具有高甘露糖醛酸含量的藻酸盐的制备方法 本发明涉及一种用于具有高甘露糖醛酸含量的藻酸盐制备的改进工艺，其中藻类最初的预提取步骤是这样改进的：调节pH，以便于独立回收具有非常高含量甘露糖醛酸的藻酸盐部分，或将这部分保持在最终的产品中。一般，借助于这种改进工艺，藻酸盐部分由最初的预提取步骤回收时，所述的预提取步骤的藻酸盐含有至少80摩尔％甘露糖醛酸，或保持在进一步的藻酸盐加工工艺中时，藻酸盐终产品的甘露糖醛酸含量是含有至少70摩尔％甘露糖醛酸。总体说来，该新方法与通过常规方法制备地藻酸盐相比，其甘露糖醛酸含量提高了约10摩尔％。
背景技术
藻酸盐是由褐藻分离得到的。藻酸盐也可以由土壤细菌，例如棕色固氮杆菌和褐色球形固氮杆菌以及若干不同的假单胞菌制备。但褐藻一般是市售藻酸盐的来源。
藻酸盐用于食品和用于药物、牙制品、化妆品和其它工业制品。最普通的工业应用是基于其亲水胶体和聚合电解质的性质，这些形成了胶凝、增稠、稳定、膨胀和提供粘性的基础。
藻酸盐是海藻酸的盐，一种直链的杂多糖，其是由(1-4)键的β-D-甘露糖醛酸、称为M、和α-L-古洛糖醛酸、称为G组成。这两种糖醛酸具有下式结构：
a)
β-D-甘露糖醛酸(M) α-L-古洛糖醛酸(G)
4C1构象 1C4构象
b)
该聚合物存在甘露糖醛酸的均聚物序列，称作M-嵌段、古洛糖醛酸的均聚物序列，称作G-嵌段和甘露糖醛酸和古洛糖醛酸单元混合序列，称作MG-嵌段或交替嵌段。
以下图示表示的是藻酸盐结构的具体例子：
MMMMMMMGGGGGGGGMGMGMGMGMGGGGGGGGM
M-嵌段 G-嵌段 MG-嵌段 G-嵌段
藻酸盐通常含所有的三种嵌段，且一个嵌段一般是由三至三十个单体单元组成的。嵌段的分布依赖于分离出藻酸盐的藻类的种类，以及该植物的年龄和部位。例如来源于茎的藻酸盐与来源于叶的藻酸盐就会有不同的序列和嵌段组成。藻类收获的季节也影响嵌段组成和序列。根据公知常识，G含量最高的藻酸盐源自老L.hyperborea的茎。同一种类的叶G含量就多少降低了些，并且G-嵌段较段，但含量仍然高于大多数的其它种类。市售的藻酸盐通常具有的G含量是25％-70％。
具有M-嵌段高含量的来源，例如是褐藻类的丛梗藻、昆布、巨藻、墨角藻和泡叶藻，特别是春季的泡叶藻果实，其富含甘露糖醛酸。
富含甘露糖醛酸的藻酸盐如US 5169840中所述，显示出其具有免疫刺激活性。
现有技术的描述
对应于US 6121441的挪威专利NO 305033描述一种由藻酸盐制备糖醛酸嵌段的工艺。但该专利涉及的是不同嵌段部分的分馏释放；在工业上G、M和MG是合适的方式，而其中的液体体积被控制。另外，为了获得纯成分，在分馏沉淀工艺中描述的条件是最佳的。
用于制备聚M藻酸盐的其它制备方法，而其中甘露糖醛酸的含量是80％(FM＝0.80)的内容源自Rosell，K.G.和Srivastava，L.M.，Can.J.Bot，62(1984)，2229-2236页、Craigie，J.S.等，Carbohydr.Polym.，4(1984)，237-252页和Wedlock，D.J.等.，FoodHydrocolloids，4(1990)，41-47页。
如本发明的对工业方法中预提取步骤的简单改进的内容却还没有描述过。本发明中的对高甘露糖醛酸含量的单独回收，或保持在藻酸盐中作为其一部分，与现有技术的工艺相比，显示出这是一种简单而经济的制备方法。
