS)病毒，牛伤寒病毒，温热病毒，猴副流感病毒(SVS)，
I型，II型和III型人副流感病毒等等。仙台病毒可以是野生型菌株，突变体
菌株，实验室传代菌株，人工构建的菌株等等。不完全的病毒如DI颗粒(病
毒学杂志，1994年，68卷：8413-8417页)合成的低聚核苷酸等等页可以用
作生产本发明的疫苗的物质。
编码副粘病毒的蛋白质的基因包括NP，P，M，F，HN，和L基因。本
文中，“NP，P，M，F，HN，和L基因”分别表示编码核壳蛋白质，磷蛋
白，基质蛋白质，融合蛋白质，血凝素-神经氨酸酶和大的蛋白质。副粘病
毒亚族的每个病毒的基因通常如下所述。通常，NP基因也可以表示为“N
基因”。
副粘病毒NP P/C/V M F HN-L
Rublavirus NP P/V M F HN(SH)L
麻疹病毒NP P/C/V M F H-L
仙台病毒的每个基因的核苷酸序列的数据库登记号分类成，例如副粘病
毒的呼吸病毒属中，对于NP基因分成M29343，M30203，M30204，M51331，
M5565，M69046，和X17218；对于P基因是M30202，M30203，M30204，
M55565，M69046，X00583，X17007，和X17008；对于M基因是-参见
12页-；对于F基因是-参见12页-；对于HN基因分成-参见12页-；
对于L基因分成-参见12页。
本文所用的术语“基因”定义为含有核酸如RNA，DNA等等的遗传物
质。基因可以是天然得到或人工设计的序列。本文利用的副粘病毒载体含有
编码免疫缺陷的病毒的完整的或一部分病毒蛋白质的外源基因。该外源基因
可以是天然的免疫缺陷病毒含有的基因或这个基因的片段。外源基因也可以
包括例如编码残余的，突变的，失活的或与另一个蛋白质融合的天然病毒蛋
白质的核酸。另外，本文的“DNA”包括单链DNA或双链DNA。
本文所用术语“免疫缺陷病毒”指在人或动物中引起免疫缺陷综合症的
病毒。免疫缺陷综合症指由于构成免疫系统的部分或一些细胞单位的缺乏或
功能失调破坏了正常的免疫机制的病理状态。免疫缺陷病毒致病伴随着主要
由CD4阳性T细胞代表的免疫感受态细胞的裂解。免疫缺陷病毒的例子特
别包括人免疫缺陷病毒(HIV)，猴免疫缺陷病毒(SIV)，等等，它们属于慢病
毒亚族。HIV引起人的获得性免疫缺陷综合症(AIDS)。HIV包括I型(HIV-I)
和II型(HIV-II)。本文中，免疫缺陷病毒包括HIV-1和HIV-2的所有菌株
和亚型。另外，本文中，免疫缺陷病毒包括SIV的所有菌株和亚型。许多菌
株包括SIVmac，SIVagm，SIVsm等等已知是已分离的SIV菌株。另外，还可
以用猫免疫缺陷病毒为例说明。
病毒蛋白质是指病毒中包含的蛋白质。病毒蛋白质包括结构蛋白质，调
节蛋白质和附属蛋白质。慢病毒的主要的结构蛋白质的例子包括Gag，Pol和
Env。慢病毒的主要的调节蛋白质的例子包括Tat和Rev。慢病毒的主要的附
属蛋白质的例子包括Vpu，Vpr，Vif，和Nef。在本发明中，优选利用的是编码
编码这些蛋白质的任何一个或一部分，或它们的混合的SeV载体。
本文所用的术语“裸露的DNA”是指没有用蛋白质包装的DNA。通常，
裸露的DNA是纯化的。术语“纯化”是指物质的纯度高于天然状态中物质
的纯度，优选地，物质作为所存在的样品中的成分占了主要的比例。DNA
可以用酚和/或氯仿萃取，乙醇沉淀，PEG沉淀，PEG/NaCl沉淀，等等，和
通过适当地结合已知的方法如电泳，氯化铯超滤，逆相柱层析，凝胶过滤，
HPLC，硅吸收等等来纯化。裸露的DNA包括线性的和环状的。例如，裸露
的DNA包括质粒，聚合酶链式反应(PCR)产物，和从病毒，细胞等等提取的
纯化的或原初的DNA。裸露的DNA可以制备成与缓冲液，盐，液体，蛋白
质等等复合的人工复合物。例如，它可以通过将它与转染剂如正离子脂等等
结合制备成组合物。用于本文的DNA疫苗是指含有裸露DNA作为成分的
疫苗。
本文所用的术语“仙台病毒载体”定义为从仙台病毒得到的并且用于将
基因转化到宿主细胞的载体。仙台病毒可以是核糖核蛋白(RNP)或具有感染
性的病毒颗粒。在本文中，“感染性”定义为重组仙台病毒载体通过它的细
胞附着和膜融合能力将载体支付含有的一个基因转化到载体附着的细胞中
的能力。本发明的仙台病毒载体以可表达的方式携带编码可以是抗原的免疫
缺陷病毒蛋白质的外源基因。仙台病毒载体可以具有与野生型载体一样的复
制能力或可以被基因突变减弱。另外，本发明的仙台病毒载体可以是没有复
制能力的有缺陷载体。在本文中，“复制能力”定义为病毒载体在感染了病
毒载体的宿主细胞中复制和生产感染性病毒颗粒的能力。
本发明提供了含有以可复制的方式携带编码免疫缺陷病毒蛋白质的外
源基因或该一部分该基因的仙台病毒载体的疫苗。这在仙台病毒编码的免疫
缺陷病毒蛋白质中是没有局限性的，只要蛋白质具有免疫原性。免疫缺陷病
毒的病毒蛋白质包括病毒的结构蛋白质，调节蛋白质和附属蛋白质。包括
HIV-1的慢病毒的主要的结构蛋白质的例子包括Gag，Pol，和Env。慢病毒
的主要的调节蛋白质的例子包括Tat和Rev。慢病毒的主要的附属蛋白质的
例子包括Vpu，Vpr，Vif，和Nef，这些蛋白质，它们的部分肽等等可用于疫苗
的生产。本疫苗可以通过构建表达上面提到的蛋白质或它们中的部分蛋白质
的仙台表达载体来生产。这些蛋白质可以单独或结合其中的两个或几个来利
用。在本发明中，特定地，利用表达免疫缺陷病毒的结构蛋白质的SeV是优
选的。具体地说，可以利用的是病毒全长Gag蛋白质，Gag-Pol融合蛋白质，
它们的片段等等的SeV。
本发明人表明已经用于在鼻内接种弥猴的重组SeV载体的基因表达在
接种后一星期内达到峰值，并且持续至少13天。另外，重复给药可以使表
达持久。这些特征在利用重组SeV载体的接种中，对于获得快速和持续的治
疗效果是有利的。
在对于人的临床应用中，从安全性等等出发，可以优选地利用SeV载
体。首先，在许多载体中，高效的基因转化中，转染的DNA必需进入核表
达外源基因，这是主要的障碍。但是，在仙台表达等等的情况中，外源基因
的表达是细胞质中的细胞微管蛋白和RNA聚合酶(L蛋白质)驱动的。这表明
SeV没有与宿主细胞的基因组相互作用。这避免了安全性问题如致瘤问题。
其次，在引起肺炎的啮齿类动物，但不是人中，SeV，已知是致病性的，这
得到了表明鼻内给药野生型SeV在非人灵长类中没有伤害的那些研究的支
持(Burwitz J.L.等人《疫苗》，1997年，第15卷，第533-540页)。这些
特征表明，当用于人是，SeV载体是非常安全的，并且这些特征页支持了仙
台病毒是目的在于接种后表达抗原蛋白质的一个有前途的载体替代物。事实
上，在本发明中的用SeV接种的灵长类，弥猴中检测到了明显的抗原的表达。
另外，接种SeV病毒本身没有表现出任何确定的病理症状，也没有观察到周
边CD4或CD8细胞的数目明显的减少。
本发明的疫苗抗原优选地用于特定地靶击AIDS病毒的接种。用另一句
话说，接种本发明的疫苗抗原应答针对没有缺陷病毒的免疫性和防止病毒的
感染和/或繁殖。本发明的疫苗优选地用于在感染没有缺陷病毒之前的预防和
在感染后的治疗。
用于接种的本发明的SeV载体不限于任何特定的种类。例如具有复制
能力并且能够自我繁殖的载体可以优选地被利用。通常，野生型SeV的基因
组含有短的3’引导区，接着是编码N(核壳)，P(磷)，M(基质)，F(融合)，
HN(血凝素-神经氨酸酶)和L(大)蛋白质的6个基因，并且在另一末端具有
短的5’非转录尾区。通过设计具有与上面所述的载体相似的结构的基因组可
以得到能够自我复制的载体。另外，通过在上面的载体的基因组中插入外源
基因可以获得表达外源基因的载体。与野生型病毒相比，SeV载体的病毒基
因的排列可能已经改变。
本发明的SeV载体可能缺损一些野生型SeV中含有的基因。例如，为
了构建SeV载体和为了表达这些基因，NP，P/C，和L基因编码的蛋白质被
认为是需要的，所以，这些基因必需是SeV载体中的活性态。但是，通过供
应反式的M，F，和HN蛋白质可以再构建SeV载体，并且从该载体表达基
因也是可能的。可以将携带表达这些蛋白质的基因的表达载体与编码载体基
因组的另一个表达载体共转染进入宿主细胞，再构建SeV载体。可替代地，
可以将编码病毒基因组的表达载体转染进入携带编码这些蛋白质的基因的
宿主细胞，所以利用宿主细胞提供的蛋白质可以再构建病毒载体。只要在核
酸转化中具有相当的或更高的活性，这些蛋白质的氨基酸序列可以不相同，
并且可以是突变的或用另一个病毒的同源基因的氨基酸替代。
当将SeV载体制备成RNP时，M，F，和HN基因编码的蛋白质，它们
被认为是SeV载体的细胞到细胞的繁殖所必需的，这时是不需要的。如果基
因M，F，和HN是RNP中含有的基因组的成分，当将RNP导入宿主细胞
时，产生了这些基因的产物，并且产生了具有感染性的病毒颗粒。产生感染
性病毒的RNP载体包括编码N，P，M，F，HN和L具有的病毒基因组RNA
和含有N，P，和L蛋白质的RNP。当将这样的RNP导入细胞时，通过这些
蛋白质的作用，病毒基因组得到了病毒和复制，所以感染性病毒载体得到了
扩增。
RNP可以与脂转染胺试剂，聚阳离子脂质体等等形成复合物导入细胞。
具体地说，可以利用各种转染试剂，例如DOTMA(Boehringer)，
Superfect(QIAGEN#301305)，DOTAP，DOPE，DOSPER(Boehringer
#1811169)。可以加入氯奎防止核内体的降解(Calos M.P.，美国科学院年报，
1983年，80卷，第3015页)。在复制性病毒的情况中，通过再感染进入培
养的细胞，鸡蛋，或动物(例如，哺乳动物如小鼠)可以扩增产生的病毒或将
它们传代。
相反，和用于本发明的疫苗中的那些载体一样，缺乏M，F，和/或HN
基因的SeV载体也是优选的。从外源提供缺少的基因产物就可以再构建这些
载体。这样的载体仍然与宿主细胞粘连，并且和野生型一样诱导细胞融合。
但是，子病毒颗粒没有与母病毒颗粒一样的感染性，因为导入细胞的这一载
体的基因组缺乏上面的这些基因。所以，这些载体可以用作只能转化单个基
