一种高通量快速提取蔬菜单粒种子DNA的方法.pdf

本发明公开了一种高通量快速提取蔬菜单粒种子DNA的方法，它是将种子破壳发育至初期幼苗的单株，利用手持式电动破碎仪将待测单株样品在1.5mL尖底儿离心管中研磨至粉末，然后加入100μL10%Chelex-100溶液，65℃水浴20min，迅速冰上冷冻10min，13200rpm/min，离心3min，吸取上清即为样品DNA，可直接用于PCR扩增。本发明采用的DNA提取方法，35分钟就可以完成样品DNA提取的全过程。所提取的DNA质量标准满足了后续PCR扩增的要求，更适合于育种产业品种选育、纯度鉴定过程中高通量快速提取样品DNA的目的，具有高效、快速、低成本、操作简便等优势。

1.  一种高通量快速提取蔬菜单粒种子DNA的方法，其特征在于它按如下步骤进行：
（1）取待测植物样本100mg加入1.5mL灭菌离心管中，利用手持式电动破碎仪研磨至粉末；
（2）加入100μL10%Chelex-100溶液，涡旋充分混匀，置于65℃水浴锅中恒温水浴20min；
（3）水浴后迅速冰上冷冻10min，13200rpm/min，离心3min，取上清，保存，用于后续PCR扩增。

2.  如权利要求1所述的提取方法，其中所述的待测样本为植物样品包括花椰菜、大白菜、黄瓜、芹菜等各类蔬菜植物样品。

3.  如权利要求1所述的提取方法，其中所述的待测样本为植物种子破壳发育至初期幼苗的新鲜单株样品。

4.  如权利要求1所述的方法，其中所述的Chelex-100溶液浓度为10%，加入量为100μL；恒温水浴温度为65℃，时间为20min；离心速度为13200rpm/min，时间为3min。

一种高通量快速提取蔬菜单粒种子DNA的方法
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，涉及模板DNA的制备方法，是一种高效、快速、低成本、操作简便的高通量蔬菜单粒种子DNA提取方法。
背景技术
分子生物学技术已经渗透到生物学、医学、植物学、遗传学和动物学等各个方面。植物DNA的提取是进行分子分析的最基本步骤，在植物基因工程以及植物分子生物学研究中占有重要地位，所提取出的DNA质量的好坏将直接关系到后期分子生物学试验研究的成败。基于PCR技术的分子标记已广泛地运用于种子纯度鉴定、亲缘关系的分析、分子标记辅助育种、基因定位以及转基因植株检测等。其中以PCR技术为基础的标记如简单重复序列标记(SSR标记或微卫星标记)，由于其具有多态性好、可靠性高、技术简单、价格便宜和DNA模板使用量低等优点，在分子生物学中得到了广泛的应用。长期以来，单粒种子样本中DNA的提取一直是耗时、繁琐的过程，严重减慢了检测速度。因此，许多学者一直在探索蔬菜单粒种子DNA的高通量快速提取方法。
目前国内外研究发现并使用的DNA提取方法有很多，主要有传统法、螯合树脂法、磁珠法、免疫亲合法等。
（1）传统法通过CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）或SDS（十二烷基硫酸钠）裂解细胞，酚/氯仿等有机溶剂抽提蛋白，能够有效地去除多糖及酚类物质的沉淀，因而适用于从含酚类及糖类物质较高的植物材料中提取DNA，获得的DNA纯度高，含量多。但比较费时，需要5小时甚至更多，流程繁琐，同时样品需要4-5个EP管，容易造成混淆和污染，操作复杂。而且提取过程中使用了大量的有机溶剂，有损实验人员的健康。
（2）磁珠法靠磁珠吸附、磁场分离提取DNA，适用于冰冻、陈旧组织，简单、快速整个过程仅需不到2小时，利用磁场分离可以得到较纯的DNA，但产量比传统法获得的少，且成本较高。