在PCT/US91/00475中，公开了一种含甘露糖醛酸的藻酸盐伤口治疗组合物，及其所采用的制备方法。该组合物包含这样的生物聚合物，例如至少70摩尔％的β-D-甘露糖醛酸(M)藻酸盐。根据这一公开文本的第2页第17行的内容，只有很少的藻类能够制备G-含量小于30％的藻酸盐。但细菌被描述为高M-含量藻酸盐的优选来源。本发明与这一教导有本质的不同，即公开了一种制备藻酸盐的改进的工业方法，并且该改进的方法，使藻酸盐具有高甘露糖醛酸含量，而常规的提取工艺中却无法达到这样的高含量。
本发明的总体描述
通过对预提取步骤或所谓膨胀步骤进行改进，使水可提取的藻酸盐的常规制备方法得到了提高。该步骤在特定的pH下进行，从而得到改进。一种改进是将pH调节低于约2.3，以便于提高藻酸盐终产品中甘露糖醛酸含量总得率至少10摩尔％。这使得产生的藻酸盐具有的M含量至少是70摩尔％。或者在预提取步骤中将pH保持在约2.3以上，这样意想不到的是可溶的藻酸盐部分中就具有了非常高的甘露糖醛酸含量，优选是至少80摩尔％的M。在常规工艺中的提取步骤开始之前，该可溶的藻酸盐部分可以以独立的部分被回收，所述的常规工艺如下所述：
步骤1：藻类物料的预提取或膨胀
步骤2：藻类物料的提取
步骤3：筛分
步骤4：过滤
步骤5：用例如酸或醇沉淀或用碱土金属或碱金属盐处理
步骤6：酸洗(如果在步骤5中不使用酸)
步骤7：藻酸干燥，和选择性地
步骤8：藻酸与合适碱的中和，和
步骤9：对得到的藻酸盐干燥
在上述不同的步骤1-9之间，可以用稀释酸溶液进行可能的中间体的清洗步骤。在步骤8中，碱可以是例如纳或钙的碳酸盐，在步骤9中得到对应的藻酸钠或钙。
在本发明中，预提取步骤(膨胀步骤)中的pH保持在某一pH以上，或调节至某一pH以下，这里所使用的“约2.3”表示的是2.3+/-0.1。
在本发明的第一个方面，当单独地回收富含甘露糖醛酸的部分时，预提取步骤的pH保持在约2.3以上，而液体部分的分离则是由预提取或膨胀步骤的悬浮液，通过过滤或任意其它标准的分离方法，例如离心或筛分实现的。随后，该藻酸盐可以选择性地以任何常规的方式，用醇、酸或盐，例如乙醇、盐酸、硫酸或氯化钙进行液体部分的沉淀。
根据本发明的方法，其中在预提取步骤中，pH保持在约2.3以上，得到富含甘露糖醛酸部分的产率是0.05-10wt.％，优选是2-6wt.％，如第8页表2中所显示的。回收的藻酸盐的M含量至少是80摩尔％。由此本发明提供了用于高含量甘露糖醛酸藻酸盐制备的经济而又简单的方法，得到的藻酸盐制品是特别适用于医药、兽医和饮食领域。
附图的简要说明
图1显示的是具有非常高甘露糖醛酸含量的藻酸盐部分的制备和分离回收的总的工艺流程，所述的甘露糖醛酸的含量高于80摩尔％。
本发明的详细说明
本发明的第一个方面，涉及一种藻酸盐的制备方法，所述的藻酸盐具有的甘露糖醛酸含量至少是80摩尔％，其中所述的藻酸盐是通过以下步骤制备的：
a)在搅拌条件下向水中添加藻类或海藻，比例分别是1∶3至1∶20，pH在约2.3以上，而温度保持在20℃以上至少30分钟，和
b)将所述的藻酸盐与a)步骤悬浮液中的固体物质分离，这是通过常规的分离方法，例如过滤实现的，和任意地
c)回收所述的藻酸盐。
将藻酸盐部分通过过滤，或任意其它合适的常规分离方法，例如离心或筛分，与固体物质分离，且具有甘露糖醛酸含量的藻酸盐任意地通过酸、盐或醇沉淀，从而由溶液中得到回收。
在本发明第二个方面，涉及的藻酸盐的制备方法，所述的藻酸盐具有的甘露糖醛酸含量至少是70摩尔％，其特征在于：
1)在搅拌条件下向水中添加藻类或海藻，比例分别是1∶3至1∶20，在预提取步骤中，pH被调节至约2.3以下，而温度保持在至少20℃至少30分钟，以实现所述藻酸盐的可溶状态，并通过以下步骤回收所述的藻酸盐：2)藻类物料的提取，3)筛分，4)过滤，5)沉淀(例如，用酸或钙盐)，6)酸洗，7)藻酸的干燥，和任意地，8)藻酸的中和，和9)藻酸盐的烘干。