因的安全病毒载体。基因组中缺乏的基因例如可以是F和/或HN基因。通过
将编码缺乏F基因的重组副粘病毒的基因组的表达质粒，F蛋白质的表达载
体，和NP，P/C和L蛋白质的表达载体共转染进入宿主细胞可以再构建病
毒载体(WO00/70055和WO00/70070)。可替代地，可以利用F基因整合进染
色体的宿主细胞。从外源提供的这些蛋白质的氨基酸序列可能与野生型的不
相同，并且只要它们提供相当的或更高的基因转化活性，可以是突变的或用
另一个病毒的同源蛋白质代替的。
本发明的SeV载体的包被蛋白质，超滤起源载体基因组的包被蛋白质
外，可以含有另一个蛋白质。这些蛋白质是不受限制的。可以包括前途病毒
的包被蛋白质，如水泡性口膜炎病毒的G蛋白质(VSV-G)。所以，构成本发
明的疫苗的SeV载体包括具有从不同于起源病毒的病毒得到的包被蛋白质
的假型病毒载体。
同时，用于本发明的疫苗的SeV载体在它的包被的表面可能具有一个
定位于特定的细胞的蛋白质，如粘连分子，配体和受体，在它的细胞外区含
有具有这些蛋白质的趋化蛋白质和在它的细胞外区具有起源于这一病毒包
被蛋白质的多肽。这一蛋白质能够将载体的生产靶击到特定的组织。这些蛋
白质可以是病毒基因组本身编码的，或通过病毒基因组以外(例如，另一个
表达载体或宿主细胞的染色体)的基因的表达，在病毒的再构建时间供应的。
为了减少针对SeV蛋白质的抗原性或增强RNA转录的效率或复制的效
率，可以改变用于本发明的疫苗的SeV载体中含有的病毒基因。具体地说，
至少改变复制因子基因NP，P/C，和L基因中的一个基因来增强转录或复制
是可能的。而改变具有血凝素活性和神经氨酸酶活性的结构蛋白质，HN蛋
白质，从而通过减弱前一种活性增强血液中病毒的稳定性和通过改变后一种
活性调节感染性也是可能的。同样，改变与膜融合相关的F蛋白质来调节与
膜融合的脂质体的融合能力也是可能的。另外，生产通过分析表现抗原的表
位和在细胞表面的可能的抗原分子的表位如F蛋白质和HN蛋白质，再进行
构建从而具有针对这些蛋白质的弱的抗原性的SeV也是可能的。
另外，缺少附属基因的SeV页可以用于本发明的疫苗。例如，当V基
因，SeV的一个附属基因敲出后，SeV对小鼠的致病能力大大降低，但没有
破坏这基因在培养的细胞中的表达和复制(Kato，A等人，1997年《病毒学杂
志》71卷：第7266-7272页；Kato，A等人，1997年《EMBO J.》第16
卷：第578-587页；Curran，J.等人，WO01/04272，EP1067179)。这样变
弱的载体作为构建本发明的疫苗的载体时是特别优选的。
用于本发明的疫苗的病毒载体用它的基因组RNA编码了免疫缺陷病毒
的病毒蛋白质或该蛋白质的一部分。通过在上面提到的SeV载体的基因组中
插入外源基因可以得到表达外源基因的重组的SeV载体。外源基因的例子包
括编码免疫缺陷病毒的病毒蛋白质或该蛋白质的一部分的基因片段。这样的
基因片段的例子包括编码免疫缺陷病毒蛋白质的天然存在的基因片段，以
及，编码经过缺少，替代，插入或诸如此类被修饰的天然蛋白质的基因，只
要该基因编码至少具有与天然蛋白质部分相当的抗原性的蛋白质。
包括HIV的免疫缺陷病毒的病毒蛋白质包括结构蛋白质，调节性蛋白
质，和附属蛋白质。慢病毒的主要的结构蛋白质的例子包括Gag，Pol，和Env。
慢病毒的主要的调节性蛋白质的例子包括Tat和Rev。慢病毒的主要的附属
蛋白质的例子包括Vpu，Vpr，Vif，个Nef。在本发明中，优选利用编码这些蛋
白质，它们的一部分，或它们的混合的SeV载体。
例如在HIV-1中，Gag表达成55千道尔顿的前体蛋白质，称为p55，
通过pol基因编码的蛋白质裂解产生MA(基质，p17)，CA(衣壳，p24)，
NC(核壳，p9)，和p6(Gottlinger，H.G.等人，美国科学院年报1989，第86
卷：第5781-5785页)。pol基因编码病毒蛋白酶(Pro)，整合酶(IN)，RNaseH，
和逆转录酶(RT)，并且首次表达成Gag-Pol融合蛋白质(Jacks，T.等人，《自
然》1988，331卷：第280-283页)。通过移码产生了Gag-Pol前体(p160)，
它在核糖体翻译时存在的频率约是5％。通过病毒编码的蛋白酶将Pol多肽
从Gag裂解出来，进一步裂解成蛋白酶(p10)，RT(p50)，RNaseH(p15)，和整
合酶(p31)。另外，不完全裂解的片段，如多肽(p65)，其中的RT蛋白质和
RNaseH是连接的，也同样存在。细胞的蛋白酶将Env(160千道尔顿，gp160)
裂解成gp41和gp120。在病毒感染中，gp120与CD4，存在于靶细胞表面的
一个受体，CCR5，一个共同受体，等等相互作用(Berger，E.A.等人，《免
疫学年报综述》1999，17卷：657-700)。另外，gp120具有可超变的区域，
V1-V5。根据分开的链，这些区域很不相同，其中，V3环区域影响病毒的
趋性(Hwang，S.S.等人《科学》1991年，253卷：第71-74页)。V3环是防
止HIV感染的中和性抗体的主要的靶(Goudsmit，J，等人《美国科学院年报
》1988年，85卷：第4478-4482页)。
Tat，病毒复制所必需的转录反式激活蛋白表达成具有互相不同长度的
多个肽(Ruben，S.等人《病毒学杂志》1989年，63卷：第1-8页)。Rev是
一个特异于约13千道尔顿序列的RNA结合蛋白质(Zapp，M.L.和Green，
M.R.，《自然》1989年，342：714-716页)，并且能够通过与Rev应答元素
(RRE)结合，调节病毒基因表达。除了这些基因，HIV-1还具有四个基因，
nef，vif，vpr，和vpu，它们编码附属蛋白质。HIV-2具有vpx而不是vpu。
为了表达全长的任何这些蛋白质，包括加工的和未加工的蛋白质，它们
的一部分，或它们的混合，我们构建了SeV载体。蛋白质的一部分的长度，
位点是不受限制的，只要这部分具有抗原的活性。例如，包括含有一个或多
个表位的部分肽。这样的部分肽通常至少含有病毒蛋白质的氨基酸序列中的
3到几个邻接的氨基酸。优选地，该肽含有约7到约15个氨基酸，例如，8，
9，10，12或14个病毒蛋白质的氨基酸序列中的氨基酸。
本疫苗至少利用了一个类型的免疫缺陷病毒的病毒蛋白质。本发明甚至
在只表达Gag抗原时也能够诱导有效的免疫诱导。另外，利用多个蛋白质类
型作为抗原，可以得到更有效的免疫性。
另外，除了从免疫缺陷病毒的一个病毒类型得到的病毒蛋白质用于本疫
苗，可以用从多个病毒类型得到的病毒蛋白质作为抗原，这时免疫能力针对
了更宽范围的菌株和亚型的免疫缺陷病毒。在利用多个免疫缺陷病毒类型作
为抗原的情况中，它们之间的联合是不受限制的。例如，利用从HIV-1，
HIV-2或SIV的各种分离的菌株种类得到的一个基因可以生产疫苗。在将
多个免疫缺陷病毒基因整合进不同的SeV载体基因组中构建SeV后，合并
或混合SeV可以生产疫苗。可替代地，将多个基因整合进同一SeV载体的
基因组可以表达这些基因。
例如，HIV-1包括所有主要(M)亚型，包括A到J，N和无关亚型(O)(Hu，
D.J.等人，JAMA 1996年，275卷：210-216页；Zhu，T.等人《自然》1998
年，5，391(6667)：594-7；Simon，F.等人，自然方法1998年，4(9)：1032
-7)。SIV的分离菌株的例子包括，SIVagm，SIVcpz，SIVmac，SIVmnd，SIVsnm，
SIVsyk，等等。
作为从中得到用于本发明的疫苗的病毒蛋白质的免疫缺陷病毒，具体
地，宿主是灵长类的免疫缺陷病毒是优选的。这样的病毒的例子包括HIV-
1，HIV-2，和SIV。
如果两个病毒的病毒蛋白质的氨基酸序列非常同源的话，将属于一种菌
株的一个类型的免疫缺陷病毒的蛋白质用作抗原接种非常可能得到一定程
度的针对另一种菌株或亚型的病毒的免疫性。
例如，为了构建表达免疫缺陷病毒的病毒蛋白质的SeV，可以将编码靶
免疫缺陷病毒的病毒蛋白质的基因插入编码SeV基因组的DNA(SeV载体
DNA)。在将外源基因插入SeV载体DNA的情况中，在转录末端序列(E)和
转录起始序列(S)之间需要插入含有六个核苷酸的序列(Calain P.和Roux L.，
《病毒学杂志》，1993年，67(8)，第4822-4830页)。外源基因可以插入
在各个SeV基因(NP，P，M，F，HN，和L基因)的上游和/或下游。为了不干扰
上游和下游的基因表达，将E-I-S序列(转录末端序列-干扰序列-转录
起始序列)或它的一部分适当地放置在外源基因的上游或下游，使得各个基
因之间都有E-I-S序列。可替代地，通过插入IRES页可以表达外源基因。
插入的基因的表达水平是可以由附着于这些基因的上游的转录起始序
列的类型调节的。也可以由插入的位点和围绕基因的序列调节。例如，在
SeV中，插入位点越靠近病毒基因组的负链RNA的3’末端(越靠近野生型病
毒基因组的基因排列中的NP基因)，插入基因的表达水平越高。为了达到外
源基因的高表达，优选地将外源基因插入在负链基因组的上游区如NP基因
的上游(负链的3’侧接序列)或插入在NP和P基因之间。相反，插入位点约
靠近负链RNA的5’末端(越靠近野生型病毒基因组的基因排列中的L基因)，
插入基因的表达水平越低。为了减少外源基因的表达，可以将它插入在负链
的最5’端位置，即野生型病毒基因组的L基因的下游(负链的L基因的5’侧
接区)或L基因的下游(负链的L基因的3’侧接区)。所以，为了得到需要的
外源基因表达水平，或使插入的基因与围绕它的病毒基因的结合最佳，可以
适当地调节外源基因的插入位置。例如，为了达到适当的效果，如果通过
高效价病毒载体导入的一个基因过度表达可能引起毒性，那么通过设计靠近
负链的5’末端的插入位点，或用低效的序列替代转录起始序列来控制病毒的
效价，和降低个别SeV载体的表达水平是可能的。
通常，因为只要细胞毒性不升高，抗原蛋白质高表达在免疫性的获得上
是有利的，所以，将编码抗原蛋白质的基因与高效的转录起始序列连接，并
且将该基因插入负链基因组的3’末端附近是优选的。优选的载体的例子包括
