重组人透明质酸酶及其制备方法和采用聚乙二醇共价修饰的化合物和方法.pdf

本发明涉及用生物医药领域，尤其涉及重组人透明质酸酶及其制备方法和采用聚乙二醇共价修饰的化合物和方法。本发明的一个目的是提供一种重组人透明质酸酶及其制备方法，该方法将人透明质酸酶基因整合入毕赤酵母工程菌中，通过发酵纯化，得到大量高活性高纯度的重组人透明质酸酶。本发明的二个目的是提供一种重组人透明质酸酶聚乙二醇修饰化合物及其制备方法，该化合物活性高、免疫原性低、稳定性好。

1.  一种重组人透明质酸酶的制备方法，其特征在于该方法包括以下的步骤：
1)表达载体的构建及转化毕赤酵母工程菌：
将人透明质酸酶基因片段插入到表达载体的酶切位点上，转化至E.coil TOP10中，在确保阅读框正确的前提下鉴定出重组表达质粒，重组质粒经Sac I线性化后电转入表达宿主毕赤酵母中(P.pastoris)，得到工程菌，其中所述的表达载体是pPIC系列载体；
2)阳性克隆的筛选、培养、诱导表达：
筛选出阳性克隆在培养基中进行培养，经诱导使目标蛋白表达；
3)表达产物的分离纯化：
收集发酵液，经离心得到发酵上清，然后对发酵上清用层析技术纯化；
上述的人透明质酸酶的cDNA序列如SEQ ID NO:1所示，编码一个序列如SEQ ID NO:2所示氨基酸的蛋白质；所述的人透明质酸酶的编码序列来源于基因文库，或者根据文献报道的人透明质酸酶的cDNA序列全基因合成，或者设计引物，通过PCR扩增获得。

2.  根据权利要求1所述的一种重组人透明质酸酶的制备方法，其特征在于pPIC系列载体是pPIC9k、pPICZa A、pPICZa B、pPICZa C中的一种或多种。

3.  根据权利要求1所述的一种重组人透明质酸酶的制备方法，其特征在于步骤1)中表达载体的酶切位点是Xho I/Xba I或BamHI/Not I位点。

4.  根据权利要求1所述的一种重组人透明质酸酶的制备方法，其特征在于步骤2)中阳性克隆筛选采用Zeocin做抗性筛选。

5.  根据权利要求1所述的一种重组人透明质酸酶的制备方法，其特征在于步骤2)中的培养温度控制在25-40℃，再优选的培养温度控制在30-35℃。

6.  根据权利要求1所述的一种重组人透明质酸酶的制备方法，其特征在于步骤2)中的诱导表达使用终浓度0.5％-1.5％(v/v)的甲醇作为诱导剂，再优选的诱导表达使用终浓度0.5％-1％(v/v)的甲醇。

7.  根据权利要求1所述的一种重组人透明质酸酶的制备方法，其特征在于步骤2)的诱导表达温度控制在25-40℃，再优选的诱导表达温度控制在30-35℃。

8.  根据权利要求1所述的一种重组人透明质酸酶的制备方法，其特征在于步骤3)中的层析技术是离子交换层析、分子筛层析、疏水层析中的一种或多种方法。

9.  权利要求1～8任意一项权利要求所述的方法制备得到的重组人透明质酸酶。

10.  权利要求9所述的重组人透明质酸酶聚乙二醇修饰化合物；聚乙二醇和重组人透明质酸酶以共价键连接，每个重组人透明质酸酶分子平均结合5～15个聚乙二醇分子，聚乙二醇修饰重组人透明质酸酶的酶比活性大于25,000U/mg。

11.  根据权利要求10所述的化合物，其特征在于：聚乙二醇为含单一活性功能基团的直链单甲氧基聚乙二醇，其结构式如下：

其中n为大于1的正整数，R为聚乙二醇的活性功能基团。

12.  根据权利要求10所述的化合物，其特征在于：聚乙二醇的平均分子量为4kd-40kd；优选选用的聚乙二醇的平均分子量为5kd-40kd；最优选，聚乙二醇的平均分子量为5kd-20kd。

