一种高效发酵生产L丙氨酸的大肠杆菌.pdf

本发明公开了一种高效发酵生产L-丙氨酸的大肠杆菌，属于微生物代谢工程技术领域。本发明提供的大肠杆菌(Escherichia coli)CGMCC No.10628的染色体上副产物乙酸、甲酸、乙醇、琥珀酸、乳酸合成途径编码基因ackA-pta、pflB、adhE、frdA、ldhA被删除，且其染色体dadX基因被替换为丙氨酸脱氢酶基因。利用该重组菌在28～45℃条件下发酵26h，产生106g/L或以上具有高光学纯度和高化学纯度的L-丙氨酸，整个发酵过程生产强度达到4.27g/L·h或以上。

1.  一种高效发酵生产L-丙氨酸的大肠杆菌，已于2015年3月16日保藏于中国微生物 菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科 学院微生物研究所，分类命名为大肠埃希氏菌(Escherichia coli)，保藏编号为CGMCC No. 10628。

2.  一种应用权利要求1所述大肠杆菌生产L-丙氨酸的方法，其特征在于，分两阶段控 制发酵温度，在第一阶段，控制较低培养温度，使菌体快速生长而不合成L-丙氨酸，然后在 第二阶段，提高培养温度，进行L-丙氨酸的合成。

3.  根据权利要求2所述的方法，其特征在于，第一阶段在28～35℃好氧条件下培养菌体， 使菌体快速生长；至菌体生长到对数中后期，进入第二阶段，于40～45℃好氧培养菌体片刻， 然后进入限氧发酵产L-丙氨酸的阶段。

4.  根据权利要求2所述的方法，其特征在于，将活化后的大肠杆菌接种于装液量60％ 的发酵罐中，进行两阶段发酵，(1)好氧阶段培养：初始空气通量为3L/min，搅拌桨转速为 200r/min，此时的溶解氧浓度设定为100％，菌体生长过程中调节空气通量直至7L/min，同 时将搅拌转速与DO值关联来控制溶解氧浓度始终大于30％；控制pH值为7.0，发酵温度 28～35℃；(2)限氧阶段培养：当至菌体生长到对数中后期，升高温度至40～45℃继续好氧培 养45min；然后再进入限氧发酵产酸阶段：空气通量调为零，搅拌桨转速控制为100r/min， 控制pH值为7.0，发酵温度为40～45℃，并补加三次浓度为600g/L的葡萄糖，每次补加200 mL，以维持发酵过程中发酵液残糖浓度高于10g/L，当所有补加的葡萄糖消耗尽后即结束发 酵。

5.  根据权利要求2-4任一所述的方法，其特征在于，以葡萄糖为唯一碳源。

6.  根据权利要求5所述的方法，其特征在于，每升发酵培养基含：30g葡萄糖，15.11g  Na₂HPO₄·12H₂O，3g KH₂PO₄，1g NH₄Cl，0.5g NaCl，13.2g(NH₄)₂SO₄，并补加1‰1mol/L  MgSO₄和1‰的微量元素母液；每升微量元素含：2.4g FeCl₃·6H₂O，0.3g CoCl₂·6H₂O，0.15g  CuCl₂·2H₂O，0.3g ZnCl₂，0.3g Na₂MO₄·2H₂O，0.075g H₃BO₃，0.495g MnCl₂·4H₂O。