免疫缺陷的病毒的病毒蛋白质是副粘病毒载体的负链基因组中任何副粘病
毒的病毒蛋白质的3’侧编码的载体。例如，抗原基因插入在N基因的上游(负
链的3’侧)的载体是优选的。可替代的，抗原基因抗原插入在紧接N基因的
下游。
为了使外源基因的插入容易些，可以在插入位置设计一个克隆位点。例
如，克隆位点可以是限制酶的识别序列。可以利用病毒载体DNA的限制位
点插入外源基因。克隆位点可以是含有多个限制酶的识别序列的多克隆位
点。用于本发明的疫苗的载体可以含有用于上面所述的插入以外的位置中的
其它外源基因。这样的外源基因是不受限制的，但可能是参与免疫性的诱导
的细胞因子或趋化因子基因，或是其它种类的基因。
如下，例如根据已有论述的方法(Hasan，M.K.等人《遗传病毒学杂志
》78卷：2813-2820页，1997年；Yu D.等人，基因细胞，1997年，2，457
-466)，可以构建含有外源基因的重组仙台病毒载体。首先致病含有编码需
要的外源基因的cDNA序列的DNA样品。样品的浓度为25纳克/毫升或更
高，并且通过电泳检测到样品为单个质粒是优选的。下面的描述是外源基因
插入病毒基因组DNA的NotI位点的例子。如果cDNA序列含有NotI位点，
那么通过位点特异的诱变改变核苷酸序列可以如愿地预先除去这个位点，并
且同时保持了编码氨基酸序列。从DNA样品进行PCR扩增需要的DNA片
段。为了得到在两端都具有NotI位点的片段，并且在一个末端加上一个拷
贝的仙台病毒的转录终止序列(E)，干扰序列(I)，和转录起始序列(S)(EIS序
列)，合成了DNA引物对，具体地说，含有部分需要的基因的正向引物(有
意义链)，和含有NotI识别位点，E，I，和S序列的反向引物(反义链)的引
物对。
例如，正向的合成DNA序列在5’末端含有两个或更多核苷酸以保证用
NotI消化成功(优选地是不含有起源于NotI识别位点如GCG和GCC的序列
的4个核苷酸，更优选地是ACTT)。在这一序列的3’末端加入NotI识别序
列GCGGCCGC。另外，在3’末端加入9个核苷酸或9+6个核苷酸作为间
隔区。另外，在3’末端，加上对应于从起始密码ATG开头的需要的cDNA
的ORF的约25个核苷酸。优选地选择含有约25个需要的cDNA的核苷酸
的正向合成低聚DNA的3’末端，使最后的核苷酸是G或C。
反向的合成DNA序列在5’末端含有两个或更多核苷酸(优选地不含有
起源于NotI识别位点，如GCG和GCC的序列的4个核苷酸；更优选地是
ACTT)。在序列的3’末端加上NotI识别序列GCGGCCGC。另外，在3’末端，
加入一个间隔低聚DNA调节引物的长度。如下所述，将低聚DNA的长度
设计成使它成为含有NotI识别序列GCGGCCGC，与cDNA互补的序列，从
仙台病毒基因组得到的EIS序列的6核苷酸复合体(所谓的“6规则”；
Kolakofski D.等人《病毒学杂志》，1998年，72卷，第891-899页；Calain
P.和Roux L.，《病毒学杂志》，1993年，67卷：4822-4830)。另外，在加
上的序列的3’末端再加上与仙台病毒的S序列互补的序列，优选地
(5’-CTTTCACCCT-3’)(SEQ ID NO：1)，与I序列互补的序列，优选地5’-AAG
-3’，和与E序列互补的序列，优选地5’-TTTTTCTTACTACGG-3’(SEQ ID
NO：2)。最后，在3’末端加上选择的序列，使需要的cDNA的互补序列的最
后的核苷酸为G或C，其中最后的核苷酸约为终止密码子上游的25个核苷
酸。这样，制备了反向合成低聚DNA的3’末端。
通过普通的方法，例如利用ExTaq聚合酶(TaKaRa)可以进行PCR。优
选地利用Vent聚合酶(NEB)，用NotI消化扩增的DNA片段，插入质粒载体
pBluescriot的NotI位点。用自动DNA序列仪检测得到的PCR产物的核苷酸
序列。选择具有需要序列的质粒。通过NotI消化从质粒中切出插入的片段，
亚克隆进含有副粘病毒基因组cDNA的质粒中的NotI位点。可替代地，可
以直接将PCR产物克隆进后面的质粒的NotI位点得到重组的仙台病毒
cDNA。
例如，根据文献(Yu，D.等人《基因细胞》2卷：457-466，1997年；
Hasan M.K.等人，《遗传病毒学杂志》1997年，78卷：2813-2820)中的方
法可以构建重组仙台病毒基因组cDNA。例如，将含有NotI位点的18bp的
间隔序列(5’-CGGCCGCAGATCTTCACG-3’；SEQ ID NO：3)插入引导序
列和编码N蛋白质的序列的5’末端之间的克隆的仙台病毒基因组
cDNA(pSeV(+))的邻近的基因座位中，得到了含有起源于丁型肝炎病毒的抗
原链的可自我裂解的核糖体位点的质粒pSeV18+b(+)。将外源基因片段插入
pSeV18+b(+)的NotI位点，得到已经插入需要的外源基因的重组仙台病毒
cDNA。
在体外或细胞中转录重组的副粘病毒载体DNA，在存在L，P，和NP
蛋白质时再构建RNP，产生含有RNP的病毒载体。本发明提供了生产含有
副粘病毒载体的疫苗的方法，该副粘病毒编码免疫缺陷病毒的病毒蛋白质，
这一方法包括转录病毒的基因组DNA。本发明还提供了生产用作本发明的
疫苗的成分的副粘病毒载体的DNA，该DNA含有编码所述病毒的基因组的
DNA。本发明涉及编码本载体的基因组的DNA在用作本发明的疫苗成分的
副粘病毒载体的生产中的用途。构建已知的方法可以从病毒载体DNA再构
建病毒(WO97/16539；WO97/16538；Durbin A.P.等人，《病毒学》，1997年，
235卷：第323-332页；Whelan S.P.等人《美国自然科学进程》1995年，
92卷，第8388-8392页；Schnell M.J.等人《EMBO J》1994年，13卷，
第4195-4203页；Radecke F.等人，《EMBO J.》1995年，14卷，第5773
-5784页；Lawson N.D.等人，《美国自然科学进程》，1995年，92卷，
第4477-4481页；Garcin D.等人，《EMBO J.》，1995年，14卷，6087-
6094；Kato A.等人，《基因细胞》1996年，1卷，第569-579页；Baron M.D.
和Barrett T.，《病毒学杂志》，1997年，71卷，第1265-1271页；Bridgen A.
和Elliott R.M.，《美国科学院年报》1996年，93卷：第15400-15404页)。
这些方法能够从DNA再构建副粘病毒载体，包括副流感病毒，水泡性口膜
炎病毒，狂犬病病毒，麻疹病毒，牛瘟病毒，和仙台病毒载体。如果构建的
病毒载体DNA中缺少F，HN，和/或M基因，就不能形成感染性的病毒颗
粒。但是，将这些缺少的基因或编码来自另一个病毒的包被蛋白质的基因导
入宿主细胞并表达来生产感染性病毒颗粒是可能的。
将载体DNA导入细胞的方法可能包括(1)形成可以掺入需要的细胞
的DNA沉淀，(2)生成带正电的含有DNA的复合物，该复合物适于掺入
需要的细胞，并且细胞毒性低，和(3)利用电脉冲在需要的质膜上快速打
开一个足够大的孔让DNA通过。
在(1)中，可以利用各种转染试剂，例如DOTMA(Boehringer)，Superfect
(QIAGEN#301305)，DOTAP，DOPE，和DOSPER(Boehringer#1811169)。对于
方法(1)，可以利用磷酸钙转染。在这一方法中，细胞中掺入的DNA吸收进
了吞噬泡，但已知核中也吸收了足够量的DNA(Grahm F.L.和van Der Eb J.，《
病毒学》，1973年，52，456；Wigler M.和Silverstein S.，《细胞》，1977
年，11卷，223页)。陈和Okayama研究了最佳的转化技术，报告(1)在2
到4％的CO2，35℃，温育细胞和沉淀15到24小时，效率最大，(2)环状
DNA比线性DNA活性高，和(3)混合溶液中DNA浓度在20到30毫克/
毫升之间，形成的沉淀最佳(Chen C.和Okayama H.，《细胞分子生物学》，
1987年，7卷，第2745页)。方法(2)适用于瞬时转染。已经的更典型的转染
方法是，将DEAE-dextran(Sigma#D-9885 M.W.5×105)与DNA以需要的浓
度比例混合。因为大多数复合物在核内体中降解，可以加入氯喹增强转染的
效率(Calos M.P.，《美国科学院年报》，1983年，第80卷，3015)。方法(3)，
成为电穿孔，可以比方法(1)和(2)更广泛地应用，因为它可以用于任何种类
的细胞。将脉冲流的持续时间，脉冲的形式，电场的强度(电极之间的空隙，
和电压)，缓冲液的导电性，DNA浓度，和细胞密度最佳化，可以使转染效
率最大。
在上面这些方法中，方法(2)适用于在细胞中导入DNA，再构建载体，
因为它容易进行，并且利用大量的细胞能够测试大量的样品。优选地，利用
转染试剂如Superfect转染试剂(QIAGEN，#301305)或DOSPER脂质体转染试
剂(Boeringer Mannheim#1811169)。
从cDNA再构建的特定过程如下：
在24孔-6孔的塑料平板中，或在100毫米的石盘中，在含有10％的
胎牛血清(FCS)，和抗生素(100单位/毫升青霉素G和100毫克/毫升链霉素)
的最小基本培养基(MEM)中培养LLC-MK2，从猴肾得到的细胞系直到70
-80％融合。然后，例如用2pfu/细胞的已经在存在1毫克/毫升的补骨脂素
时，用20分钟的UV曝光失活的表达T7聚合酶的重组疫苗病毒vTF7-3
感染细胞(Fuerst T.R.等人《美国自然科学进程》，1986年，83卷：第8122
-8126页；Kato.A.等人，《基因细胞》1996年，1卷，第569-579页)。
将补骨脂素的量和UV曝光的时间最佳化。在感染后1小时，例如通过
Superfect(QIAGEN)脂转染，用2到60毫克，或更优选地3到5毫克的重组
仙台病毒cDNA以及病毒蛋白质的表达质粒(例如，24-0.5毫克的pGEM-N，