13.  根据权利要求10所述的化合物，其特征在于：聚乙二醇通过酯键、醚键、硫醇键或者酰胺键与连接基团相连；优选的连接基团包括酯基、酰胺基、亚酰胺基、碳水化合物、顺丁烯二酰亚胺基团、环氧基、氧基羰基咪唑基、硝苯苯基、trysylate基、醛基、异氰酸酯基、乙烯砜基、酪氨酸基、半胱氨酸基、组氨酸基或伯基；作为再优选，所述的顺丁烯二酰亚胺基团为琥珀酸琥珀酰亚胺酯SS、丙酸琥珀酰亚胺酯SPA、羧甲酸琥珀酰亚胺酯SCM、琥珀酰亚胺基琥珀酰胺SSA、N-羟基琥珀酰亚胺NHS；氧基羰基咪唑基为羰基二咪唑基CDI；硝苯苯基为对碳酸硝基苯酯NPC或碳酸三氯苯酯TPC。

14.  根据权利要求10所述的化合物，其特征在于：聚乙二醇通过胺酯键共价偶联到人透明质酸酶分子上。

15.  根据权利要求10所述的化合物，其特征在于：聚乙二醇分子经活化后与透明质酸酶蛋白上氨基共价连接；作为优选，活化聚乙二醇是单甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺琥珀酸酯(mPEG-SS)、单甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺碳酸酯(mPEG-SC)、单甲氧基聚乙二醇N-羟基琥珀酰亚胺酯(mPEG-NHS)、单甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺丙酸酸酯(mPEG-SPA)、单甲氧基聚乙二醇羧甲酸琥珀酰亚胺酯(mPEG-SCM)、单甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺基琥珀酰胺(mPEG-SSA)、单甲氧基聚乙二醇丙醛(mPEG-ALD)、葡萄糖聚乙二醇NHS酯、半乳糖聚乙二醇NHS酯、甲氧基聚乙二醇碳酸酯(mPEG-SC)、单甲氧基聚乙二醇对甲苯磺酸酯(mPEG-Ots)、单甲氧基聚乙二醇对硝基苯酚碳酸酯(mPEG-OCOOPhNO2)、单甲氧基聚乙二醇五氟苯酚酯衍生物、α-甲氧基-聚乙二醇-ω-氨甲基(mPEG-CH2NH2)、α-甲氧基-聚乙二醇-ω-丙酸(mPEG-PA)、α-甲氧基-聚乙二醇-ω-丁酸(mPEG-BA)、α-甲氧基-聚乙二醇-ω-琥珀酰酯酸(mPEG-S)、α-甲氧基-聚乙二醇-ω-琥珀酰酯酸琥珀酰亚胺酯(mPEG-SS)或α-甲氧基-聚乙二醇-ω-[3-(3-马来酰亚胺基-1-氧丙基)氨基]丙基醚(mPEG-PPMAL)。

16.  根据权利要求10所述的化合物，其特征在于：聚乙二醇分子经活化后与透明质酸酶蛋白的连接基为SS、SPA、SCM、SSA或NHS；其中更为优选的连接基为SS、SPA或NHS；最为 优选的是SPA或NHS。

17.  根据权利要求10所述的化合物，其特征在于：透明质酸酶修饰物，酶比活性为大于30,000U/mg。

18.  一种制备权利要求10～17任意一项权利要求所述的重组人透明质酸酶聚乙二醇修饰化合物的方法，其特征在于该方法采用纯度大于95％的重组人透明质酸酶蛋白，采用平均分子量为5kd-20kd的活化聚乙二醇分子在pH值5～10、温度4～37℃、时间0.1～10小时进行修饰，聚乙二醇分子和人透明质酸酶的质量比为3∶1～30∶1。