7.  权利要求1所述大肠杆菌在制备L-丙氨酸中的应用。

一种高效发酵生产L-丙氨酸的大肠杆菌
技术领域
本发明涉及一种高效发酵生产L-丙氨酸的大肠杆菌，属于微生物代谢工程技术领域。
背景技术
L-丙氨酸是最小的手性分子之一，被用于医药和兽药行业，与其他L-型氨基酸共同用作 手术前和手术后的营养剂。由于L-丙氨酸具有甜味，也被用于食品添加剂。此外，丙氨酸也 可用于合成改性耐热塑料，例如(PA)s、poly(ester-amide)s(PEA)s、poly(ester-amide-sulfide)s (PEAS)s以及poly(ester-imide)s(PEI)s等。然而L-丙氨酸生产成本高，使其应用受到限制。
近年来，利用基因工程手段，将外源丙氨酸脱氢酶基因引入E.coli菌株，在E.coli中实 现了L-丙氨酸的合成(Lee M.et al.,Appl Microbiol Biotechnol,2004,65:56-60；Smith G.M.et  al.,Biotechnol Lett,2006,28:1695-1700；Zhang X.et al.,Appl Microbiol Biotechnol,2007, 77:355-366)。Smith等(Smith G.M.et al.,Biotechnol Lett,2006,28:1695-1700)将来源于Bacillus  sphaericus的alaD基因克隆于质粒载体上，并在E.coli ALS929(pfl pps poxB ldhA aceEF)菌株 中表达，可利用复杂培养基合成88g/L丙氨酸，丙氨酸合成阶段体积生产强度达到4g/L·h。 Zhang等(Zhang X.et al.,Appl Microbiol Biotechnol,2007,77:355-366)将来源于Geobacillus  stearothermophilus的alaD基因整合于重组E.coli SZ194染色体上，经驯化后，最终菌株XZ132 (pflB frd adhE  ackA mgsA dadX ldhA::alaD)经48h发酵，可利用无机盐培养基以及120g/L葡 萄糖合成1279mmol丙氨酸，整个发酵过程中丙氨酸生产强度为2.37g/L·h，丙氨酸转化率达 到95g/100g葡萄糖，L-丙氨酸光学纯度达到99.5％，是目前利用重组E.coli菌株进行L-丙 氨酸合成的最高产量。
本发明以野生型E.coli B100为出发菌株，构建出高效合成L-丙氨酸的新型E.coli重组 菌株。通过控制温度，在菌体生长阶段关闭重组菌株L-丙氨酸的合成，避免产物对菌体生长 的抑制和竞争作用；在L-丙氨酸合成阶段，高效开启L-丙氨酸合成途径，以葡萄糖为唯一碳 源进行L-丙氨酸的高水平合成，不需要添加一些昂贵的化合物进行诱导，不需用惰性气体控 制严格的厌氧环境，具有更好的应用前景。
发明内容
本发明要解决的第一个技术问题是提供一种能以廉价原料和粗放发酵条件，高效生产高 光学纯度和高化学纯度L-丙氨酸的大肠杆菌62ALA。
所述菌株分类命名为大肠埃希氏菌(Escherichia coli)，已于2015年3月16日，保藏于 中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院 3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.10628。
所述菌株的染色体上副产物乙酸、甲酸、乙醇、琥珀酸、乳酸的合成途径编码基因 ackA-pta、pflB、adhE、frdA、ldhA被敲除。
所述菌株的染色体上dadX基因处整合了来源于嗜热菌Geobacillus stearothermophilus的 丙氨酸脱氢酶基因alaD。
本发明还提供一种应用所述重组菌发酵生产L-丙氨酸的方法，分两阶段控制发酵温度， 在第一阶段，控制较低培养温度，使菌体快速生长而不合成L-丙氨酸，然后在第二阶段，提 高培养温度，进行L-丙氨酸的合成。
在本发明的一种实施方式中，第一阶段在28～35℃好氧条件下培养菌体，使菌体快速生 长；至菌体生长到对数中后期，进入第二阶段，于40～45℃好氧培养菌体片刻，然后进入限 氧发酵产L-丙氨酸的阶段。