12-0.25毫克pGEM-P，和24-0.5毫克pGEM-L，或更优选地1毫克pGEM-N，
0.5毫克pGEM-P，和1毫克pGEM-L)转染细胞(Kato.A.等人，《基因细胞》，
1996年，1卷，第569-579页)，这些病毒蛋白质以反式起作用，并且是生
产全长的仙台病毒基因组所必需的。在无血清的，如果需要，含有100毫克
/毫升利福平(Sigma)，和更优选的浓度为40毫克/毫升的阿糖胞苷
(AraC)(Sigma)的MEM中培养转染的细胞，使得药物的浓度最佳，从而使疫
苗病毒的细胞毒性最小和病毒的回收率最大(Kato.A.等人，《基因细胞》，
1996年，第1卷：569-579)。在转染后培养细胞48到72小时，然后用三
个冻融循环收集和溶解细胞。将细胞溶解物转染进LLC-MK2细胞，在培
养3-7天后，收集培养基。为了再构建不能复制的缺乏编码包被蛋白质的
基因的病毒载体，可以将载体转染进表达包被蛋白质的LLC-MK2细胞，
或与包被蛋白质的表达质粒共转染。可替代地，可以在表达包被蛋白质的
LLC-MK2细胞上铺上转染的细胞并培养来繁殖缺损的病毒载体
(WO00/70055和WO0070070)。测量血凝素活性(HA)可以确定培养基的病毒
效价。用“内点稀释”可以确定HA(Kato.A.等人，《基因细胞》，1996年，
1卷，569-579；Yonemitsu Y.和Kaneda Y.，传递日本脂质体介导的基因到微
管细胞的凝血病毒，微管疾病的分子生物学，分子医药方法，Baker A.H.编
辑，Humana出版，1999年，295-306页)。通过在将得到的尿囊样品适当
稀释(例如106倍)，并除去vTF7-3后，在鸡蛋中再扩增可以除去疫苗病毒
vTF7-3中可能的污染。再扩增例如可以重复3倍或更多倍。得到的病毒可以
储藏在-80℃。
宿主细胞不限制于任何特定的细胞类型，只要病毒载体可以在该细胞中
再构建。宿主细胞可以包括LLC-MK2细胞，从猴肾得到的CV-1细胞，
培养的细胞系如从仓鼠肾得到的BHK细胞，和人起源的细胞。为了获得大
量的仙台病毒载体，可以用从上面的宿主细胞得到的病毒载体感染已成胚胎
的鸡蛋，并扩增载体。用鸡蛋生产病毒载体的方法是已确立的(神经科学研
究III的先进方法，神经科学分子生理学，Nakanishi等人编辑，Kouseisha，
Osaka，1993年，第153-172页)。具体地说，例如将冷冻的鸡蛋在温育器中，
在37-38℃，温育9到12天直到长胚胎。将病毒载体接种进尿囊腔，继续
温育鸡蛋几天繁殖载体。培养条件，如温育的持续时间可以根据所用的重组
仙台病毒的类型而变化。然后，回收含有病毒的尿囊液。根据标准方法，从
尿囊样品中分离和纯化仙台病毒载体(Tashiro M.，病毒实验方案，Nagai和
Ishihama编辑，医药观察，1995年，第68-73页)。
例如，可以如下构建和制备缺乏F蛋白质的仙台病毒载体(WO00/7005
和WO00/70070)。
(1)构建缺乏F基因的仙台病毒基因组cDNA和F基因的表达质粒
用SphI和KpnI消化全长的仙台病毒(SeV)基因组cDNA，
pSeV18+b(+)(Hasan M.K.等人，《遗传病毒学杂志》，1997年，78卷，2813
-2820页)(pSeV18+b(+)也称为pSeV18(+)，回收得到的片段(1473bp)，克隆
进pUC18得到pUC18/KS。利用pUC18/KS构建缺乏F基因的区域。通过
PCR连接删除F基因，在得到的缺损F基因的SeV基因组cDNA(pSeV18+/DF)
中用序列5’-atgcatgccggcagatga(SEQ ID NO：4)替代F基因的ORF(从ATG到
TGA，1698bp)。用EcoT22I消化用引物(正向：5’-gttgagtactgcaagagc/SEQ ID
NO：5；反向：5’-tttgccggcatgcatgtttcccaaggggagagttttgcaacc/SEQ ID NO：6)得到
的PCR产物和具有引物(正向：5’-atgcatgccggcagatga/SEQ ID NO：7；反向：5’
-tgggtgaatgagagaatcagc/SEQ ID NO：8)的PCR产物，然后分别克隆在F基因
的上游和下游。用SacI和SalI消化得到的质粒，回收含有F基因缺损位点
的片段(4931bp)，克隆进pUC18得到pUC18/dFSS。用DraIII消化pUC18/dFSS，
用含有F基因的pSeV18+的DraIII片段替代回收的片段，连接得到
pSeV18/DF。在pUC18/dFSS的F基因缺损位点中的NsiI或NgoMIV位点可
以插入外源基因。为此，可以用NsiI尾的引物或NgoMIV尾的引物扩增含
有外源基因的片段。
(2)制备辅助细胞诱导SeV-F蛋白质的表达
如下构建仙台病毒F基因(SeV-F)的Cre/loxP可诱导表达质粒。通过PCR
扩增SeV-F基因，克隆进pCALNdLw质粒的唯一的SwaI位点(Arai等人，
《病毒学杂志》，1998年，第72卷，第1115-1121页)，这一质粒被设计
成通过Cre DNA重组酶的作用诱导基因产物的表达的，这样得到了
pCALNdLw/F。
为了从缺损F基因的基因组得到感染性病毒颗粒，建立了一个病毒
SeV-F蛋白质的辅助细胞系。这里利用的是从弥猴肾得到的，通常用于SeV
繁殖的LLC-MK2细胞。在72℃，5％的CO2，在含有10％的热失活和固
定化胎牛血清(FBS)，50单位/毫升的青霉素G钠，和50毫克/毫升的链霉素
的MEM中培养LLC-MK2细胞。下温育24小时。由于SeV-F基因产物有
细胞毒性，将该基因克隆进pCALNdLw，在这一质粒中，Cre DNA重组酶可
以诱导克隆基因的表达。根据标准方法，通过磷酸钙方法(哺乳动物转染试
剂盒(Stratagene))，用上面的pCALNdLw/F转染LLC-MK2细胞。
在10厘米的平板中培养LLC-MK2细胞直到40％融合，用10毫克
pCALNdLw/F转染这些细胞，在10毫升含有10％FBS，在37℃和5％的CO2
下温育24小时。然后，分散细胞，再悬浮于10毫升的培养基中，铺到5个
10厘米的盘上，其中在一个盘上铺5毫升细胞悬浮液，2个上铺2毫升，两
个上铺0.2毫升。在10毫升含有10％FBS和1200毫克/毫升
G418(GIBCO-BRL)的MEM中培养14天，每两天更换培养基，选择稳定的
转染体。用克隆环收取抗G418的培养基上生长的细胞。继续培养每个菌落
的细胞，直到它们在10厘米的盘中100％融合。
为了诱导F蛋白质的表达，在6厘米的盘中生长细胞到100％融合，根
据Saito等人的方法(Saito等人，《核酸综述》，1995年，23卷，第3816
-3821页；Arai T.等人《病毒学杂志》，1998年，72卷，第1115-1121
页)，用moi＝3的AxCANCre腺病毒感染。
(3)再构建并繁殖缺损F基因的SeV病毒
如下，将已经插入外源基因的pSeV18+/DF转染进LLC-MK2细胞。
在100毫米的石盘上，以5×106个细胞/盘铺上细胞，培养24小时，融合在
室温下，用表达T7RNA聚合酶补骨脂素和20分钟的长UV(365nm)处理的
重组疫苗表达感染1小时(Furest T.R.等人，《美国自然科学进程》，1986
年，第83卷，第8122-8126页)(moi＝2-3；优选地moi＝2)。用装备了5个15
瓦的灯泡的UV Stratakinker 2400(目录号400676(100V)，Stratagene，La Jolla，
CA，USA)继续UV曝光。在洗涤细胞三次后，用OptiMEM(GIBCO)以12毫
克/盘，4毫克/盘，2毫克/盘，和4毫克/盘分别再悬浮质粒pSeV18+/DF-GFP，
pGEM/NP，pEGM/P，和pGEM/L(Kato A.等人，《基因细胞》，1996年，1
卷，第569-579页)，并与SuperFect转染试剂(1毫克DNA用5毫升
SuperFect(QIAGEN))混合。在室温下温育混合物10分钟，用3毫升含有最
后浓度为3％的FBS的OptiMEM再悬浮，加到细胞中。在温育器中培养3
小时后，用无血清的MEM洗涤细胞2次，继续在含有40毫克/毫升阿糖胞
苷(AraC，Sigma)，和7.5毫克/毫升的胰蛋白胨(GIBCO)的MEM中培养70小
时。然后，收集细胞，并以107个细胞/毫升将细胞再悬浮于OptiMEM中。
冻融细胞3次，然后以脂转染试剂DOSPER(Boehringer mannheim)混合(每
25毫升DOSPER中106个细胞)，在室温下温育15分钟，转染进例如LLC
-MK2/F7细胞(在12孔的平板中106个细胞/孔)，这种细胞是上面选择的一
个表达基因的辅助细胞系。在含有40毫克/毫升的Arac和7.5毫克/毫升的胰
蛋白胨的无血清MEM中培养细胞，收集细胞上清液。重复稀释得到的上清
液，用上清液感染LLC-MK2F7细胞，回收上清液的过程几次可以除去疫
苗病毒中可能的污染。
在制备缺损的病毒载体时，可以将缺失不同包被基因的两个不同的病毒
载体转染进相同的细胞。在这种情况下，通过从其它载体表达提供每个缺失
的包被蛋白质，这样的相互补充允许产生可以复制和繁殖的感染性病毒颗
粒。所以，可以在相互补充的混合过程中同时接种两个或更多病毒载体，从
而低价并大规模地生产各个缺失包被的病毒载体的混合物。因为，这些缺失
包被基因的病毒的基因组更小，它们允许插入长的外源基因。另外，对于这
些本身非感染性的病毒，在细胞外稀释后保持共感染状态是困难，所以将它
们杀菌，对环境害处较小。
为了使回收的副粘病毒基本上纯净，可以进行纯化。用已知的纯化和分
离方法，包括过滤，离心，柱层析纯化，等等或这些的混合进行纯化。本文
所用的术语“基本上纯净”指分离到的物质，例如化合物，多肽，病毒等等
作为物质存在的样品中的成分在样品中占了主要的比例。典型地，样品中存
在的基本纯净的成分占了含有其它成分的整个样品的50％或更多，优选地
70％或更多，更优选地80％或更多，更优选地90％或更多。用本领域技术
人员已知的方法，例如重量比重量的比例(w/w)可以计算这一比例。计算比