19.  根据权利要求18所述的一种重组人透明质酸酶聚乙二醇修饰化合物的制备方法，其特征在于修饰反应的pH值控制在8.0-9.2；修饰反应的温度为2-25℃；修饰反应时间为0.5-2小时；聚乙二醇分子和人透明质酸酶的质量比为5∶1～15∶1。

20.  根据权利要求18所述的一种重组人透明质酸酶聚乙二醇修饰化合物的制备方法，其特征在于在修饰反应结束后采用离子交换柱SP sepharose fast flow去除未修饰的人透明质酸酶及游离聚乙二醇，以pH6.0、20mmol/L的磷酸盐缓冲液为上样缓冲液流速为10ml/min，以20mmol/L的磷酸盐、100-500mmol/L的氯化钠溶液为洗脱液，收集的蛋白洗脱峰为修饰蛋白峰。

重组人透明质酸酶及其制备方法和采用聚乙二醇共价修饰的化合物和方法
技术领域
本发明涉及用生物医药领域，尤其涉及重组人透明质酸酶及其制备方法和采用聚乙二醇共价修饰的化合物和方法。
背景技术
透明质酸酶(hyaluronidase,HAase)主要专一性水解透明质酸，广泛存在于真核和原核生物中，在动物机体内参与许多重要的生物学过程，例如细胞分裂、细胞间的连接、生殖细胞的活动、DNA的转染、胚胎发育、受伤组织的修复，以及正常细胞和肿瘤细胞增生，是一种重要的生理活性物质。且于1928年被Duran Reynals首次发现并称为“扩散因子”，1940年被Chain和Duthie正式命名为透明质酸酶。
其作用机理是通过催化透明质酸的水解，从而降低透明质酸的黏度，由此提高组织通透性，因此其作为一种重要的药物扩散剂，在临床上被广泛应用；除此之外，在美容领域也有广泛的应用，如整形修复，低分子量透明质酸生产等。
目前国内透明质酸酶基本来源是动物组织提取获得，存在纯度低(1-5％)、免疫原性强、易产生过敏反应等问题。
目前国外已有各种形式的透明质酸酶被制备和批准用于人的治疗用途。例如，源于动物的透明质酸酶制备品包括纯化的羊睾丸透明质酸酶(ISTAPharmaceuticals)和牛睾丸透明质酸酶(AmphastarPharmaceuticals)。(Halozyme Therapeutics)是人重组透明质酸酶，其通过经遗传工程修改的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞产生，所述CHO细胞含有编码可溶性rHuPH20的核酸。经FDA批准的对于透明质酸酶的治疗用途包括作为佐剂使用以提高用于皮下注入(皮下液体施用)的其它所注射的药物的吸收和分散，以及在皮下尿路造影术(subcutaneous urography)中作为助剂用以改善放射造影剂(radiopaque agent)的再吸收。在这些适应症之外，透明质酸酶包括sHuPH20，可作为治疗或美容药剂用于处理另外的疾病和状况。
在专利CN103614352A中，发明人公开了一种高效重组表达透明质酸酶的方法，通过在水蛭的透明质酸酶基因N端添加一段编码组氨酸的核苷酸序列，构建重组毕赤酵母工程菌株，不仅简化了透明质酸酶的纯化步骤，同时实现了重组透明质酸酶的高活性分泌表达。
在专利CN104263707A中，发明人公开了一种提高毕赤酵母重组表达透明质酸酶的方法，通过在水蛭的透明质酸酶基因前段融合一段信号肽序列，解决了原重组菌株产量较低的问题，实现了重组透明质酸酶在毕赤酵母中产量的显著提高，为进一步降低水蛭透明质酸酶的生产成本和扩大应用范围奠定了一定的基础，适合于工业化生产。