（3）免疫亲合法通过抗原抗体反应来提取DNA，适用于样本含量很少的标 本，获得的DNA纯度高，含量多。缺点是设备要求比较高，不易普及，而且抗DNA单克隆抗体制备是关键步骤。
（4）螯合树脂法使用Chelex-100树脂来提取DNA，据报道该方法目前用于细菌、血液及部分病毒核酸提取，操作简单、快速、且成本不高。同时避免使用酚氯仿等有机溶剂，对操作人员没有损害。
Chelex-100是一种化学整合树脂，由苯乙烯、二乙烯苯共聚体组成。含有成对的亚氨基二乙酸盐离子，整合多价金属离子，尤其是选择性整合二价离子，比普通离子交换剂具有更高的金属离子选择性和较强的结合力.能结合许多可能影响一步分析的其他外源物质。通过离心除去Chelex-100颗粒，使这些与Chelex-100结合的物质与DNA分离，防止结合到Chelex中的抑制剂或杂质带到PCR反应中，影响下一步的DNA分析，并通过结合金属离子，防止DNA降解，并提高PCR扩增成功率。1989年Singer.Sam等最先报导了用Chelex-l00法提取组织培养细胞DNA，1991年Walsh等系统的研究了该方法在多种法医生物检材中的具体应用。目前Chelex-100法已经逐渐扩展到其他学科，用此法提取的DNA操作简便，并可以减少提取过程中DNA的损失，常用于十分微量的样品中（如毛发、血液、精斑和上皮脱落细胞中等）中提取足量的DNA。本发明利用Chelex-100对单粒种子破壳发育至初期幼苗的新鲜单株样品进行高通量快速提取，提高了育种产业品种选育和纯度鉴定过程的检测效率。
发明内容
本发明的目的在于克服传统样本DNA提取步骤多、复杂、费时等缺点，公开了一种高通量快速提取蔬菜单粒种子DNA的方法。本发明的DNA提取方法具有高效、快速、低成本、操作简便等优势。
为实现上述目的，本发明提供如下的技术方案：
一种高通量快速提取蔬菜单粒种子DNA的方法，其特征在于它按如下步骤进行：
（1）取待测植物样本100mg加入1.5mL灭菌离心管中，利用手持式电动破碎仪研磨至粉末；
（2）加入100μL10%Chelex-100溶液，涡旋充分混匀，置于65℃水浴锅中恒温水浴20min；
（3）水浴后迅速冰上冷冻10min，13200rpm/min，离心3min，取上清，保存，用于后续PCR扩增。
本发明所述的待测样本为植物样品包括花椰菜、大白菜、黄瓜、芹菜等各类蔬菜植物样品。本发明所述的待测样本为植物种子破壳发育至初期幼苗的新鲜单株样品。
本发明所述的Chelex-100溶液浓度为10%，加入量为100μL；恒温水浴温度为65℃，时间为20min；离心速度为13200rpm/min，时间为3min。
为了能更加清楚的说明本发明的提取方法，下面以大白菜为样本实例，对本发明的提取方法与传统的CTAB法分别加以比较对照说明。
一、材料和方法
（1）样品：大白菜杂交种，由天津科润蔬菜研究所提供。
（2）主要仪器：高速冷冻离心机，PCR扩增仪，恒温水浴锅，凝胶电泳设备。
（3）主要试剂：
EST-PCR引物由上海生工公司合成，引物序列见表1。
2×Master Mixes试剂购自Promega公司。
Chelex-100购自sigma公司。
10%Chelex-100溶液：称量10g Chelex-100，加入90mL去离子水，121℃灭菌，用时混匀。
CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）提取缓冲液：1000mL水中溶解CTAB20g，Tris12.11g，NaCl81.82g，Na2EDTA7.44g，高压灭菌。
表1大白菜纯度鉴定EST-SSR引物序列