在本发明的一种实施方式中，将活化后的大肠杆菌接种于装液量60％的发酵罐中，进行 两阶段发酵，(1)好氧阶段培养：初始空气通量为3L/min，搅拌桨转速为200r/min，此时的 溶解氧浓度设定为100％，菌体生长过程中调节空气通量直至7L/min，同时将搅拌转速与DO 值关联来控制溶解氧浓度始终大于30％；使用NH₄OH和10％(v/v)H₂SO₄维持pH值为7.0， 发酵温度控制为28～35℃；当至菌体生长到对数中后期，升高温度至40～45℃继续好氧培养 45min，再进入限氧发酵产酸阶段；(2)限氧阶段培养：空气通量调为零，搅拌桨转速控制 为100r/min，添加NH₄OH来维持pH值为7.0，发酵温度为40～45℃，并补加三次浓度为600 g/L的葡萄糖，每次补加200mL，以维持发酵过程中发酵液残糖浓度高于10g/L，当所有补 加的葡萄糖消耗尽后即结束发酵。
在本发明的一种实施方式中，发酵培养基成分为(/L)：30g葡萄糖，15.11g  Na₂HPO₄·12H₂O，3g KH₂PO₄，1g NH₄Cl，0.5g NaCl，13.2g(NH₄)₂SO₄，并补加1‰(v/v)1 mol/L MgSO₄和1‰(v/v)的微量元素母液。微量元素成分为(/L)：2.4g FeCl₃·6H₂O，0.3g  CoCl₂·6H₂O，0.15g CuCl₂·2H₂O，0.3g ZnCl₂，0.3g Na₂MO₄·2H₂O，0.075g H₃BO₃，0.495g  MnCl₂·4H₂O。
本发明的有益之处体现在：
1、本发明提供的重组菌，在基因组中删除了合成副产物的基因，并整合了表达了启动子 及丙氨酸脱氢酶编码基因alaD，具有明显的高产L-丙氨酸的能力，菌种在28～45℃的条件下 发酵26h，产L-丙氨酸水平达到106g/L或以上，整个发酵过程生产强度达到4.27g/L·h以上。
2、本发明的L-丙氨酸高产菌在L-丙氨酸发酵中，基本没有有机酸等副产物以及D-丙氨 酸的合成，保障了L-丙氨酸产品具有高化学纯度及高光学纯度。
3、本发明的L-丙氨酸高产菌利用葡萄糖为唯一碳源高效生产L-丙氨酸，发酵过程中不 需添加特殊的底物或诱导剂，不需用惰性气体严格控制厌氧条件，具有生产成本低的优点。
生物材料保藏
一种大肠埃希氏菌(Escherichia coli)，已于2015年3月16日保藏于中国微生物菌种保 藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微 生物研究所，保藏编号为CGMCC No.10628。
附图说明
图1：大肠杆菌CGMCC No.10628丙氨酸发酵过程；■：丙氨酸；●：细胞干重(DCW)。 虚线箭头指示时间是培养温度由28～35℃转为40～45℃。虚线将发酵过程划分为好氧培养阶段 (左)和限氧培养阶段(右)。箭头表示分别向发酵罐中添加120g(A)、120g(B)和120g(C) 葡萄糖的时间。
具体实施方式
以下实施例涉及的有关方法：
①菌体量测定方法：菌体密度采用浊度法间接测量，通过OD₆₀₀来表示，并通过下列公 式换算为菌体干重。菌体干重(DCW)和OD₆₀₀的关系：1OD₆₀₀＝0.38g/L DCW。
②葡萄糖测定方法：葡萄糖用SBA-40E葡萄糖生物传感仪(山东省科学院生物研究所)进 行分析。
③有机酸测定方法：有机酸含量用高压液相色谱进行分析，检测器为UV(210nm)检测器， 色谱柱为Prevail Organic Acid 5u(Grace Davison Discovery Sciences)，流动相为25mmol/L  KH₂PO₄(pH 2.5)，流速为1mL/min，柱温为室温。
④氨基酸测定方法：样品适当稀释后再用苯基异硫酸酯(PITC)进行衍生。衍生步骤为： 500μL样品中加入250μL 0.1mol/L PITC乙腈溶液和250μL 1mol/L三乙胺乙腈溶液，充分 混匀，避光室温放置1h，加入500μL正己烷溶液，涡旋振荡器振荡1min，静置60min，吸 取下层溶液，用0.45μm有机滤膜过滤后进行高压液相检测。色谱柱为AccQ·Tag 3.9×150mm (Waters)。流动相A液为80％(v/v)乙腈水溶液，B液为97:3(v/v)的0.1mol/L乙酸钠-乙腈溶 液。采用梯度洗脱：0-20min，B液由95﹪下降到80﹪；20-30min，B液由80﹪上升到95 ﹪；30-40min，B液梯度不变。检测波长为254nm，柱温为室温。
⑤乙醇测定方法：乙醇含量用SBA-40E葡萄糖生物传感仪(山东省科学院生物研究所)进 行分析。
实施例1 大肠杆菌CGMCC No.10628的获得
