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1、(10)申请公布号 CN 102851379 A (43)申请公布日 2013.01.02 C N 1 0 2 8 5 1 3 7 9 A *CN102851379A* (21)申请号 201210348974.X (22)申请日 2012.09.14 C12Q 1/68(2006.01) A01H 1/04(2006.01) (71)申请人山东省农业科学院蔬菜研究所 地址 250100 山东省济南市工业北路202号 (72)发明人高莉敏 陈运起 董飞 孔素萍 (54) 发明名称 一种大葱细胞质雄性不育检测的试剂盒及其 应用 (57) 摘要 本发明公开了一种大葱细胞质雄性不育的 检测试剂盒及其。
2、大葱辅助选择育种中的应用， 所述的试剂盒包括SCAR标记引物：正向引物： WMS607L：5CATAAGACTTGCCCTGAG 3；反向引 物：WMS607R：5TTCGCTATGTTCTATGTGAG 3。本 发明的试剂盒可以广泛应用于我国辽宁大葱、河 南大葱、山东大葱以及日本大葱等细胞质的育性 鉴定。本发明通过提取大葱总DNA即可，避免了提 取线粒体DNA的复杂操作，使操作过程更简单有 效。分子标记辅助选择操作简单，节约成本和时 间，为大葱分子标记辅助选择育种体系奠定了基 础。 (51)Int.Cl. 权利要求书1页 说明书5页 序列表3页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)。
3、发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 5 页 序列表 3 页 1/1页 2 1.一种用于大葱细胞质雄性不育检测的试剂盒，其特征在于包括如下的SCAR标记引 物： 正向引物：WMS607L：5-CATAAGACTTGCCCTGAG-3； 反向引物：WMS607R：5-TTCGCTATGTTCTATGTGAG-3。 2.根据权利要求1所述的试剂盒，所述的试剂盒包括CTAB法提取DNA所需要的试剂， 所述的试剂优选的是北京天根生产的的植物基因组提取试剂盒中的试剂。 3.根据权利要求1所述的试剂盒，所述的试剂盒包括PCR扩增所需要的试剂。 4.根据权利要求1所述的试剂盒，所述的试剂盒包括对扩增产物。
4、进行凝胶电泳的试剂 盒以及DNA Maker。 5.权利要求1-4任意一项所述的试剂盒在大葱分子标记辅助选择育种中的应用。 6.根据权利要求5所述的应用，所述应用包括用CTAB法提取大葱总DNA，然后使用所 述的SCAR标记引物对所提取的DNA进行PCR扩增，对扩增产物进行凝胶电泳以确定有无 扩增产物以及扩增产物的片段长度，根据检测结果判断所使用的大葱是否属于细胞质不育 系。 权 利 要 求 书CN 102851379 A 1/5页 3 一种大葱细胞质雄性不育检测的试剂盒及其应用 技术领域 0001 本发明属于农业育种领域，尤其涉及一种大葱细胞质雄性不育检测的试剂盒及其 应用。 背景技术 00。
5、02 大葱(Allium fistulosum L.var.giganteum Makino)，植物学分类属于百合科 (Liliaceae)、葱属(Allium)、葱种(fistulosum)中的一个变种(var.giganteum Makino)。 以叶鞘抱合而成的肥大假茎(葱白)为主要产品，因在葱中植株高大而得名。 0003 大葱在葱蒜类蔬菜中占有非常重要的位置，是中国人日常生活中不可缺少的重要 蔬菜作物之一。在中国普遍栽培，全国常年栽培大葱约计50多万hm2，年产大葱1760多万 t。大葱主要分布在中国的秦岭-淮河以北地区。其中，山东、河南、河北、辽宁等省份栽培 较为集中，单产水平也较高。
6、。 0004 大葱营养成分丰富，据测定每百克大葱含蛋白质12.4g，脂肪0.3g，碳水化合物 68.6g，热量32千卡，粗纤维0.5g，钙12mg，磷46mg，铁0.6mg，胡萝卜素1.2mg，硫胺素 0.08mg，核黄素0.05mg，尼克酸0.5mg，抗坏血酸14mg，所含胡萝卜素高于瓜菜类和豆菜类 蔬菜。另外，大葱还含有挥发性的硫化丙烯等芳香物质，既可作为蔬菜和调味品，也具有良 好的药用效果。 0005 大葱的管状叶和假茎(葱白)均可食用，生食或熟食皆宜。大葱是非常重要的香 辛类蔬菜，其味辛，性温，食用可开胃消食、杀菌防病等。据明代李时珍本草纲目记载，葱 之茎白、根须、叶、汁、花均可入药，。