在专利CN101970650A中，发明人公开了一种可溶性透明质酸酶的大规模生产方法，将人的透明质酸酶基因通过基因工程手段加入中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中，所述CHO细胞含有编码可溶性rHuPH20的核酸，通过宿主细胞(CHO)培养发酵，得到可溶性透明质酸酶。
透明质酸酶的稳定性较差，其在机体内的主要不良反应是产生免疫反应，引起过敏反应。静脉注射血浆半衰期短，动物药代动力学研究表明该酶进入体内半衰期(T1/2)小于3分钟。聚乙二醇(polyethylene glycol)，简称PEG)修饰技术的应用使PEG的许多优良特性转移到修饰的透明质酸酶中去。当PEG偶联到透明质酸酶分子表面时，透明质酸酶的稳定性大大增强，同时可减少透明质酸酶药物的酶解，避免在肾脏的代谢中很快消除，并使透明质酸酶药物不易被免疫系统的细胞识别。PEG修饰的透明质酸酶药代动力学性质也发生很大的改变，半衰期延大大长。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种重组人透明质酸酶及其制备方法，该方法将人透明质酸酶基因整合入毕赤酵母工程菌中，通过发酵纯化，得到大量高活性高纯度的重组人透明质酸酶。本发明的二个目的是提供一种重组人透明质酸酶聚乙二醇修饰化合物及其制备方法，该化合物活性高、免疫原性低、稳定性好。
为了实现上述的第一个目的，本发明采用了以下的技术方案：
一种重组人透明质酸酶的制备方法，该方法包括以下的步骤：
1)表达载体的构建及转化毕赤酵母工程菌：
将人透明质酸酶基因片段插入到表达载体的酶切位点上，转化至E.coil TOP10中，在确保阅读框正确的前提下鉴定出重组表达质粒，重组质粒经Sac I线性化后电转入表达宿主毕赤酵母中(P.pastoris)，得到工程菌，其中所述的表达载体是pPIC系列载体；
2)阳性克隆的筛选、培养、诱导表达：
筛选出阳性克隆在培养基中进行培养，经诱导使目标蛋白表达；
3)表达产物的分离纯化：
收集发酵液，经离心得到发酵上清，然后对发酵上清用层析技术纯化；
上述的人透明质酸酶的cDNA序列如SEQ ID NO:1所示，编码一个序列如SEQ ID NO:2所示氨基酸的蛋白质；所述的人透明质酸酶的编码序列来源于基因文库，或者根据文献报道的人透明质酸酶的cDNA序列全基因合成，或者设计引物，通过PCR扩增获得。
作为优选，所述的pPIC系列载体是pPIC9k、pPICZa A、pPICZa B、pPICZa C中的一种或多种。
作为优选，所述的步骤1)中表达载体的酶切位点是Xho I/Xba I或BamHI/Not I位点。
作为优选，所述的步骤2)中阳性克隆筛选采用Zeocin做抗性筛选。
作为优选，所述的步骤2)中的培养温度控制在25-40℃，再优选的培养温度控制在30-35℃。
作为优选，所述的步骤2)中的诱导表达使用终浓度0.5％-1.5％(v/v)的甲醇作为诱导剂，再优选的诱导表达使用终浓度0.5％-1％(v/v)的甲醇。
作为优选，所述的步骤2)的诱导表达温度控制在25-40℃，再优选的诱导表达温度控制在30-35℃。
作为优选，所述的步骤3)中的层析技术是离子交换层析、分子筛层析、疏水层析中的一种或多种方法。
本发明还公开了上述任一项技术方案获得重组人透明质酸酶。
为了实现上述的第二个目的，本发明采用了以下的技术方案：
上述的重组人透明质酸酶聚乙二醇修饰化合物；聚乙二醇和重组人透明质酸酶以共价键连接，每个重组人透明质酸酶分子平均结合5～15个聚乙二醇分子，聚乙二醇修饰重组人透明质酸酶的酶比活性大于25,000U/mg。作为优选，酶比活性为大于30,000U/mg。
作为优选，所述的聚乙二醇为含单一活性功能基团的直链单甲氧基聚乙二醇，其结构式如下：