例时必需除去溶剂，盐，加入的化合物等等。具体地说，例如用纤维素硫酸
酯或交联的多糖硫酸酯的方法(已审查的日本专利申请公开号(JP-B)：
Sho62-30752；JP-B Sho 62-33879；JP-B Sho 62-30753)。在这一方法中，病毒被
含有硫酸的多糖和/或它的降解产物吸收(WO 97/32010)，等等方法可以纯化
副粘病毒。
可以将回收的SeV载体用作活的重组疫苗。本文中，活疫苗被定义为
能够扩增载体基因组，表达抗原抗体，和在用病毒载体单个给药的个体的细
胞中获得免疫性的组合物。因为，如实施例中所示，利用SeV载体接种优选
地在弥猴中诱导了免疫性，并且没有表现出明显的临床症状，所以抗原优选
地利用SeV载体。对于这样的活疫苗接种的受试者是没有限制的，受试者的
例子包括抗原用免疫缺陷病毒感染的所有动物，例如人，猴，猫，狗，猪，
马，牛等等。另外，利用上面提到的缺乏传播能力的SeV载体，可以生产载
体不传播的活疫苗。
另外，在表达蛋白质掺入SeV颗粒的情况中，可以利用SeV载体作为
失活的整个颗粒疫苗。可替代地，在表达蛋白质掺入SeV颗粒的情况中，从
已经导入SeV载体的细胞或从SeV载体分离和纯化的已表达免疫缺陷病毒
蛋白质可以用作疫苗。从SeV载体纯化免疫缺陷病毒蛋白质比利用例如表达
载体或诸如此类从整个细胞溶菌物分离细胞中表达的免疫缺陷病毒蛋白质
要容易得多，因为SeV载体含有的蛋白质种类有限。已知的分离技术可以用
于蛋白质的纯化，例如利用针对免疫缺陷病毒蛋白质的抗体，该蛋白质可以
提供免疫亲和柱层析来纯化。人们期望，与活疫苗和失活疫苗相比，用纯化
的蛋白质作为疫苗可以在接种后抑制发烧和局部反应的频率。
如果需要，含有SeV载体的疫苗可以与符合需要的药物学可接受载体，
媒介结合。在本文中，“药物学可接受载体”定义为可以与载体一起给药，
但没有明显抑制载体的基因转化的那些物质。例如，可以用盐，硫酸缓冲盐
(PBS)等等适当地稀释SeV载体制成组合物。如果在鸡蛋中繁殖SeV载体，
组合物可以含有尿囊液。同样，含有SeV载体的疫苗组合物可以含有如去离
子水或5％的葡聚糖水溶液这样的载体。它还可以进一步含有稳定剂，抗生
素等等。另外，可以加入防腐剂和其它添加剂。为了提高免疫原性，可以加
入免疫催速剂如细胞因子，霍乱毒素，伤寒毒素等等。另外佐剂如矾，不完
全佛氏佐剂，MF59(油乳剂)，MTP-PE(从分枝杆菌细胞壁得到的胞壁酰三
肽)，和QS-21(从soapbark树Quilaja saponaria得到)可以与疫苗结合。
利用本发明的疫苗接种可以预防免疫缺陷病毒感染和/或在感染后除去
病毒或抑制病毒的繁殖。另外，它可以用于繁殖免疫缺陷综合症的发作，或
在发作后进行治疗。它也可以在免疫缺陷病毒感染模型中用于预防或用于开
发或评估治疗的方法。
本发明的疫苗可以用足够剂量给药，使有效量的载体可以转化到靶组织
的细胞中。本文中，“有限量”定义为能够将基因导入靶组织的细胞以致至
少产生部分需要的免疫应答的剂量。给药有效量的含有需要基因的SeV载体
能够转染细胞，产生基因产物。优选地，给药含有需要基因的有效量的SeV
允许检测到转染基因在给药组织或血液中明显的表达水平。“明显水平”定
义为转染基因的表达(转录物或翻译产物的量)是可检测的水平。但是，转染
基因的表达水平必需考虑它的有效水平和毒性水平而决定。
通过本领域的技术人员已知的测试方法可以确定转染进细胞的基因的
表达水平。用Northern杂交，RT-PCR，RNA保护测试等等可以检测和定
量转录物。可以在原位用Northern杂交，RT-PCR等等检测。为了检测翻
译产物，用抗体的Western影印，免疫沉淀，RIA，ELISA，pull down测试
方法等等是可以利用的。为了容易地检测转染的基因产物，可以标记待表达
的蛋白质，或在载体中包含一个报告基因。报告基因可以是编码β-半乳糖
苷酶，CA，碱性磷酸酶，或GFP的基因，但不限制于这些。
通过检测可以或免疫细胞可以检测免疫应答。例如，通过各种已知的测
试方法，如测试与各种表达蛋白质的结合(ELISA测试，Western影印，等等)，
检测对合胞体的形成的抑制，互补固定，依赖抗体的细胞介导的细胞毒性
(ADCC)能力，对感染或细胞融合的中和能力，对CD4和gp120之间的相互
作用的抑制等等，测试对免疫缺陷病毒在体液中的免疫应答。
通过例如测试特异于抗原的CTL活性，CTL的产生，辅助性T细胞的
产生和活性等等抗原检测细胞的免疫应答。另外，通过检测激活的T细胞，
如CD8+T细胞，或其它白细胞产生的细胞因子或趋化因子抗原同样可以检
测细胞的免疫应答。还有，通过已知的淋巴细胞增殖测试，CTL测试，特异
于抗原的T细胞测试等等也可以检测。
用于给药的载体的剂量可以根据疾病，体重，年龄，性别，症状，给药
的目的，疫苗的形式和给药方法等等而变化，但这可以由本领域的技术人员
适当地确定。疫苗中包含的载体的剂量优选地可以在约105pfu/毫升到
1011pfu/毫升的范围内，优选地在约107pfu/毫升到109pfu/毫升，但最优选地，
本载体是在约1×108pfu/毫升到5×108pfu/毫升内，与药物学可接受载体一
起给药。疫苗可以在皮内，皮下，鼻内，跨支气管，肌肉内，静脉内或口服
接种。例如，疫苗接种到上呼吸道的附近，具体地，接种到鼻内粘膜和上呼
吸道可以诱导粘膜免疫性。为了达到目的，在鼻内喷洒等等接种SeV疫苗是
有效的。页可以鼻内给药，例如用导管介导的给药。另外，可以将已经导入
SeV的细胞作为疫苗接种。另外，用SeV感染从待接种疫苗的个体得到的细
胞，然后，通过来自体内的给药进行接种。
另外，不仅单剂量给药，而且例如双倍或多倍剂量的给药在诱导足够的
免疫性时也是有效的。在人的情况中，多个剂量的给药的间隔通常是2到4
星期。
在多个剂量的给药中，可以多次给药含有SeV的本发明的疫苗，但利
用SeV疫苗和其它疫苗的结合体也是优选的。如上所述，基于病毒载体的疫
苗方案的一个缺点是诱导了针对载体病毒起源的抗原而不是靶抗原的强烈
免疫应答。
利用两个或更多不同种类的病毒载体分别引导和加强抗原解决这一问
题。所以，如上所述，在基于DNA疫苗的引导之后进行基于病毒载体的加
强也是上策。另外，再接种相同的重组病毒对于加强特异于抗原的应答可能
是不够的。所以，用SeV载体引导并用不同的病毒载体或DNA疫苗加强也
是可行的。除此之外，用重组SeV载体表达多个抗原可以提高保护效率。
所以，在利用不同种类的疫苗的引导-加强方案中，与SeV疫苗结合
的疫苗是不受限制的，可以利用符合需要的疫苗。例子包括重组的亚单位疫
苗，基于SeV以外的病毒的活重组疫苗或微生物，失活的免疫缺陷病毒的整
个颗粒，免疫缺陷病毒的假病毒体或类病毒颗粒，肽疫苗，减弱的免疫缺陷
病毒的活疫苗，DNA疫苗，等等，但不限于这些。亚单位疫苗定义为没有
从靶没有缺陷病毒得到的所有抗原和含有一个或更多选定蛋白质抗原的疫
苗。这样的疫苗至少是从病毒的其它成分或感染细胞得到的成分中部分地分
离的。通过至少部分地纯化免疫缺陷病毒蛋白质可以制备亚单位疫苗。另外，
利用重组来生产或通过合成可以生产亚单位疫苗。用作活重组疫苗的基本成
分的病毒或微生物的例子包括痘病毒，腺病毒，伤寒病毒，脊髓灰质炎病毒，
分枝杆菌，流感病毒，Semliki森林病毒，等等，但不限于这些。将本发明
的疫苗与复制能力在替代了env基因后受限制的限制复制病毒结合后作为免
疫缺陷病毒可以进行加强免疫(Matano，T.等人，2000年，《疫苗》，第18
卷：3310-3318)。在SeV疫苗和其它疫苗的接种顺序上是不限制的。在接
种SeV疫苗后，可以接种其它疫苗，相反也行。
例如，在用DNA疫苗引导后，用SeV疫苗加强。这样的接种是一个方
法，包括步骤：(a)给药DNA疫苗，然后(b)给药编码免疫缺陷病毒的
病毒蛋白质的副粘病毒。可以利用编码例如免疫缺陷病毒基因组的DNA作
为DNA疫苗。可以例如通过肌肉内给药和/或基因枪给药接种DNA疫苗。
在接种DNA疫苗几次后，例如接种基于本发明的SeV疫苗。接种的间隔通
常是几天到几星期。
可以接种疫苗的动物的例子包括具有疫苗系统并且可以用免疫缺陷病
毒感染的所有宿主，包括所有的哺乳动物，等等，包括人，猴，小鼠，大鼠，
兔，羊，猪，牛，马，鸟等等。本发明的疫苗优选接种的动物的例子包括灵
长类。可以进行本发明的疫苗的接种的灵长类的例子除了人(非人灵长类)包
括原猴，如狐猴，loris，tarsier等等；类人猿如platyrrhini和catarrhini；和apes
如gibbbon，猩猩，gorilla，黑猩猩，bonobo，等等。狭鼻类的例子包括，特
别是弥猴，具体地，弥猴属包括日本弥猴，食蟹弥猴，恒河弥猴，bonnet猴，
猪尾弥猴，棕桩尾弥猴，阿萨姆猴等等。对非人灵长类接种疫苗特别适用于
为了对人临床应用的AIDS疫苗的开发和评估。
含有编码免疫缺陷病毒的病毒蛋白质的SeV载体的疫苗可以局部地或
系统地引导宿主的免疫应答。特定地，导入本载体的细胞的作用是作为特异
于抗原的免疫应答的刺激细胞并诱导细胞的免疫诱导。本发明提供了特异于
免疫缺陷病毒的病毒蛋白质的细胞免疫诱导，该方法包括步骤：(a)在表现抗
原的细胞中导入编码免疫缺陷病毒的病毒蛋白质的仙台病毒载体和(b)将表
现抗原的细胞与T辅助细胞和有细胞毒性的T细胞接触。本文中，“接触”
一个细胞页包括允许细胞相互接触。用其它话说，这包括让细胞相互接触，
例如，在血液中注射载体导入的细胞(在活体中能够接触T辅助细胞和有细
胞毒性的T细胞的细胞)；在相同培养基中共培养载体导入的细胞，T辅助
细胞，和有细胞毒性的细胞；等等。另外，特异于抗原的“细胞免疫应答的
诱导”指至少部分诱导了细胞的免疫应答。例如，指刺激了特异于抗原的
CTL，增强另外CTL的频率和活性(例如，细胞毒性)，等等。
抗原提呈细胞指细胞上出现I类主要组织相容复合物(MHC)或II类
MHC，并且具有将抗原蛋白质的肽结合到每个细胞上的能力的细胞。出现抗
原细胞的例子包括树突细胞(DC)。I类MHC分子是结合抗原肽并且将使它
出现在细胞毒性T细胞(CD8+)上的分子。II类MHC分子是结合抗原肽并且