与常规方法相比，该方法得到的M提高了约10摩尔％。通过本发明第二个方面的方法制备的藻酸盐制品，以其可溶状态使M含量是70摩尔％，由此表现出在常规方法中的产率提高，所述的标准方法例如，由以下步骤组成：2)藻类物料的提取，3)筛分，4)过滤，5)沉淀(例如，用酸或钙盐)，6)酸洗，7)藻酸的干燥，8)藻酸的中和，和9)藻酸盐的烘干。
在上述不同的步骤1)-9)之间，可以用稀释酸进行可能的中间体的清洗步骤。
本发明的原料是藻类或海藻，特别是褐藻，其用甲醛处理，以便于使酚固定，并使藻类保鲜。另外，上述藻类可以用酸洗，以去除高粘性的岩藻聚糖。应该理解，该藻类可以以任何公知的方式进行预处理。市售的藻酸盐，最优选干燥的和研磨的藻类，可以采用丛梗藻，但也可以是源自丛梗藻、昆布、巨藻、泡叶藻或墨角藻的新鲜的、完整的或未研磨的藻类，它们适合于作为本发明方法的原料。
本发明通过下述非限制性的实施例进行举例说明。
实施例1
改进方法，其中在“预提取”步骤中pH在2.3以上
该方法的描述：
源自不同丛梗藻的原料，D.potatorum(研磨的)作为样品1和D.antarctica(未研磨的)作为样品2，被添加到水中，添加量如下表所示，时不时地用手搅拌，温度为55℃，保持3.5小时。在室温下贮藏过夜，上述藻类在55℃进行1小时的第二次提取，接着将2.5ml甲醛添加进来，继续提取1小时。
″预提取″步骤
样品 重量 [克] 水 [ml] 时间 [小时] 温度 [℃] 甲醛 [ml] PH 1 50.0 500 5.5 55 2.5 5.9 2 40.0 500 5.5 55 2.5 6.9
过滤
接着将悬浮液在60目过滤器上进行筛分，并用过量的水清洗两次。该溶液接着在真空漏斗的帮助下进行过滤器过滤，之后经过膜过滤器。
酸沉淀
然后将溶液冷却至10℃，并接着添加浓度为0.5％的氯化钠。然后通过小心地滴加5.5M盐酸，并伴随着磁铁搅拌至pH为1.8。形成白色沉淀物。在将温度保持在10℃ 30分钟之后，将悬浮液经过120目滤布，并用手仔细挤压，得到糊状的、黄色物质块，在挤压之后转变成细纤维。
中和
将所有的酸物质转移至250ml容器中，并添加水使体积达到200ml，在中和至pH为7之前，用固体无水碳酸钠在磁性搅拌下进行中和。
过滤
将溶液再一次经过0.8μ的硝酸纤维素过滤膜进行过滤。
醇沉淀
将滤液冷却至10℃，并用异丙醇以1∶1的比例进行沉淀。形成的纤维用70vol％的异丙醇清洗一次，并接着用100vol％的异丙醇进行第二次清洗。
干燥
用镊子抽出纤维，并接着冷冻干燥。
结果显示在表1中。
表1
样品 藻类 重量 [克] 产量 [克] 藻酸盐％ (热水提取) 1 D.potatorum 50 1.08 2.1 2 D.antarctica 40 1.59 4.0
产品的分析
样品 藻类特性粘度dL/g 分子量 Dalton/g 甘露糖醛酸％ NIR型ALGLN2D 1 D.potatorum2.7 44009 82 2 D.antarctica7.0 118892 88
在NMR 400Hz测定的产品的嵌段分布
样品 藻类 M G MM GG GM/MG 1 D.potatorum 85.9 14.1 76.3 4.5 9.6 2 D.antarctica 90.9 9.1 84.8 3.0 6.1
表2显示出实施例1中制备的其它海藻样品的甘露糖醛酸的产率。