其中n为大于1的正整数，R为聚乙二醇的活性功能基团。
作为优选，所述的聚乙二醇的平均分子量为4kd-40kd；优选选用的聚乙二醇的平均分子量为5kd-40kd；最优选，聚乙二醇的平均分子量为5kd-20kd。
作为优选，所述的聚乙二醇通过酯键、醚键、硫醇键或者酰胺键与连接基团相连；优选的连接基团包括酯基、酰胺基、亚酰胺基、碳水化合物、顺丁烯二酰亚胺基团、环氧基、氧基羰基咪唑基、硝苯苯基、trysylate基、醛基、异氰酸酯基、乙烯砜基、酪氨酸基、半胱氨酸基、组氨酸基或伯基；作为再优选，所述的顺丁烯二酰亚胺基团为琥珀酸琥珀酰亚胺酯SS、丙酸琥珀酰亚胺酯SPA、羧甲酸琥珀酰亚胺酯SCM、琥珀酰亚胺基琥珀酰胺SSA、N-羟基琥珀酰亚胺NHS；氧基羰基咪唑基为羰基二咪唑基CDI；硝苯苯基为对碳酸硝基苯酯NPC或碳酸三氯苯酯TPC。
作为优选，所述的聚乙二醇通过胺酯键共价偶联到人透明质酸酶分子上。
作为优选，所述的聚乙二醇分子经活化后与透明质酸酶蛋白上氨基共价连接；作为优选，活化聚乙二醇是单甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺琥珀酸酯(mPEG-SS)、单甲氧基聚乙二醇琥珀酰 亚胺碳酸酯(mPEG-SC)、单甲氧基聚乙二醇N-羟基琥珀酰亚胺酯(mPEG-NHS)、单甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺丙酸酸酯(mPEG-SPA)、单甲氧基聚乙二醇羧甲酸琥珀酰亚胺酯(mPEG-SCM)、单甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺基琥珀酰胺(mPEG-SSA)、单甲氧基聚乙二醇丙醛(mPEG-ALD)、葡萄糖聚乙二醇NHS酯、半乳糖聚乙二醇NHS酯、甲氧基聚乙二醇碳酸酯(mPEG-SC)、单甲氧基聚乙二醇对甲苯磺酸酯(mPEG-Ots)、单甲氧基聚乙二醇对硝基苯酚碳酸酯(mPEG-OCOOPhNO2)、单甲氧基聚乙二醇五氟苯酚酯衍生物、α-甲氧基-聚乙二醇-ω-氨甲基(mPEG-CH2NH2)、α-甲氧基-聚乙二醇-ω-丙酸(mPEG-PA)、α-甲氧基-聚乙二醇-ω-丁酸(mPEG-BA)、α-甲氧基-聚乙二醇-ω-琥珀酰酯酸(mPEG-S)、α-甲氧基-聚乙二醇-ω-琥珀酰酯酸琥珀酰亚胺酯(mPEG-SS)或α-甲氧基-聚乙二醇-ω-[3-(3-马来酰亚胺基-1-氧丙基)氨基]丙基醚(mPEG-PPMAL)。
作为优选，所述的聚乙二醇分子经活化后与透明质酸酶蛋白的连接基为SS、SPA、SCM、SSA或NHS；其中更为优选的连接基为SS、SPA或NHS；最为优选的是SPA或NHS。
一种制备上述的重组人透明质酸酶聚乙二醇修饰化合物的方法，该方法采用纯度大于95％的重组人透明质酸酶蛋白，采用平均分子量为5kd-20kd的活化聚乙二醇分子在pH值5～10、温度4～37℃、时间0.1～10小时进行修饰，聚乙二醇分子和人透明质酸酶的质量比为3∶1～30∶1。
作为优选，所述的修饰反应的pH值控制在8.0-9.2；修饰反应的温度为2-25℃；修饰反应时间为0.5-2小时；聚乙二醇分子和人透明质酸酶的质量比为5∶1～15∶1。