7、对大葱不同部位的性质和治病作用已进行了详细阐述， 记有54个药方，可 治10余种疾病。主治伤寒寒热，除肝邪气，治霍乱转筋，利大小便，解耳 鸣。现代医学认为大葱具有刺激血液循环等功效。对痢疾杆菌、葡萄球菌等有杀灭作用。 0006 因为大葱生长周期较长，开花期较短，单果结籽数较少，自交衰退较明显等特点， 所以开展大葱育种难度较大，从而限制了大葱育种研究工作的开展，国内外从事大葱育种 研究的人员较少，因此，大葱育种研究相对滞后。 0007 长期以来，我国大葱育种一直以选种为主，各地栽培的大葱名产品种和推广的新 品种，主要是采用选种方法育成。自上世纪70年代日本和我国才陆续开展了大葱雄性不育 系及其利。
8、用研究，开始了大葱一代杂种选育，但是，一代杂种选育进展缓慢，至今在生产上 没有得到较大面积推广。 0008 山东农业大学、山东省农业科学院蔬菜研究所、章丘市农业局、辽宁省农科院园艺 系等单位，利用自然群体中的不育株，通过4-5代回交，先后育成大葱雄性不育系和相应保 持系。陈立东、王景峰等育成了超早熟大葱雄性不育系603A、626A；张启沛、魏佑营等育成 了大葱不育系4A、5A、225A、237A；佟成富、唐成英等育成了大葱不育系244A佟成富，唐成 英，崔连伟.大葱雄性不育系244A及其杂交种辽葱二号(9746F1)的选育及利用.全国蔬 菜遗传育种学术讨论会论文集，2002.301-307；陈。
9、运起、高莉敏等育成了大葱雄性不育系 9801A、9802A等。 说 明 书CN 102851379 A 2/5页 4 0009 为加快大葱雄性不育系选育进程，盖树鹏、孟祥栋等(2004)利用RAPD标记和SCAR 标记初步建立了大葱不育系、保持系分子标记辅助选择的技术体系盖树鹏，孟祥栋等.大 葱雄性不育分子标记辅助选择的研究.分子植物育种，2004，2(2)：223-228。可以减少工 作量，缩短部分大葱品种的育种年限，但是不能在广泛的育种材料中实现苗期选择。 0010 加强生物技术与常规育种的结合生物技术的发展给园艺植物遗传育种带来了巨 大的变化，分子标记技术已成为育种研究的重要组成部分。但。
10、 是，要使分子标记成为育种 的一种常规手段，尚有许多问题有待解决。如重要性状基因的精细定位，检测过程的自动 化，饱和遗传图谱的构建等。生物技术与常规育种相结合，将有力的推动大葱遗传育种学的 发展。 0011 加快雄性不育系与一代杂种选育优良雄性不育系选育是选育一代杂种、利用杂种 优势的重要前提，从大葱制种田发现不育株后，通过回交或体细胞杂交、细胞器转移、细胞 质基因工程等技术转育成更多的优良雄性不育系，进而培育出优势明显的一代杂种。随着 大葱育种研究的不断深入，大葱一代杂种选育与利用将进一步加快，大葱一代杂种的推广 覆盖率将迅速提高。 0012 日本的马上武彦等(1985)，用大葱雄性不育材料。
11、连续三次回交与7个品种杂交， 观察植株花粉和种子的育性，判定大葱雄性不育的遗传模式，研究结果认为：大葱雄性不 育是受胞质与核基因互作控制，雄性不育与保持系分别由两对基因S(ms1ms1ms2ms2)和 N(ms1ms1ms2ms2)支配，雄性不育性可用于大葱杂交育种。 0013 近年来，分子生物学的发展为植物遗传标记提供了一种基于DNA变异的新技术手 段，即分子标记技术。DNA分子标记研究与应用的迅速发展为植物遗传育种注入新的活力， 并使传统育种技术发生了深刻的变化。DNA分子标记的研究始于1980年，现已有数十种标 记技术。与传统的遗传标记相比，DNA分子标记有很多优点。以PCR为基础的DN。
12、A指纹技 术大大加快了DNA分子标记的研究和利用，广泛应用于植物遗传育种、高密度遗传图谱的 构建、基因定位和克隆、植物亲缘关系鉴别及遗传多样性研究、分子标记辅助选择育种等领 域。 0014 植物育种中分子标记辅助选择是通过分析与目标基因紧密连锁的分子标记来判 断目标基因是否存在的。通过不同分子标记技术的分析可筛选出与目标基因性状紧密连锁 的DNA片段，这样可以作为辅助育种的分子标记。应用这些分子标记进行间接选择，将得到 事半功倍的作用，因为分子标记 辅助选择不受植物生长发育的时期及环境的影响，不存在 表达与否的问题。无论是与细胞质位点还是与核基因连锁的标记的辅助选择都可减少工作 量，提高育种效。
13、率。利用与细胞质位点连锁的标记可鉴别出单株的细胞质类型，淘汰可育材 料中S型细胞质，只能从N型细胞质类型的单株中选择保持系，从而减少测交组合数和自交 株数，减少工作量，避免盲目性，提高选择效果。原有报道的通过提取大葱线粒体DNA进行 PCR扩增，得到2800bp片段的分子标记不能在广泛的大葱材料中应用，应用范围较窄。 发明内容 0015 本发明涉及一种大葱细胞质雄性不育检测的试剂盒及其应用。为了实现本发明的 目的，拟采用如下技术方案： 0016 本发明一方面涉及一种用于大葱细胞质雄性不育检测的试剂盒，其特征在于包括 说 明 书CN 102851379 A 3/5页 5 如下的SCAR(Sequ。