使它出现在有细胞毒性的T细胞(CD4+)上的分子。T辅助细胞是指T细胞家
族的一个组，是通过II类MHC分子识别出现的抗原并且识别一连串的免疫
应答的细胞。有细胞毒性的T细胞也指T细胞家族的一个组，是通过I类
MHC分子识别出现的抗原和杀死如感染病毒的细胞，癌症细胞，嫁接细胞
等等的细胞(Xu M等人，《生物技术趋势》18(4)：167-72，2000)。
例如，通过在制备血液单核细胞(PBMC)等等中等人编码免疫缺陷病毒
的病毒蛋白质的SeV载体，或在体外与PBMC共培养，抗原应答免疫应答
如免疫缺陷病毒诱导特异于病毒蛋白质的CTL中产生IFM(N？)-γ和繁殖。
另外，体内给药能够在宿主中诱导特异于抗原的细胞免疫应答。
通过测试IFN-γ的量和测量CD8+IFN-γ+T细胞的频度可以证明细
胞免疫应答。另外，利用如这样的靶，即表达免疫缺陷病毒的病毒蛋白质的
细胞和通过测量靶细胞的溶解也可以测量CTL的活性。通过等人上面提到
的SeV载体可以制备这样的靶细胞。例如，在自身Herpesvirus papio无限增
殖的B淋巴细胞系(BLC)或诸如此类中导入表现免疫缺陷病毒的病毒蛋白质
的SeV。将细胞与预期含有CTL的样品一起温育，利用51Cr释放等等作为
指标可以测量BLC的溶解程度。另外，无限增殖的细胞系H9(从人T细胞
得到的)等等也可以作为例证。
本发明涉及编码免疫缺陷病毒的病毒蛋白质的SeV载体或本载体导入
的细胞在诱导或检测特异于免疫缺陷病毒的病毒蛋白质的细胞免疫应答中
的用途。另外，本发明还涉及特异于免疫缺陷病毒的病毒蛋白质的细胞免疫
应答的刺激细胞，含有导入编码免疫缺陷病毒的病毒蛋白质的SeV载体的细
胞的刺激细胞。本发明涉及特异于免疫缺陷病毒的病毒蛋白质的细胞免疫应
答的靶细胞，含有导入编码免疫缺陷病毒的病毒蛋白质的SeV载体的细胞的
靶细胞。另外，本发明还涉及编码免疫缺陷病毒的病毒蛋白质的SeV载体在
表达刺激细胞或靶细胞中的免疫缺陷病毒的病毒蛋白质中的用途。
SeV载体编码的免疫缺陷病毒的病毒蛋白质是没有限制的。如上所示，
它们可以是病毒结构蛋白质，调节蛋白质，附属蛋白质等等。结构蛋白质的
例子包括Gag，Pol，Env，等等。例如，利用编码免疫缺陷病毒的Gag蛋白质
的SeV，可以诱导特异于Gag的细胞免疫应答。
实施本发明的最好方式
下面，参考实施例详细地举例说明本发明，但本发明没有局限于这些实
施例。本文引证的所有参考文献引入作为参考。
[实施例1]采集SeV/SIVgag
利用SeV的安全的敲出V的版本(V[-]SeV)(Kato，A.等人，1997年，《
病毒学杂志》，71卷：第7266-7272页；Kato，A.等人，1997年，《EMBO
J.》16卷：第578-587页)，我们构建了表达SIV Gag的重组的SeV载体，
SeV/SIVgag。通过重组技术敲出SeV中的附属基因，V基因明显地减弱了
SeV对小鼠的致病性，但没有扰乱培养细胞中病毒基因的表达。过去，含有
全长的减弱的缺失V基因的SeV基因组cDNA的质粒pSeV(+)18bV(-)得到
过描述(Kato，A.等人1996年，《基因细胞》1卷：第569-579页；Hasan，M.K.
等人，1997年《遗传病毒学杂志》78卷：第2813-2820页)。通过PCR扩
展制备了编码SIVmac239 Gag的基因片段(核苷酸1306-2845[基因库登记
号：M33262](Kestler，H.等人，1990年《科学》第248卷：第1109-1112
页))，并将它导入pSeV(+)18bV(-)中，得到pSeV(+)18bV(-)/SIVgag。用于PCR
的引物时5’-AAG CGG CCG CGA GAT GGG CGT GAG AAA CTC CG-
3’(SEQ ID NO：9)和5’-TTG CGG CCG CGA TGA ACT TTC ACC CTA AGT
TTT TCT TAC TGT GAC TAC TGG TCT CCT CCAAAG-3’(SEQ ID NO：10)。
将gag基因片段插入pSeV(+)18bV(-)中紧接N编码区的上游的NotI位点中
(图1A)。在T7RNA聚合酶的作用下，这一质粒pSeV(+)18bV(-)/SIVgag产
生了全长的SeV/SIVgag的反基因组RNA。如参考文献(Kato，A.等人，1996
年，《基因细胞》1卷：第569-579页)所述，从pSeV(+)18bV(-)/SIVgag
回收重组的SeV，SeV/SIVgag。具体地说，将表达T7RNA聚合酶的重组痘苗
病毒(VV)，vTF7-3(Fuerst，T.R.等人，1986年《美国科学院年报》，83卷：
8122-8126)和pSeV(+)18bV(-)/SIVgag感染的LLCMK2细胞，pGEM-N，
pGEM-P和pGEM-L(Garcin，D.等人，1995年，《EMBO J.》14卷：6087-
6094)共转染。在转染后40小时时，收集细胞，并将它们注射进鸡蛋的尿囊
腔。在2轮传代后，收集尿囊液，用作SeV/SIVgag。同样，从pSeV(+)18bV(-)
得到对照SeV，SeV/对照。如文献(Kiyotani，K.等人，1990年《病毒学》177：
第65-74页)所述，用抗SeV抗体免疫染色，测试CV1细胞上SeV的效价
(CIU[细胞感染单位]/毫升)。
[实施例2]用SeV/SIVgag在体外表达SIV Gag
根据标准的转染方法(参见实施例1)，从质粒，pSeV(+)18bV(-)/SIVgag
重新得到感染性的SeV/SIVgag。用这一SeV/SIVgag感染细胞，如下分析表
达的蛋白质。为了收获细胞溶解物，在6孔的平板中，以每孔4×105个细胞
的密度播种CV-1细胞，生长过夜，然后以m.o.i.为5，用SeV/对照或
SeV/SIVgag感染。1天后，用600微升的溶解缓冲液(50mMTris-HCl，pH8.0，
150mMNaCl，0.02％叠氮化钠，0.1％十二烷基硫酸钠，0.5％脱氧胆酸钠，
0.1mg/ml苯甲基磺酰氯，1％Triton X-100)溶解细胞。在各个道中加载10
微升的细胞溶解物。如文献所述(Matano，T.等人，1993年《病毒学杂志》67
卷：2026-2033页)进行利用单克隆小鼠抗p27抗体的Western影印分析。
如文献所述(Matano，T.等人，1993年《病毒学杂志》67卷：2026-2033页)
利用抗p27的抗体和与荧光素结合的山羊抗小鼠免疫球蛋白G(IgG)，进行免
疫染色。用Western影印以及利用单克隆抗SIV Gagp27抗体的免疫染色(图
1B和图1C)证明在SeV/SIVgag感染的CV1细胞中出现了未加工的SIV Gag，
p55。与SeV/对照相比，这一重组病毒表现出稍微慢的增殖动力学(图1D)。
这一滞后的增殖可能时由于基因组的长度增加了(SeV/对照，15.4kb；
SeV/SIVgag，17.0kb)(Yu，D.等人，1997年《基因细胞》2卷：第457-466
页；Hasan，M.K.等人，1997年《遗传病毒学杂志》78卷：第2813-2820
页；Sakai，Y.等人，1999年《FEBS通讯》456卷：第221-226页)。
[实施例3]用SeV/SIVgag在体外诱导特异于SIV Gag的细胞应答
为了检测特异于SIV Gag的应答是否时SeV/SIVgag为媒介的Gag的表
达诱导的，利用从恒河弥猴(Macaca mulatta)制备的PBMC，在体外测试了细
胞免疫应答。预先，用表达SIV抗原的裸露DNA(表达包括Gag的SIV抗原
的质粒DNA)接种这一恒河弥猴，为了进行其它实验，还用SIVmac239攻击
它。如过去的文献(Kestler，H.等人，1990年，《科学》，248卷：第1109
-1112页；Shibata，R.等人，1997年，《感染疾病杂志》176卷：第362-
373页)所述，在恒河弥猴的PBMC上制备SIVmac239攻击储备物。在MT
-4细胞上测试该储备物的效价。根据实验室动物的一贯规则，这些恒河弥
猴在使用前的测试中对SeV，SIV，和猿D型逆病毒是阴性的，并且要保持阴
性。在氯胺酮麻醉后，收集血液，接种和接种病毒。
在这一CTL测试中，将从SIV攻击后3星期的恒河弥猴制备的新鲜
PBMC用作效应物。如文献(Shibata，R.等人，1997年《感染疾病杂志》176
卷：362-373页)所述，从整个血液样品中制备周边血液单核细胞(PBMC)。
在RPMI1640(生命技术公司)和10％的胎牛血清(Hyclone)中培养PBMC。用
SeV/对照或SeV/SIVgag，以MOI＝10感染PBMC，温育2小时，用于共培
养。在96孔的U底平板中，以每孔混合5×105个PBMC和1×105个
SeV/SIVgag感染的PBMC开始特异于SIV Gag的刺激共培养，在相同的平
板孔中混合5×105个PBMC和1×105个SeV/对照感染的PBMC开始非特
异的刺激共培养。在共培养3天后，收集培养上清液，在含有10单位/毫升
的重组的人白细胞介素2(Boehringer Mannheim)的培养基中培养收集的细
胞。通过酶联免疫吸收测定(ELISA)(生物科学公司)测定上清液中干扰素-
γ(IFN-γ)的浓度。在这一测试中检测的下限时15pg/ml。在细胞毒性T淋巴细
胞(CTL)测试中，将特异于SIV Gag的刺激共培养中的PBMC用作效应物细
胞。可替代地，用新鲜制备的PBMC作为效应物。如过去所述(Voss，Q.等人，
1992年《病毒学方法杂志》，39卷：185-195页；Voss，Q.等人，1995年，
《病毒学》208卷：770-775页)，进行CTL测试(51Cr-释放测试)。将用表
达SIV Gag的重组VV，VV/SIVgag感染的自身Herpesvirus papio无限繁殖
的B类淋巴母细胞系(B-LCL)用作特异于SIV Gag的细胞溶解的靶。可替代
地，利用SeV/SIVgag感染的B-LCL。将用对照VV(VV/WR)或SeV/对照
感染的B-LCL用于非特异溶解。如下计算51Cr-释放的百分数：％51Cr释