作为优选，所述的在修饰反应结束后采用离子交换柱SP sepharose fast flow去除未修饰的人透明质酸酶及游离聚乙二醇，以pH6.0、20mmol/L的磷酸盐缓冲液为上样缓冲液流速为10ml/min，以20mmol/L的磷酸盐、100-500mmol/L的氯化钠溶液为洗脱液，收集的蛋白洗脱峰为修饰蛋白峰。
本发明采用基因工程技术将人透明质酸酶基因整合入毕赤酵母工程菌中，通过发酵纯化，得到大量高活性高纯度的重组人透明质酸酶。同时聚乙二醇修饰后的人透明质酸酶，当修饰程度为5-15/分子时，比活性为大于30,000U/mg；同时半衰期比原型酶增加了200-300倍，在小鼠体内半衰期T1/2为10小时；免疫原性比原型酶明显降低。同时，本发明的聚乙二醇修饰的人透明质酸酶与原型酶相比稳定性更好，生产成本更低。因此，本发明的聚乙二醇修饰的人透明质酸酶实现了高比活、长半衰期、低免疫原性、高稳定性、低成本等诸方面的均衡，具有产业化价值。
附图说明
图1为纯化的毕赤酵母表达人透明质酸酶：
1泳道：标准蛋白质分子量(97.4、66.2、43、31、20、14.4kd)；
2-4泳道：纯化的毕赤酵母表达人透明质酸酶。
图2为多分子PEG修饰人透明质酸酶电泳分析结果：
1泳道：未修饰人透明质酸酶；
2泳道：5kd PEG修饰人透明质酸酶；
3泳道：10kd PEG修饰人透明质酸酶；
4泳道：20kd PEG修饰人透明质酸酶；
5泳道：40kd PEG修饰人透明质酸酶；
图3为PEG与人透明质酸酶不同比例修饰产品电泳分析结果：
1泳道：未修饰人透明质酸酶；
2泳道：PEG与人透明质酸酶质量比例为3∶1；
3泳道：PEG与人透明质酸酶质量比例为5∶1；
4泳道：PEG与人透明质酸酶质量比例为7∶1；
5泳道：PEG与人透明质酸酶质量比例为10∶1。
图4为PEG修饰透明质酸酶的不同pH值修饰产品电泳分析结果：
1泳道：未修饰人透明质酸酶；
2泳道：修饰pH值为6；
3泳道：修饰pH值为6.5；
4泳道：修饰pH值为7；
5泳道：修饰pH值为7.5；
6泳道：修饰pH值为8；
7泳道：修饰pH值为8.5；
8泳道：修饰pH值为9；
9泳道：修饰pH值为9.2。
图5为PEG修饰透明质酸酶的不同时间产物电泳分析结果：
1泳道：修饰时间为0.5h；
2泳道：修饰时间为1h；
3泳道：修饰时间为2h；
4泳道：修饰时间为4h；
5泳道：修饰时间为8h。
图6为纯化后PEG修饰透明质酸酶电泳分析结果：
1-3泳道：纯化后的PEG修饰透明质酸酶。
图7为透明质酸酶及其PEG修饰物在不同pH值稳定性。
图8为透明质酸酶及其PEG修饰物在不同温度下的稳定性。
图9为透明质酸酶及其PEG修饰物在小鼠体内的活性变化曲线。
图10为PEG乙酸酯修饰透明质酸酶：
1泳道：活化PEG和透明质酸酶的质量比为4∶1；
2泳道：活化PEG和透明质酸酶的质量比为6∶1；
3泳道：活化PEG和透明质酸酶的质量比为8∶1；
4泳道：活化PEG和透明质酸酶的质量比为10∶1；
5泳道：活化PEG和透明质酸酶的质量比为15∶1。
图11为PEG碳酸酯修饰透明质酸酶：
1泳道：活化PEG和透明质酸酶的质量比为15∶1；
2泳道：活化PEG和透明质酸酶的质量比为10∶1；
3泳道：活化PEG和透明质酸酶的质量比为8∶1；
4泳道：活化PEG和透明质酸酶的质量比为6∶1；