14、ence-characterized Amplified Region序列特异性扩增区)标记引物： 0017 正向引物：WMS607L：5CATAAGACTTGCCCTGAG3； 0018 反向引物：WMS607R：5TTCGCTATGTTCTATGTGAG3。 0019 在本发明的一个优选实施方式中，所述的试剂盒包括CTAB法提取DNA所需要的试 剂。 0020 在本发明的另一个优选实施方式中，所述的试剂盒包括PCR扩增所需要的试剂。 0021 在本发明的另一个优选实施方式中，所述的试剂盒包括对扩增产物进行凝胶电泳 的试剂盒以及DNA Maker。 0022 本发明另一方面还涉及上述试剂盒在。
15、大葱分子标记辅助选择育种中的应用。 0023 在本发明的一个优选实施方式中，所述应用包括用CTAB法提取大葱总DNA，然后 使用所述的SCAR标记引物对所提取的DNA进行PCR扩增，对扩 增产物进行凝胶电泳以确 定扩增产物的片段长度，根据检测结果判断所检测的植株是否是细胞质不育类型。 0024 本发明的试剂盒可以广泛应用于我国辽宁大葱、河南大葱、山东大葱以及日本大 葱等细胞质的育性鉴定。本发明通过提取大葱总DNA即可，避免了提取线粒体DNA的复杂 操作，使操作过程更简单有效。分子标记辅助选择操作简单，节约成本和时间，为大葱分子 标记辅助选择育种体系奠定了基础。 具体实施方式 0025 实施例1。
16、 0026 合成大葱细胞质雄性不育SCAR标记的引物： 0027 正向引物：WMS607L：5CATAAGACTTGCCCTGAG3； 0028 反向引物：WMS607R：5TTCGCTATGTTCTATGTGAG3。 0029 选择已知基因型的个体材料共220份，对大葱DNA提取采用北京天根生产的植物 基因组CTAB法提取试剂盒(也可以使用其它常规的CTAB法提取试剂盒进行提取)以及 试剂盒中所述方法进行提取；PCR扩增在美国伯乐TC-XP-D型基因扩增仪上进行，20L体 系，其中2x Taq MasterMix10L，Primer1、2(10umol/L)各1.0L，样品DNA1L，反应程。
17、 序为94预变性2min，94变性30sec，53退火1min，72延伸1min，35个循环，72延 伸5min，4保存；PCR产物在1.2琼脂糖凝胶进行电泳分离分析，溴化乙啶染色，凝胶成 像系统自动成像；特异条带回收纯化，按照Gel Extract ion Kit使用说明；连接、转化、鉴 定按照PGM-T克隆试剂盒说明；DNA序列测定委托北京博尚生物技术有限公司完成。 0030 对已知育性的220份材料进行PCR验证(见表1)，按照本发明实施例中的方法，所 有的不育系中均扩增出大小为607bp的片段，而保持系中没 有扩增产物，PCR结果与田间 判断相吻合。说明应用这对引物完全可以鉴别大葱细胞。
18、质雄性不育类型，据此得知扩增出 的607bp片段与雄性不育有一定的联系。对以上大葱细胞质雄性不育系980238A、200501A 中扩增出的特异片段经过回收、转化、克隆和测序，得到的结果一致，序列全长607bp，核苷 酸序列如SEQ ID No.1所示，两端含有引物序列，其碱基组成为A+T55，C+G45。 0031 表1大葱不育系和保持系单株验证结果 0032 说 明 书CN 102851379 A 4/5页 6 0033 说 明 书CN 102851379 A 5/5页 7 0034 *：+表示有带(不育)；*：-表示无带(可育) 0035 本发明选用大葱细胞质雄性不育系980238A、2。
19、00501A及其相应的保持系的总DNA 进行PCR扩增，获得了区分两系细胞质的稳定的SCAR标记，为大葱分子标记辅助选择育种 体系奠定了基础，与目前技术相比，其优点是：(1)标记稳定：对已知育性的220份材料进行 广泛的验证，其分子标记鉴定结果与表现型完全一致。原有报道的线粒体DNA的PCR扩增 得到的2800bp片段的分子标记不能在广泛的大葱材料中应用，应用范围较窄(2)分子标记 辅助选择操作简单，节约成本和时间，大葱是两年生植物，育种年限长，采用常规选育方法， 周期长，成本高，费时费力。通过本发明，只需简单提取大葱总DNA进行简单PCR扩增，然后 进行琼脂糖凝胶电泳，即可有效的在苗期鉴定细胞质的育性。不仅避免了常规方法繁琐的 筛选过程，还避免了提取线粒体DNA的复杂操作，使操作过程更简单有效。 0036 应当理解的是，本发明的具体实施方式仅仅是出于示例性说明的目的，其不以任 何方式限定本发明的保护范围，本领域的技术人员可以根据上述说明加以改进或变换，而 所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。 说 明 书CN 102851379 A 1/3页 8 0001 序 列 表CN 102851379 A 2/3页 9 0002 0003 序 列 表CN 102851379 A 3/3页 10 序 列 表CN 102851379 A 10 。