二、大白菜杂交种DNA的两种提取方法的比较
1、CTAB法提取DNA
（1）取大白菜杂交种单株幼苗约100mg，利用手持式电动破碎仪研磨至粉末；
（2）加入800μL预热至65℃的CTAB提取缓冲液，充分混合，65℃水浴60min，期间不停颠倒混匀；
（3）13200rpm/min离心10min，转移上清至一新离心管，加入500μL的氯仿异戊醇，充分混匀，13200rpm/min离心10min，转移上清至一新离心管；重复1次；
（4）加入2倍体积的CTAB沉淀缓冲液，混匀，室温静置60min；13200rpm/min离心10min，弃上清；
（5）沉淀中加入350μL氯化钠溶液溶解沉淀，再加入350μL氯仿异戊醇，充分混匀，13200rpm/min离心10min，转移上清至一新离心管；
（6）加入0.6倍体积异丙醇，混匀，13200rpm/min离心10min，弃上清；
（7）沉淀中加入500μL70%乙醇溶液，13200rpm/min离心10min，弃上清； 重复1次；干燥沉淀，加入100μL灭菌去离子水溶解DNA。
2、本发明方法提取DNA
（1）取大白菜杂交种单株幼苗约100mg加入1.5mL灭菌离心管中，利用手持式电动破碎仪研磨至粉末；
（2）加入100μL10%Chelex-100溶液，涡旋充分混匀，置于65℃水浴锅中恒温水浴20min；
（3）水浴后迅速冰上冷冻10min，13200rpm/min，离心3min，取上清，保存，用于后续PCR扩增。
三、两种方法提取DNA的PCR扩增检测试验：
1、PCR反应体系组成：
2×Master Mixes5μL，上游和下游引物10μmol/L各0.25μL，供试品种大白菜基因组DNA模板，浓度50ng/μL，1μL，双蒸水补足10μL；
2、PCR反应程序：
94℃预变性5min，35个扩增循环（94℃1min，53.5℃45sec，72℃45sec）；72℃延伸7min，4℃保存；
3、产物鉴定：8%非变性聚丙烯凝胶电泳
电泳条件，电压：250V；时间：30min。
银染观察，用20bp Marker做分子量标记。
4、PCR扩增结果：
对两种方法提取的DNA，分别进行大白菜纯度鉴定引物BC1、BC9、BC26的扩增，非变性聚丙烯凝胶电泳结果见附图。结果显示，两种方法提取DNA的扩增结果是基本一致的。
本发明与传统技术相比具有的积极效果在于：
（1）传统DNA提取操作步骤多、复杂、费时。需要经过裂解、抽提等多个步骤，同时需要在多个离心管之间相互转移样本，增加了对样本间交叉污染的可能性。另外，氯仿等有机溶剂对人体有害。而本发明的DNA提取方法过程简便、整个提取过程在同一离心管中即可完成，同时无需使用有毒有机溶剂，对人体和环境都不会造成危害。
（2）本方法最大的优点在于其过程快速，简便，充分提高了育种产业品种 鉴定和纯度鉴定的检测效率。与传统的提取过程需要5小时左右相比，采用本方法，35min就可以完成样本DNA提取的全过程。
（3）采用本发明的快速提取样本DNA的方法所得到的DNA经PCR检测实验，证实与传统方法得到的DNA基本一致，完全可以采用此方法替代复杂、费时的传统CTAB法，从而大大节省了时间。
附图说明:
图1为EST-SSR引物BC1用于大白菜品种扩增产物的电泳分析图谱；自左向右依次为大白菜品种“秋绿75”、大白菜品种“津秋78”（传统CTAB法）；大白菜品种“秋绿75”、大白菜品种“津秋78”（本发明方法）；
图2为EST-SSR引物BC9用于大白菜品种扩增产物的电泳分析图谱；自左向右依次为大白菜品种“秋绿75”、大白菜品种“秋绿60”（传统CTAB法）；大白菜品种“秋绿75”、大白菜品种“秋绿60”（本发明方法）；