以E.coli B100为出发菌株，用Datsenko等(Datsenko K.A.et al.,Proc Natl Acad Sci USA, 2000,97:6640-6645)报道的基因删除方法敲除染色体上副产物乙酸、甲酸、乙醇、琥珀酸、 乳酸的合成途径编码基因ackA-pta、pflB、adhE、frdA、ldhA，获得菌株E.coli B150。
从Geobacillus stearothermophilus菌株中扩增alaD基因，并将卡那抗性标记克隆于该基 因下游。按照Datsenko等(Datsenko K.A.et al.,Proc Natl Acad Sci U S A,2000,97:6640-6645) 报道的方法将启动子、alaD基因片段整合于菌株B150染色体上的dadX基因处，筛选获得重 组菌株62ALA(大肠杆菌CGMCC No.10628)。
实施例2 5L发酵罐中发酵葡萄糖生产L-丙氨酸
菌株62ALA在5L发酵罐中进行发酵试验，其试验过程为：
种子液培养：将保藏于–80℃甘油保藏管的菌株划线于LB平板上培养24h，将单菌落接 种于50mL LB液体培养基中，28～35℃、200r/min培养10h。离心收集LB液体培养基中获 得的菌体，并以0.1g/L(菌体干重/培养基体积)的接种量接种于150mL含有5g/L葡萄糖的 M9-1液体培养基中(500mL三角瓶中)，28～35℃、200r/min摇床培养9h。LB培养基成分为 (/L)：10g胰蛋白胨，5g酵母粉，10g NaCl。
发酵罐接种：将上述种子液以0.062g/L(菌体干重/培养基体积)的接种量接种于含有M9-1 培养基的5L发酵罐(Winpact FS-02,Major Science,Saratoga,CA,USA)，接种后发酵液初始体 积为3L，葡萄糖初始浓度为30g/L。发酵培养基为M9-1培养基，其成分为(/L)：15.11g  Na₂HPO₄·12H₂O，3g KH₂PO₄，1g NH₄Cl，0.5g NaCl，13.2g(NH₄)₂SO₄，并补加1‰(v/v)1 mol/L MgSO₄和1‰(v/v)的微量元素母液。微量元素成分为(/L)：2.4g FeCl₃·6H₂O，0.3g  CoCl₂·6H₂O，0.15g CuCl₂·2H₂O，0.3g ZnCl₂，0.3g Na₂MO₄·2H₂O，0.075g H₃BO₃，0.495g  MnCl₂·4H₂O。
好氧阶段培养：好氧菌体生长阶段，初始空气通量为3L/min，搅拌桨转速为200r/min， 此时的溶解氧浓度设定为100％，菌体生长过程中调节空气通量直至7L/min，同时将搅拌转 速与DO值关联来控制溶解氧浓度始终大于30％；使用NH₄OH和10％(v/v)H₂SO₄维持pH 值为7.0；发酵温度控制为33℃。当菌体浓度达到600nm的吸光度(OD₆₀₀)为20时，将发酵 罐温度设定为40～45℃继续好氧培养45min，再进入限氧发酵产酸阶段。
限氧阶段培养：第二阶段，空气通量调为零，搅拌桨转速控制为100r/min，添加NH₄OH 来维持pH值为7.0，发酵温度为40～45℃，并补加三次浓度为600g/L的葡萄糖，每次补加 200mL，以维持发酵过程中发酵液残糖浓度高于10g/L，当所有补加的葡萄糖消耗尽后即结 束发酵。
在菌体生长阶段控制较低温度28～35℃，使得L-丙氨酸的合成量可控制在极低的水平， 保证了菌体快速生长。经40～45℃培养，L-丙氨酸开始快速合成，并且在限氧条件下糖酵解 途径可与L-丙氨酸合成途径耦合，实现还原力的循环，促进了L-丙氨酸的快速合成。最终发 酵液中，L-丙氨酸产量达106.2g/L。整个发酵阶段体积生产强度达到4.27g/L·h，限氧发酵阶 段体积生产强度达到7.2g/L·h，这两项指标显著高于目前报道的最高水平(分别为2.37g/L·h [Zhang X.et al.,Appl Microbiol Biotechnol,2007,77:355-366]和4g/L·h[Smith G.M.et al., Biotechnol Lett,2006,28:1695-1700])。限氧发酵阶段L-丙氨酸转化率可达97.6g/100g葡萄糖， 整个发酵阶段L-丙氨酸转化率也可达到81.9g/100g葡萄糖。发酵液中主要副产物是乙酸(1.1 g/L)，其它副产物含量都低于0.3g/L。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人， 在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以 权利要求书所界定的为准。