放量＝(测试释放量-自发释放量)/(最大释放量-自发释放量)×100。然后，
从特异于Gag的细胞溶解的51Cr释放量百分数减去非特异的细胞溶解的51Cr
释放量百分数计算出特异于Gag的细胞溶解的51Cr-释放量的百分数。当特
异于Gag的51Cr释放的百分数超过10％即认为特异于Gag的CTL细胞活性
是阳性。
将用SeV/SIVgag或VV/SIVgag感染的自身的B-LCL用作靶。如图2A
所示，在利用SeV/SIVgag感染的B-LCL的测试以及利用VV/SIVgag感染
的B-LCL的测试中观察到了特异于Gag的细胞溶解，表明SeV/SIVgag感
染的B-LCL是特异于SIVgag的CTL的靶。
然后，我们测定SeV/SIVgag感染的细胞是否诱导特异于SIV Gag的CTL
的扩展。将从恒河弥猴Rh018制备的PBMC与SeV/SIV gag感染的PBMC
共培养12星期，诱导产生了IFN-γ，一个Th1的细胞因子(图2B)。相反，
将前面制备的PBMC与SeV/对照感染的PBMC共培养免疫诱导出可检测到
的IFN-γ。在前面的共培养物(与SeV/SIVgag感染的PBMC共培养)中发现
了特异于SIV Gag的CTL活性，但在后面的对照共培养物(与SeV/对照感染
的PBMC共培养)中没有发现这样的CTL活性(图2C)，表明SeV/SIVgag感
染的细胞诱导了特异于Gag的CTL活性。
[实施例4]在食蟹猴中接种SeV/SIVgag
根据表1中概括的方案，用四个食蟹猴进行接种实验。根据实验动物的
惯例，在使用之前，四个食蟹猴对SeV，SIV和D型猿逆转录病毒时阴性的。
在用氯胺酮麻醉后，收集血液，取鼻棉拭样品，种痘和接种病毒。在第一次
免疫后的0，4和14星期时，对食蟹猴1429407002(Cy002)进行三次对照接
种，即在鼻内接种108个CIU的SeV/对照。在相同的日程，对两个食蟹猴，
1129307001(Cy001)和(1128206162)(Cy162)，用108个CIU在鼻内接种三次。
没有一个食蟹猴表现出病理症状，包括体重减轻。也没有观察到外周CD4
或CD8细胞数的明显降低(图3A)。
表1接种方案和体内的SeV/SIVgag的表达
食蟹猴 接种 表达 首次接种后的星期数
0 1 2 4 5 14 15 22
1stSeV 2nd SeV 3rd SeV
Cy002 SeV/对照 SeV - + - - - - - ND
108CIU IN gag - - - - ND ND ND -
Cy001 SeV/SIVgag SeV - + -
(参见47页)
ND没有检测
用鼻内的棉拭检测呼吸道中SeV/SIVgag的复制和表达(表1)。如过去所
述(Hurwitz，J.L.等人，1997年，疫苗，15卷：533-540页)进行鼻棉拭取样。
在培养基中稀释棉拭样品，为了回收SeV，将样品注射进鸡蛋的尿囊腔。在
温育48小时后，收集尿囊液，进行细胞凝集实验，检测SeV。为了检测SIVgag
的表达，用高纯度病毒RNA试剂盒(Boehringer Mannheim)从棉拭样品中提
取RNA。用特异于SIV gag的引物进行嵌套式RT-PCR。第一次RT-PCR
的引物时5’-AGA AAC TCC GTC TTG TCA GG-3’(SEQ ID NO：11)和5’-
TGA TAA TCT GCA TAG CCG C-3’(SEQ ID NO：12)，第二次PCR的引物时5’
-GAT TAG CAG AAA GCC TGT TGG-3’(SEQ ID NO：13)和5’-TGC AAC
CTT CTG ACA GTG C-3’(SEQ ID NO：14)。
在食蟹猴Cy002，Cy001和Cy162中，正如用棉拭接种的鸡蛋的尿囊液
中积累的SeV HA活性所证明的，在首次接种后1星期，检测到了SeV(SeV/
对照或SeV/SIVgag)的复制(表1)。在第2星期，没有可检测到的SeV。在棉
拭中，第二次和第三次接种都没有产生可检测的SeV。用特异于SIVgag的
引物进行嵌套PCR，检测到在两个接种SeV/SIVgag的食蟹猴(Cy001和Cy162)
的棉拭中有SIV/SIVgag的表达，但接种SeV/对照的食蟹猴(Cy002)的棉拭中
没有。
在这三个食蟹猴中，还研究了接种后的免疫应答。用ELISA检测体液
的免疫应答表明，在所有三个食蟹猴中，接种在血浆中诱导了高水平的抗
SeV抗体(图3B)。第二次和第三次接种使水平快速上升，表明效果加强了。
相反，血浆中没有观察到明显的抗SIV Gag p27抗体的诱导。抗-SeV抗体
的ELISA是用已破坏的SeV进行的。抗SIV Gag p27抗体的ELISA是用重
组的p27抗原(ImmunoDiagnostics(免疫分析公司))进行的。对于抗SeV抗体
的ELISA，将血浆样品稀释1000倍；对于抗p27抗体的ELISA，将血浆样
品稀释100倍。
在首次接种后22星期时，用大剂量(100TCID50)的SIVmac239鼻内攻
击一个首次进行实验的食蟹猴(Cy029)，一个SeV/对照接种的食蟹猴(Cy002)，
和两个SeV/SIVgag接种的食蟹猴(Cy002和Cy162)。详细地说，用108CIU
的SeV/SIVgag在0，4和14星期时，鼻内接种上面的两个食蟹猴。在首次接
种后22星期，用100TCID50的SIVmac239鼻内攻击这些食蟹猴，在血浆中
检测到了SIV RNA。接种SeV/对照的食蟹猴和首次进行实验的食蟹猴是作
为对照的。
如下检测这些食蟹猴的血浆中的SIV RNA的量。用高纯度病毒RNA试
剂盒提取血浆RNA。用特异于SIV env的引物进行嵌套PCR。第一次RT-
PCR所用的引物是5’-ATG GGA TGT CTT GGG AAT C-3’(SEQ ID NO”15)
和5’-CCA AAT CTG CAG AGT ACC AAG-3’(SEQ ID NO：16)，第二次PCR
所用的引物是5’-CAG CTT GGA GGA ATG CG-3’(SEQ ID NO：7)和5’-
CTT GTT CCA AGC CTG TGC-3’(SEQ ID NO：18)。为了定量，如过去的叙
述(Shibata，R.等人，1997年，《感染疾病杂志》，176卷：362-373页；
Reed，L.J.和Muench，H.，1938年，《Am.J.Hyg.》27卷：493-497页)，将
稀释5倍的RNA样品扩增4次。这一实验中，检测的下限时1.0×102个拷
贝/毫升。
在攻击后2星期时，所有四个食蟹猴都表现出了水平相似的血浆SIV的
负荷峰(图4)。然后，在两个对照食蟹猴中，血浆SIV RNA水平降低了，但
仍保持在约105个拷贝/毫升。相反，病毒血症开始后，两个SeV/SIVgag接
种的食蟹猴中，病毒负荷明显降低(102到103个拷贝/毫升)。更值得注意的是，
在免疫的食蟹猴中，血浆中的病毒负荷最终降低到可检测水平(100个拷贝/
毫升)以下，而在对照食蟹猴中，病毒负荷仍然在105个拷贝/毫升左右(图4)。
[实施例5]在食蟹猴的各个组织中SeV/SIVgag的表达
为了检测食蟹猴中重组SeV的原代复制，用SeV/SIVgag鼻内接种六个
食蟹猴(表2，组I)。根据实验动物的一般规定喂养食蟹猴。在使用前，对这
些食蟹猴进行测试时，它们是SeV和SIV阴性的。在氯胺酮麻醉后，收集
血液，取样棉拭和接种。在接种后，没有一个食蟹猴表现出明显的临床症状。
其中，组I-A中的两个(C3880和C4325)在接种后第4天，组I-B中的两
个在接种后第7天，组I-C中的两个(C3882和C4324)在第13天分别进行
安死术。从尸体上制备各个组织的细胞，从细胞中提取RNA。
将组织切碎，从LN，胸腺，脾制备细胞。在用胶原酶和中性蛋白酶处
理后，从鼻粘膜，腭扁桃体，气管和肺制备细胞。在提取RNA之前，用PBS
洗涤这些细胞3次。
如文献所述(Shibata，R.等人，1997年，《感染疾病杂志》，176卷：第
362-373页)，用Ficoll-Paque Plus(Amersham-Pharmacia生物技术公司)从整
个血液样品中制备外周血液单核细胞(PBMC)。用RNA提取试剂盒(Qiagen)，
从细胞中提取RNA。如文献(Shibata，R.等人，1997年，《感染疾病杂志》，
176卷：第362-373页)所述，用特异于SIVgag的引物进行嵌套RT-PCR(逆
转录PCR和嵌套PCR)，通过限制RNA样品的稀释度定量gag RNA水平，
确定终点。利用TaqMan PCR系统(AIB PRISM 7700，Applied Biosystems
Japan)进行定量性PCR，来定量SeV NmRNA。
表2动物的实验方案
小组 食蟹猴 接种的接种物a 尸体解剖
以下参见51页，其中control为对照，day为天
a在鼻内接种108CIU的SeV/对照或SeV/SIVgag
b没有做
5-1.在食蟹猴的鼻粘膜中表达SeV/SIVgag
利用定量性的RT-PCR，所有6个食蟹猴，在从鼻粘膜制备的细胞中
都检测到了明显水平的SIV gag RNA(图A)。在组I-A中，第4天检测到，
每106个细胞中有约1.7×104个或2.4×105个拷贝的gag RNA。在第7天和
13天的表达水平比第4天低。另外，鼻粘膜中的SeV NmRNA表达的水平
也用定量性的RT-PCR检测了(图5B)。在大多数食蟹猴中，SeV NmRNA
的水平(图5B所示)相当于gag RNA水平的1/4或1/3(图5A所示)。这些结
果证明在接种SeV/SIVgag的食蟹猴的鼻粘膜中都明显地表达了
SeV/SIVgag。
然后，我们验证了是否可以从鼻棉拭中回收SeV。如上所述收集鼻棉拭。
为了回收SeV，在RPMI-1640中稀释鼻棉拭样品，将样品注射进鸡蛋的尿
囊腔。在从鼻粘膜制备的细胞中回收SeV的情况中，细胞进行了2次冻融，
并将用PRMI-1640悬浮的1×105个细胞注射进鸡蛋的尿囊腔。在温育48
小时后，收集尿囊液，如(Kato，A.等人，1996年《基因细胞》1卷：569-