图3为EST-SSR引物BC26用于大白菜品种扩增产物的电泳分析图谱；自左向右依次为大白菜品种“秋绿75”、大白菜品种“津秋78”（传统CTAB法）；大白菜品种“秋绿75”、大白菜品种“津秋78”（本发明方法）；
图4为花椰菜EST-SSR引物HYC33扩增产物的电泳分析图谱；自左向右依次为1-5为本发明方法提取DNA的母本O5H2扩增产物；6-25为本发明方法提取DNA的20株“津品70”F1代杂交种花椰菜扩增结果；26-30为本发明方法提取DNA的父本G×H扩增结果。
图5为大白菜EST-SSR引物BC1扩增产物的电泳分析图谱；自左向右依次为M为20bpMarker；1-43为本发明方法提取DNA的43株大白菜品种“秋绿75”杂交种扩增结果。
图6为大白菜EST-SSR引物BC9扩增产物的电泳分析图谱；自左向右依次为M为20bpMarker；1-37为本发明方法提取DNA的37株大白菜品种“津白56”杂交种扩增结果。
图7为大白菜EST-SSR引物BC9扩增产物的电泳分析图谱；自左向右依次为M为20bpMarker；1-46为本发明方法提取DNA的46株大白菜品种“秋绿60”杂交种扩增结果。
具体实施方式
为了能更加清楚的说明本发明的方法，下面结合实施例对本发明做进一步的描述。
实施例1
以供试花椰菜品种“津品70”杂交种为样本，采用本发明方法快速提取DNA。制备方法如下：
（1）取花椰菜杂交种单株幼苗约100mg加入1.5mL灭菌离心管中，利用手持式电动破碎仪研磨至粉末；
（2）加入100μL10%Chelex-100溶液，涡旋充分混匀，置于65℃水浴锅中恒温水浴20min；
（3）水浴后迅速冰上冷冻10min，13200rpm/min，离心3min，取上清，保存，用于后续PCR扩增。
PCR检测：
1、对花椰菜EST-SSR纯度鉴定引物HYC33进行扩增，引物序列为：
HYC33-F：5'-AGACTTCGTCGATCCACCTG-3'
HYC33-R：5'-GACCTCGTCCTCCTCTTCCT-3'
2、反应体系：
2×Master Mixes5μL，HYC33上游和下游引物10μmol/L各0.25μL，供试品种基因组DNA模板（100ng/μL）1μL，双蒸水补足10μL。
3、反应程序：
95℃预变性2min，32个扩增循环（94℃40sec，56℃45sec，72℃1min）；72℃延伸7min，4℃保存。
4、产物鉴定：8%非变性聚丙烯凝胶电泳
电泳条件，电压：250V；时间：30min。
银染观察，用20bp Marker做分子量标记。
5、结果：花椰菜HYC33扩增结果见图4。其中，1-5为本发明方法提取DNA的母本O5H2扩增产物；6-25为本发明方法提取DNA的20株“津品70”F1代杂交种花椰菜扩增结果；26-30为本发明方法提取DNA的父本G×H扩增结果。
实施例2
以供试大白菜品种“秋绿75”杂交种为样本，采用本发明方法快速提取DNA。制备方法如下：
（1）取大白菜杂交种单株幼苗约100mg加入1.5mL灭菌离心管中，利用手持式电动破碎仪研磨至粉末；
（2）加入100μL10%Chelex-100溶液，涡旋充分混匀，置于65℃水浴锅中恒温水浴20min；
（3）水浴后迅速冰上冷冻10min，13200rpm/min，离心3min，取上清，保存，用于后续PCR扩增。
PCR检测：
1、对大白菜EST-SSR纯度鉴定引物BC1进行扩增，引物序列为：
BC1-F：5'-TTTGTCCCTATTGCTCAGGG-3'
BC1-R：5'-CCGAGAACGTCTTCTCCTTG-3'
2、反应体系：