表2
藻类/海藻 形式 干物质 产率 甘露糖醛酸 ％ w/w％ ％ 泡叶藻，春季 整体，切割 20 0.035 90 Durvillea.antarctica 智利，1996 未研磨 85 4 91 Durvillea.antarctica 智利，1996 研磨 85 6 89 Durvillea.antarctica 智利，1998 整体 85 1.3 87 Durvillea.antarctica 智利，2000 研磨 85 2.5 91 Durvillea.potatorum 塔斯马尼亚，1997 研磨 85 2.1 86 Lessonia trabeculata 智利，1996 研磨 85 0.125 NA Lessonia nigrescens 智利，1995 研磨 85 - NA Laminaria hyperborea，叶 新鲜的，切割 18 - NA Saragassum，坦桑 尼亚，1991年8月 研磨 85 - NA 巨藻，智利，1994 研磨 85 - NA 海带，日本，1998 整体，切割 85 0.2 NA Fucus spiralis，夏 天，1994 整体，切割 15 0.026 91
其中NA＝未分析
实施例2
改进方法，其中在“预提取”步骤中pH在2.3以下
该方法的描述：
源自1996年8月的Durvillea antarctica样品被研磨成颗粒，其粒径大于70目，用作原料。
预提取(膨胀)步骤，pH＜2.3
在容器中称量30g的干藻类。添加100ml 0.2M HCI，且物料用水稀释至500ml。在搅拌几分钟之后，pH提高到大于2.3，并添加酸，以保持pH小于2.3，在2分钟之后添加2.5ml的0.2M的盐酸(pH1.8)。当pH恒定保持低于2.3的1.8时，与用纯水膨胀相比较，物料膨胀很小。在预提取(膨胀)1小时之后，物料用60目滤布筛分，用手挤压，并转移至容器。
碱提取
随后将500ml水和50ml无水碳酸钠/氢氧化钠溶液添加到得到的物料中，并在55℃提取1小时。该物料膨胀得非常快，并变得象糊或浆一样稠。将其在室温下放置直至第二天。接着该物料在55℃进一步提取1小时，并接着在混合装置中搅拌。总质量称重是549克。
筛分和过滤
在搅拌条件下，将150g物料用700g水稀释。在增加了有助于过滤的抽吸水的真空装置后，该溶液接着在滤纸上被过滤。
酸沉淀
测定滤液的量是564g，并被冷却至10℃。添加0.5％的氯化钠，且用稀释的盐酸(1∶1)液滴使pH被调节至1.6。形成软的沉淀物。物料接着在120目滤布上进行筛分，并仔细地用手挤压。
中和
该物料接着用水形成悬浮液，并在20℃被稀释至约200ml的体积。通过采用磁性搅拌装置，用固体无水碳酸钠粉将该溶液的pH中和至7。
醇沉淀
通过用玻璃棒搅拌，该溶液用等量的异丙醇溶液进行沉淀。沉淀的纤维用70vol％的异丙醇溶液清洗一次，并接着用纯的100vol％的异丙醇进行第二次清洗。
干燥
在筛分和在120目滤布上挤压之后，通过镊子将纤维抽出，并接着在真空下进行过夜冷冻干燥。
结果
藻酸盐的产量是1.04g，相当于Durvillea Antarctica原料的3.46wt％。M的含量是77％，且通过NMR测定的藻酸盐的嵌段分布如下。
分析 M G GG MM GM/MG NIR(algln2d) 77 23 - - - NMR 78.7 21 10.9 68.3 10.4
实施例3
改进方法，其中在“预提取”步骤中pH在2.3以上并添加盐
通过在“预提取”步骤中，添加盐，可以进一步提高甘露糖醛酸含量。