5泳道：活化PEG和透明质酸酶的质量比为4∶1。
图12为PEG硝基苯酯修饰透明质酸酶：
1泳道：活化PEG和透明质酸酶的质量比为2∶1；
2泳道：活化PEG和透明质酸酶的质量比为4∶1；
3泳道：活化PEG和透明质酸酶的质量比为6∶1；
4泳道：活化PEG和透明质酸酶的质量比为8∶1；
5泳道：活化PEG和透明质酸酶的质量比为10∶1。
具体实施方式
下面结合具体实施例进一步说明本发明，但是并非限定本发明。
实施例一、重组人透明质酸酶的制备
重组人透明质酸酶的制备方法，包括如下步骤：(1)、人透明质酸酶基因的获得；(2)表达载体的构建及转化毕赤酵母工程菌：将合成的人透明质酸酶cDNA片段插入到表达载体的酶切位点，然后直接转化入毕赤酵母宿主菌；(3)、阳性克隆的筛选、培养、诱导表达：筛选出阳性克隆在培养基上进行培养，经诱导使目标蛋白表达；(4)、融合蛋白的分离、纯化：将毕赤酵母发酵液收集，经离心得到发酵液上清，然后对发酵液上清用层析技术纯化；(5)粗纯化后的蛋白进一步进行分离纯化。
重组人透明质酸酶基因的获得是通过全基因合成和通过设计引物，再PCR获得，表达载体pPICZa A，宿主菌为毕赤酵母P.pastoris SMDll68H，酶切位点是Xho I/Xba I，用Zeocin做抗性筛选，培养基培养的温度控制在30℃，诱导表达为每隔24h补加终浓度为0.5％(v/v)的甲醇作为诱导剂，诱导96小时，层析技术是离子交换层析、疏水层析和分子筛层析。
根据文献报道(Genebank NM153189)的人透明质酸酶cDNA序列，经过碱基优化,将模板基因中的稀有密码子同义替换P.pastoris的偏爱密码子，并去除富含AT区，以此为模板设计引物，上游引物(L1)：5’-TACTATTGCCAGCATTGCTGC-3’，下游引物(L2)：5’-一GGCAAATGGCATTCTGACA-3’，并在上下游引物分别引入限制性内切酶酶切位点Xho I、Xba I。使用该对引物扩增人透明质酸酶基因，对扩增获得的人透明质酸酶片段进行Xho I和Xba I双酶切，连接至具有相对应切口的表达载体上(载体pPICZa A经Xho I和Xba I双酶切)，转化至E.coil TOP10中，在确保阅读框正确的前提下鉴定出重组表达质粒pPICZa A-ph20，经DNA测序比对，重组序列正确。重组质粒经Sac I线性化后电转入表达宿主P.pastoris SMDll68H中，用Zeocin做抗性筛选，得到工程菌，重组克隆子经PCR验证正确。
接种阳性克隆进行培养，每隔24h补加终浓度为0.5％(v/v)的甲醇作为诱导剂，诱导96小时，取出发酵液，通过离心收集上清，DNS法测定酶活性，并进一步分离纯化。
将收集到的破菌上清液用离子交换层析法分离纯化，其过程为用pH值为6.0的20mmol/L磷酸盐缓冲液稀释，使其电导率小于5mS/cm。用同样的缓冲液平衡SP-Sepharose Fast Flow柱，上样后用平衡缓冲液洗至基线，用0.01～0.5mol/L的NaCL梯度洗脱，收集目标蛋白峰。
目标蛋白补加(NH₄)₂SO₄使终浓度为1.0-1.5mol/L，样品上用1.2mol/L(NH₄)₂SO₄，20mmol/L PB，pH值6.0的缓冲液平衡的Phenyl-Sepharose Fast Flow柱，通过降低盐浓度梯度洗脱，收集目标蛋白峰。