2×Master Mixes5μL，上游和下游引物10μmol/L各0.25μL，供试品种大白菜基因组DNA模板，浓度50ng/μL，1μL，双蒸水补足10μL。
3、反应程序：
PCR反应程序为94℃预变性5min，35个扩增循环（94℃1min，53.5℃45sec，72℃45sec）；72℃延伸7min，4℃保存。
4、产物鉴定：8%非变性聚丙烯凝胶电泳
电泳条件，电压：250V；时间：30min。
银染观察，用20bp Marker做分子量标记。
5、结果：大白菜BC1扩增结果见图5。其中，M为20bpMarker；1-43为本发明方法提取DNA的43株大白菜品种“秋绿75”杂交种扩增结果。
实施例3
以供试大白菜品种“津白56”杂交种为样本，采用本发明方法快速提取DNA。制备方法如下：
（1）取大白菜杂交种单株幼苗约100mg加入1.5mL灭菌离心管中，利用 手持式电动破碎仪研磨至粉末；
（2）加入100μL10%Chelex-100溶液，涡旋充分混匀，置于65℃水浴锅中恒温水浴20min；
（3）水浴后迅速冰上冷冻10min，13200rpm/min，离心3min，取上清，保存，用于后续PCR扩增。
PCR检测：
1、对大白菜EST-SSR纯度鉴定引物BC9进行扩增，引物序列为：
BC9-F：5'-ACCTTCCGTCTCTGGGTCTT-3'
BC9-R：5'-TTTTGAACGAGGTGGAGGAC-3'
2、反应体系：
2×Master Mixes5μL，上游和下游引物10μmol/L各0.25μL，供试品种大白菜基因组DNA模板，浓度50ng/μL，1μL，双蒸水补足10μL。
3、反应程序：
PCR反应程序为94℃预变性5min，35个扩增循环（94℃1min，53.5℃45sec，72℃45sec）；72℃延伸7min，4℃保存。
4、产物鉴定：8%非变性聚丙烯凝胶电泳
电泳条件，电压：250V；时间：30min。
银染观察，用20bp Marker做分子量标记。
5、结果：大白菜BC9扩增结果见图6。其中，M为20bpMarker；1-37为本发明方法提取DNA的37株大白菜品种“津白56”杂交种扩增结果。
实施例4
以供试大白菜品种“秋绿60”杂交种为样本，采用本发明方法快速提取DNA。制备方法如下：
（1）取大白菜杂交种单株幼苗约100mg加入1.5mL灭菌离心管中，利用手持式电动破碎仪研磨至粉末；
（2）加入100μL10%Chelex-100溶液，涡旋充分混匀，置于65℃水浴锅中恒温水浴20min；
（3）水浴后迅速冰上冷冻10min，13200rpm/min，离心3min，取上清，保 存，用于后续PCR扩增。
PCR检测：
1、对大白菜EST-SSR纯度鉴定引物BC9进行扩增，引物序列为：
BC26-F：5'-ATAACAACAACCTGCCCGAG-3'
BC26-R：5'-GAAGCACAAGAACAGGGCTC-3'
2、反应体系：
2×Master Mixes5μL，上游和下游引物10μmol/L各0.25μL，供试品种大白菜基因组DNA模板，浓度50ng/μL，1μL，双蒸水补足10μL。
3、反应程序：
PCR反应程序为94℃预变性5min，35个扩增循环（94℃1min，53.5℃45sec，72℃45sec）；72℃延伸7min，4℃保存。
4、产物鉴定：8%非变性聚丙烯凝胶电泳
电泳条件，电压：250V；时间：30min。
银染观察，用20bp Marker做分子量标记。
5、结果：大白菜BC9扩增结果见图7。其中，M为20bpMarker；1-46为本发明方法提取DNA的46株大白菜品种“秋绿60”杂交种扩增结果。