579)所述进行血细胞凝集(HA)测试实验，检测SeV。
如表3所示，在所有6个动物中，在第4天，从棉拭回收病毒。在第7
天在4个食蟹猴中的2个中回收病毒，这两个食蟹猴的鼻粘膜中都表现出有
更高水平的gag RNA水平。在第13天，在这两个动物中都没有回收到病毒。
另外，我们验证了是否从鼻粘膜制备1×105个细胞中可以回收到病毒(表3)。
从第4天取的样品中都回收到了病毒，但从第7天或第13天取的样品中没
有回收到病毒。这些结果表明SeV/SIVgag复制水平在不到1星期达到了峰
值。
表3回收SeV
其中：Group为小组；Macaques为弥猴；from Nasal Swab为在鼻棉拭中；
from Nasal Mucosa为在鼻粘膜中，day为第(几)天
参见52页
5-2.在食蟹猴的鼻腔中的局部LN中SeV/SIVgag的表达
在咽后咽LN和下颌下LN中也发现了明显的gag RNA水平，
这两个LN都接受了最早流出的淋巴细胞流(图5C和图5D)。在第7天
和第13天，在每个动物的LN中的gag RNA的水平约是鼻粘膜中的1/20。
但是，在第4天，每个动物的咽后咽LN中的gag RNA不超过鼻粘膜中的
1/50。所以，在第4天和第7天观察到LN中的水平之间没有明显差异。
5-3.在食蟹猴的其它组织中SeV/SIVgag的表达
如表4所示，我们也在其它组织中验证了gag的表达。我们没有得到足
够的腭扁桃体细胞，但它的表达水平表明时少于咽后咽中的。在两个实验点：
C3880的第4天和C4240的第7天，在气管中有可检测的表达水平。在前一
个动物中的表达水平比后一个高得多。在肺中，只有C3880检测到表达水平
(在第4天)。在胸腺或腹股沟的LN中没有观察到表达。在脾中几乎没有检
测到表达；只在一个动物中检测到很少的表达(在第7天)。在PBMC中，四
个食蟹猴中的两个在第7天表现出gag的表达，而在第4天或第13天没有
观察到表达。在表4列出的所有被检测的组织中的gag表达比鼻粘膜，咽后
咽LN，和下颌下LN中的低得多。
表4 gagRNA的表达
其中Group：小组；Autopsy at day4，在第4天解剖尸体，下面的行中只是
第几天不一样；Palastine tonsil：腭扁桃体；Lung
参见53页
[实施例6]SeV/SIVgag感染的细胞刺激特异于Gag的CD8+细胞
我们用流动细胞计分析了特异于抗原的细胞内诱导IFN-γ，验证了是
否SeV/SIV gag感染的细胞是否真正能够特异于Gag的CD8+T细胞。利用
的PBMC是从用SIV模型感染的恒河弥猴得到的。按照对实验动物的规定
饲养实验中利用的恒河弥猴。在使用之前，测试时，这些弥猴时SeV和SIV
阴性的。在氯胺酮麻醉后，收集血样，取鼻棉拭样，和接种。如(Matano，T.
等人，2000年《疫苗》，18卷：3310-3318页)所述，让这些动物先接受
原病毒DNA的接种，然后用SIVmac239攻击(Kestler，H.等人，1990年《科
学》，248卷：1109-1112页)。通过51Cr-释放实验，证明在SIV感染的模
型期有特异于SIV Gag的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)(数据未表示)。
如下，利用流动细胞计检测特异于抗原的诱导IFN-γ。用对照疫苗病
毒载体(Vv-对照)(Mackett，M.等人，《美国国家科学院进程》，79卷：7415
-7419)，表达SIV Gag(Vv-Gag)的重组疫苗病毒载体，或对照SeV载体(SeV/
对照)，以m.o.i.＝5感染自体的herpesvirus papio无限增殖的B类淋巴母细胞
(BLC)(Voss，G等人，1992年，《病毒学方法杂志》39：185-195页)，如
(Gea-Banacloche，J.C.等人，2000年，《免疫学杂志》，165卷：1082-1092
页)所述，在一天后，将这些细胞用作对照非特异的，特异于Gag的，或特
异于SeV的刺激物。
在含有1毫升RPMI-1640与10％的FBS的培养试管(Falcon#3033)中，
将1×106的PBMC与1×103个上述刺激物细胞共培养。在培养1小时后，
在细胞中加入0.75微升/毫升的GolgiStop(Pharmingen，圣地亚哥，加里弗尼
亚州)，然后继续温育5小时。
在用p27刺激的情况中(实施例7)，在含有1毫升RPMI-1640和10％
FBS，和2微克抗-CD28单克隆抗体(Becton Dickinson，San JOSE，CA)和10
微克重组SIV Gagp27蛋白质的培养试管中，温育1×106个PBMC。在温育
3小时的细胞中，加入0.75微克/毫升的GolgiStop，并继续温育15小时。
然后，用Cytofix-Cytoperm试剂盒(Pharmingen)，按照制造商的说明书
对细胞内的IFN-γ染色。详细地说，收集受刺激的细胞，在室温下，用针对
表面分子的抗体混合物染色。用作抗体的时抗人CD8 PerCP(Becton
Dickinson)和抗人CD3 APC(Pharmingen)抗体。然后，用含0.5％的牛血清白
蛋白(PBS-BSA)的PBS洗涤细胞，用Cytofix-Cytoperm固定和渗透，再在4
℃，用抗人的IFN-γPE(Pharmingen)染色30分钟。用FACScalibur收集已
染色的样品，用CellQuest软件(Becton Dickingson)分析。在每个样品中，用
BLC刺激，捕获100,000到200,000个发生的总事件，用重组蛋白质刺激，
捕获了50,000到100,000个发生的总事件。首先对单核细胞，然后对CD3
+CD8+亚群进行门控。计算CD3+CD8+IFN-γ细胞数在单核细胞数中的
比例，表示为每1×106个淋巴细胞中的CD8+IFN-γ+细胞数目。
用重组的表达SIV Gag的疫苗病毒(Vv-Gag)感染PBMC和自体BLC的
共培养物，结果在CD8+T细胞的细胞内中诱导了特异于Gag的IFN-γ+T
细胞(图6C)。在PBMC与SeV/SIVgag感染的BLC的共培养物中观察到了
类似的CD8+IFN-γ+细胞频度(图6B)。在PBMC与SeV/对照感染的BLC
的共培养物中发现没有明显地诱导CD8+IFN-γ+细胞(图6A)。这些结果表
明SeV/SIVgag感染的BLC对特异于Gag的CD8+T细胞的刺激时有效的。
[实施例7]恒河猴中特异于Gag的CD8+T细胞的频度
在另一个实验中用5个恒河弥猴分析SeV接种后的最初的免疫应答(图
2，组II)。组II-A中的两个弥猴(R004和R014)在鼻内接种了SeV/对照，
组II-B中的三个弥猴(R013，R015和R017)接种了SeV/SIVgag。R010在肌
肉内接种了对照DNA(800微克pCMVN的DNA(Matano，T.等人，2000年，
《疫苗》18卷：3310-3318页)，并在另一个实验中，在接种SeV/对照之
前的12到6星期之间接种10微克pCMVN DNA(用基因枪做四次)。在接种
后，其中没有一个表现出明显的临床症状。
将第3星期得到的PBMC与用Vv-Gag感染的自体BLC共培养，检测
CD8+T细胞中的IFN-γ的诱导。所有用SeV/SIVgag接种的组II-B中的
恒河弥猴在用特异于Gag的刺激后都检测到了明显的CD8+IFN-γ+T细胞
频度，但在非特异刺激后没有检测到(图7A)。相反，用SeV/对照接种的组
II-A的恒河弥猴在用特异于Gag的刺激后，CD8+T细胞中没有明显地诱
导IFN-γ。这些结果表明，在SeV/SIVgag接种的恒河弥猴中有全身的免疫
应答，即诱导了特异于Gag的CD8+T细胞。
另外，我们在组I-C的弥猴中，用从咽后咽LN制备的细胞，验证了
鼻腔周围的局部免疫应答。由于我们不能从组I的恒河弥猴制备自体BLC，
所以Gag特异刺激时用重组SIV Gag p7蛋白质进行的。在组I-C的两个恒
河弥猴中都检测到了明显的对p27有反应的CD8+IFN-γ+T细胞频度，表
明在LN中诱导了特异于p27的CD8+T细胞。
[实施例8]恒河弥猴中的特异于SeV的CD8+T细胞的频度
在接种SeV/对照或SeV/SIVgag后的恒河弥猴中，我们也验证了特异于
SeV的细胞免疫应答。在所有组II的动物的PBMC中，在第3星期检测到
了高频度的SeV特异CD8+T细胞(图8B)。进一步分析表明，所有的弥猴
在第1星期已经表现出具有明显频度的SeV特异CD8+T细胞(图8A)。所
以，在接种后，很快诱导了高数量级的SeV特异细胞免疫应答。
用抗体ELISA评估血浆中的蛋白质水平。抗SeV抗体的ELISA时用失
活的SeV进行的(Watanabe，T.等人，2000年，《Arch.Dermatol.136卷：1518
-1522页)。抗SIV Gag p27抗体ELISA时用重组的p27蛋白质进行的
(ImmunoDiagnostics，Woburn，MA)。在抗SeV抗体的ELISA中将血浆样品稀
释1000倍，在抗p27的抗体的ELISA中将血浆样品稀释100倍。
在组II的所有恒河弥猴中，在接种后第1星期，血浆中没有检测到抗
SeV抗体，但在第2星期，出现了显著的抗体水平(图9)。相反，甚至在用
SeV/SIVgag接种的组II-B的恒河弥猴的血浆中也没有检测到抗Gag抗体
(数据未显示)。
[实施例9]与DNA疫苗结合使用的引导-加强效果
结合用DNA疫苗的效果时在引导-加强的接种中测试的。表5表示了
用恒河弥猴做的实验方案。根据文献(Matano，T.等人，《疫苗》18卷：3310
-3318页，2000年)，用肌肉内接种和基因枪(Bio-Rad)接种DNA。在肌肉
内接种中，将800微升的0.25微克/微升的DNA溶液溶解在PBS中，然后
一次性地在四头肌中注射200微升。此外，通过将DNA注射进股骨前面的
皮肤，进行基因枪接种(Matano，T.等人，《疫苗》18卷：3310-3318页，
2000年)。对照组中有四个弥猴，DNA疫苗+SeV/SIVgag疫苗给药的组中