得到的疏水层析峰经Sephadex G-25脱盐，平衡液为20mmol/L PB，pH值6.0。样品脱盐后即为精细纯化的人透明质酸酶，SDS-PAGE分析产品纯度，结果见图1，样品纯度大于95％。
实施例二、重组人透明质酸酶的活性测定
采用3,5-二硝基水杨酸比色法测量水解透明质酸产生的还原糖量。反应体系为1mL，用pH5.5、50mM的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液配置2mg/mL的透明质酸，反应体系加入900μL的透明质酸溶液、100μL的供试品，混合均匀后在38℃反应20min，立即沸水煮5min终止反应，离心去除变性蛋白沉淀；采用DNS法测定产生的还原糖当量(相当于等量葡萄糖的还原力)，计算供试品的活性。根据蛋白浓度计算酶的比活性。纯化的人透明质酸酶的比活性为大于100,000U/mg。
实施例三、不同分子量聚乙二醇修饰人透明质酸酶
1、修饰产物的制备
纯化的毕赤酵母表达人透明质酸酶纯度大于95％，浓度2.0mg/ml，用G-25柱交换缓冲液，配制平衡缓冲液0.1mol/L Na₂PO₄，20mmol/L NaCl，流速10ml/min，待柱流出液达到平衡后上样，收集蛋白峰。将不同分子量的单甲氧基PEG丙酸酯按质量比10∶1加入到改变缓冲体系的透明质酸酶中，室温搅拌修饰2小时后终止反应。用50KD的超滤膜将透明质酸酶PEG反应混合物对20mmo/L PB，pH值7.0缓冲液超滤去除游离PEG即为透明质酸酶PEG修饰物原液。
对修饰产物进行SDS-PAGE分析，电泳结果表明该修饰物为多分子PEG修饰的透明质酸酶，见附图2。
参考Habeeb A.F.等(1966)Determination of free amino groups in proteins byTrinitrobenzenesulfonic acid.Analytical Biochemistry(14：328-336)方法测定修饰后蛋白的PEG修饰率。用20mmol/L PB缓冲液，pH值8.0透析处理透明质酸酶和PEG修饰透明质酸酶，准确测定蛋白质浓度，精确配制成1.0mg/ml。精确量取1.0mg/ml的透明质酸酶溶液0、40、80、120、200、300、400μl分别置于试管中，加pH值8.0的20mmol/L PB缓冲液至1ml，然后加入pH值9.16的NaHCO₃-Na₂CO₃缓冲液1ml，再加入0.1％TNBS溶液1ml，在混合振荡器上剧烈振荡。对1mg/ml的PEG修饰透明质酸酶溶液重复以上操作。40℃反应2h，然后分别加入10％SDS溶液1ml，再分别加入1N HCl 0.5ml。测定OD335nm的吸收值，绘制标准曲线。计算修饰的蛋白斜率/未修饰的蛋白斜率。
PEG修饰透明质酸酶伯胺残基的数量＝[1-(PEG修饰透明质酸酶的斜率/透明质酸酶斜率)]×透明质酸酶伯胺残基的总数量。
修饰率＝[1-(PEG修饰透明质酸酶的斜率/透明质酸酶斜率)]×100％。
实验结果见表一。
表一、PEG透明质酸酶的修饰度测定结果

2、修饰产物的体外活性测定
按照实施例1的方法测定修饰产物的酶活性，结果见表二。
表二、透明质酸酶PEG多分子修饰活性结果