该方法的描述：
“预提取”步骤
向20g的1996年8月智利的Durvillea antarctica(研磨的粗颗粒＞70目)藻类添加500ml水和一定量的氯化钠，并在Jar测试设备中，以搅拌的方式进行提取，搅拌速度是140rpm持续2小时，温度是20℃。添加的盐溶液的浓度(wt.％)，如表3中所示：
样品 Durvillea antarctica [g] 水 [ml] 氯化钠浓度 提取时间 [小时] 备注 A 20 500 0 2 B 20 500 0.2％ 2 C 20 500 0.5％ 2 D 20 500 1.0％ 2 E 20 500 2.0％ 2 F 20 500 3.0％ 2 G 20 500 3.4％ 2 H 20 500 - 2 海水
筛分
接着将物料在400目的滤布上筛分，并用手挤压。对筛分后的溶液称重，重量和测得的pH显示在表4中。
表4
样品 氯化钠浓度 筛分的量 [g] pH 备注 A 0 377 6.3 B 0.2％ 371 6.0 C 0.5％ 389 6.0 D 1.0％ 397 5.9 E 2.0％ 417 5.8 F 3.0％ 444 5.8 G 3.4％ 455 5.0 H - 421 6.4 海水
过滤
通过真空(吸水泵)，经过带有滤纸的漏斗，将筛分的溶液进行过滤。在玻璃管上测定过滤溶液的粘度，将结果显示在表5中。
表5
样品 氯化钠浓度 滤液的量 [g] 测定的时间 [秒] 计算的粘度 [cps] A 0 277 18.7 11.6 B 0.2％ 286 16.0 9.9 C 0.5％ 319 13.8 8.6 D 1.0％ 330 12.2 7.6 E 2.0％ 408 7.5 4.7 F 3.0％ 438 4.9 3.0 G 3.4％ 445 - 2.6 H - 402 - 2.9
酸沉淀
将滤液冷却至低于15℃，并在磁性搅拌器的搅拌下，向各样品滴加5.5M盐酸，直至pH达到1.8-2.0。形成了纤维形状的沉淀物。接着将沉淀物在400目滤布上进行筛分，并用手挤压。
中和
接着将藻酸用水稀释，并在搅拌直至完全溶解的情况下，用固体无水碳酸钠中和，直至pH为6-7。
醇沉淀
接着将该溶液冷却，并用等量的异丙醇进行沉淀。然后用70vol％的异丙醇清洗一次，并接着用纯的100vol％的异丙醇进行重复清洗。
干燥
通过镊子将沉淀的纤维拔出，并转移至容器中，在真空中冷冻干燥过夜。
结果
结果显示在表6中，其中计算的产量，基于这样的假定，即没有藻酸盐损失，且所有的藻酸盐溶于添加的水中。
表6
样品 氯化钠浓度 藻酸盐的沉 淀量 [g] 藻酸盐量 [g/l] 实际产率％ M-嵌段 NIR 型 ALGLN2D A 0 1.26 3.34 6.3 88％ B 0.2％ 1.03 3.60 5.1 C 0.5％ 1.11 3.48 5.6 D 1.0％ 1.14 3.45 5.7 E 2.0％ 1.20 2.87 6.0 F 3.0％ 0.80 1.80 4.0 G 3.4％ 0.54 1.21 2.7 91.8％ H 海水 0.53 1.32 2.7 95.8％
实施例4
改进方法，其中在“预提取”步骤中pH在2.3以上并添加盐
该方法的描述：
在独立部分中的甘露糖醛酸含量通过添加CaCl2，得到进一步提高。原料是智利的Durvillea antarctica，其被研磨成大于70目的粗颗粒。
“预提取”
“预提取”步骤的量和条件显示在表7中。在Jar测试设备中，以约140rpm搅拌的方式，进行“预提取”(提取)。
表7
样品 重量 [g] 水 [ml] 时间 [小时] 温度 [℃] pH 氯化钙 [N] A 20.0 500 2 25 6.08 0.01 C 20.0 498 2 25 5.8 0.03 D 20.0 496 2 25 5.7 0.06 B 20.0 500 2 25 5.85 0.1
过滤
接着将物料在400目过滤器上进行筛分，并通过手挤压。然后将溶液加热至约30℃，并用真空抽吸烧瓶上的纸过滤。
表8
样品 氯化钙 [N] 筛分的溶液400目 [g] 过滤溶液 [g] A 0.01 404 397 C 0.03 423 398 D 0.06 440 420 B 0.1 462 457
酸沉淀
然后将溶液冷却至10℃，并添加0.5％的氯化钠。然后伴随着仔细的磁性搅拌，滴加5.5M HCl直至pH1.8。形成白色沉淀。将物料悬浮液贮存30分钟，并在400目滤布上进行筛分，并用手小心挤压。物料是糊状的黄色块，在挤压之后转变成明亮的纤维。
中和
随后将该酸物料转移至250ml容器中，并添加水至200ml体积，接着用固体无水碳酸钠在磁性搅拌下中和至pH7。
醇沉淀
将滤液冷却至10℃，并在搅拌下用100vol％的异丙醇以1∶1的比例添加，形成沉淀。大的纤维沉淀。该纤维用70vol％的异丙醇清洗两次，并最后用100vol％的异丙醇进行清洗。
干燥
然后通过镊子将纤维拔出，之后在真空中冷冻干燥过夜。
结果
结果显示在表9和10中，显示出藻酸盐的产量和藻酸盐中甘露糖醛酸含量的提高，所述的含量超过80％M，当“预提取”步骤中没有添加盐时(在表2中显示)最大值是91％M，而“预提取”步骤中添加盐时，最大值是95％M。
表9
样品 氯化钙 [N] 藻酸盐的产量 [g] 藻酸盐产率 [g/l] 产率％ A 0.01N 1.29g 3.19 6.5 C 0.03N 0.52g 1.31 2.6 D 0.06N 0.19g 0.45 0.9 B 0.1N - 0 0
表10
样品 氯化钙 [N] 甘露糖 醛酸％ NIR型 LND`2 M％ G％ MM％ GM/MG％ NMR GG％ NMR A 0.01N 98.7 89.0 11.0 82.0 8.0 3.0 C 0.03N 101.6 92.0 8.0 86.0 6.0 1.6 D 0.06N 102.5 95.0 5.0 90.0 5.0 0 B 0.1N - - - - - - E 只有水 - 88.7 11.3 80.4 8.3 3.0
实施例5-参考实施例
描述了用于具有非常高甘露糖醛酸含量的藻酸盐的常规制备方法。
源自挪威Karmy的新鲜泡叶藻作为原料。
挤压
将50kg的藻类置于滚压型“Haller”上进行挤压，该设备的加工能力是每小时280kg藻类。收集了总共300ml提取液。
过滤
采用抽水的方式，将提取物在粗过滤纸上进行过滤。
酸沉淀
255g的体积添加1.5％的NaCl，且接着滴加5.5M的稀释的盐酸直至pH达到1.5。有黄色絮状沉淀，并通过400目滤布对溶液筛分，且用手挤压。
中和
将这些絮状物通过添加50ml水溶解，并用固体无水碳酸钠中和至pH9。该溶液接着用黑带滤纸过滤。
醇沉淀
该溶液用等量的异丙醇沉淀。沉淀的物料在400目滤布上筛分，并用丙酮清洗一次。物料接着在105℃干燥4小时。
结果
结果显示在下表11中。
表11
藻类 量 [g] 提取物 [ml] 藻酸盐 [mg] 浓度 [mg/l]产率(湿的藻类)[g/kg] 泡叶藻 50 300 35 120.0007
在参考实施例5中制备的藻酸盐甘露糖醛酸含量是M-嵌段94.4％，而MM-嵌段91.8％。