纳米大小的乳酸菌.pdf

通过在乳酸菌的培养过程和加工过程中将培养基的pH控制在中性区(如约5-8)而获得的乳酸菌细胞的粒度分布最频值(粒度)为1μm以下。具有如此小粒度的纳米大小的乳酸菌细胞具有优良的IFN-α产生能力，且在水中的分散能力优良。

1.  纳米大小的乳酸菌细胞，其中所述细胞的粒度分布最频值不大于1μm。

2.  权利要求1的细胞，其中所述细胞可通过将乳酸菌培养过程和加工过程的培养基的pH控制在中性区而获得。

3.  权利要求2的细胞，其中所述细胞可通过将所述培养基的pH控制在5-8而获得。

4.  权利要求2或3的细胞，其中在乳酸菌的培养过程中向培养基中加入葡萄糖。

5.  权利要求1的细胞，其中所述细胞可通过向含有将pH控制在中性区的培养基及细胞的培养物中添加和分散分散剂或赋形剂后使生成的分散物经冷冻干燥或喷雾干燥而获得。

6.  权利要求1-5中任一项的细胞，其中所述乳酸菌为乳酸乳杆菌。

7.  权利要求6的细胞，其中所述乳酸乳杆菌是短乳杆菌。

8.  权利要求7的细胞，其中所述短乳杆菌是FERM BP-4693菌株。

9.  具有免疫增强活性的组合物，其包含权利要求1-8中任一项的细胞。

10.  食品、饮料、饲料、化妆品或药品，其含有权利要求1-8中任一项的细胞或权利要求9的组合物。

11.  生产权利要求1的细胞的方法，其中在所述乳酸菌的培养过程和加工过程中，将培养基的pH控制在中性区。

12.  权利要求11的方法，其中将所述培养基的pH控制在5-8。

13.  权利要求11的方法，其包括向含有将pH控制在中性区的培养基及细胞的培养物中添加和分散分散剂或赋形剂后使生成的分散物经冷冻干燥或喷雾干燥。

纳米大小的乳酸菌
技术领域
[0001]本发明涉及纳米大小的乳酸菌，其具有增强由抗原呈递细胞产生干扰素-α的能力的作用。
背景技术
[0002]根据最新研究，已知幼稚T细胞(以下简称Th0细胞)依据其功能可分化为I型T细胞(以下简称Th1细胞)和II型T细胞(以下简称Th2细胞)。
由Th1细胞的免疫应答诱导细胞免疫，导致由巨噬细胞和淋巴细胞之类的单核细胞发生吞噬作用。而由Th2细胞的免疫应答诱导体液免疫，从而发生由抗体杀灭细菌。Th1细胞因子抑制Th2，反之，Th2细胞因子抑制Th1。这两种细胞因子协同作用而维持整体免疫平衡。
[0003]干扰素-α(IFN-α)是由被病毒、胞内寄生性细菌(例如结核杆菌、沙门氏菌、李斯特菌或麻风分枝杆菌)或胞内寄生性真菌(例如隐球菌)感染的树突细胞(抗原呈递细胞)分泌的细胞因子。
而白介素-12(IL-12)是由抗原呈递细胞(例如树突细胞或巨噬细胞)分泌的细胞因子，并且已知是激活直接攻击癌细胞的自然杀伤细胞(NK细胞)、LAK细胞(LAK细胞)或杀伤性T细胞(CTL细胞)，且增强IFN-γ产生的极强的免疫激活剂。
[0004]这些IFN-α和IL-12都是诱导Th1细胞的细胞因子，但发现抗原呈递细胞所表达的受体(TLR：Toll-样受体)不同(当细胞因子为IL-12时，表达的受体是TLR1，TLR3，TLR5和TLR9；当细胞因子为IFN-α时，表达的受体是TLR7和TLR9)。
[0005]据报道，增强抗原呈递细胞产生干扰素-α的乳酸菌及其成分包括：短乳杆菌细胞粉末(见专利文献1：特开平6-206826号公报)、属于肠球菌属的乳酸菌及其加工产品(见专利文献2：特开平8-259450号公报)和短乳杆菌FERM BP-4693的成分提取物(见专利文献3：特开平9-188627号公报)等。
[0006]通常选择IFN-α产生能力高的菌株，而没有必要将低活性菌株改造成高活性菌株，更没有必要进行这样的尝试。
虽然短乳杆菌细胞粉末已商品化许多年，但是仍迫切需要增强乳酸菌的IFN-α产生能力。
[0007]至今乳酸菌通常以发酵奶或酸奶的形式摄入。由口摄取的抗原通过覆盖在淋巴集结上的M细胞的吞噬作用被摄取。
着眼于多大尺寸的抗原可通过淋巴集结摄取，至今已对颗粒尺寸(粒度)与其被摄取到淋巴集结的相关性进行了大量研究。
[0008]结果发现，当粒度超过10μm时，由M细胞的吞噬作用显著下降(见非专利文献1)；还发现，当颗粒材料是聚乳酸时，可通过淋巴集结的颗粒的最大尺寸为10μm(见非专利文献2)；当颗粒材料为聚苯乙烯时，可通过淋巴集结的颗粒的最大尺寸为15μm(见非专利文献3)；当颗粒材料为可生物降解的聚乳酸时，可通过淋巴集结的颗粒的最大尺寸为21μm(见非专利文献4)。
由这些结果得知，可通过淋巴集结的粒度最大可达约20μm。
[0009]根据将抗原致敏的可生物降解的聚乳酸珠口服施用给大鼠的实验，由Th2诱导而产生抗原特异性抗体的百分率最高的粒度在所产生抗体为IgG时为4μm，在所产生抗体为IgA时为7μm。由此得知，优于Th2诱导的粒度为约3μm-7μm(见非专利文献4)。
然而，优于Th1诱导的粒度至今未有报道。
[0010]专利文献1：特开平6-206826号公报
专利文献2：特开平8-259450号公报
专利文献3：特开平9-188627号公报
非专利文献1：Tabata Y，Ikeda Y.，Adv.Polym.Sci.，94，107-141，1990
非专利文献2：Eidridge J.H.，et al.，J.Controlled Rel.，11，205-214，1990
非专利文献3：Eidridge J.H.，et al.，Molec.Immun.，28，287-294，1991
非专利文献4：Tabata Y.，et al.，Vaccine 14，1677-1685，1996
发明内容
发明要解决的问题
[0011]鉴于上述情况，本发明旨在提供具有优于Th1诱导的粒度、优良的I NF-α产生能力，以及优良的在水中的分散能力的乳酸菌。
解决问题的方法
[0012]本发明人从京都的“酸茎渍”、长野的“すんき渍”、格鲁吉亚共和国的Mariami和Matsoni-like、蒙古的马奶酒以及各种发酵乳制品中分离有益长寿的乳酸菌，并分析了乳酸菌的尺寸与由抗原呈递细胞产生IL-12和IFN-α的能力的相关性。
结果，如图1A所示，当乳酸菌的尺寸减小至1μm以下时，由乳酸菌刺激而抗原呈递细胞产生IL-12的能力升高(见参照实施例1)。
另一方面，如图1B所示，当乳酸菌的尺寸减小至1μm以下时，IFN-α产生能力也升高(见参照实施例1)。
[0013]但是，某些菌株在IL-12产生能力和IFN-α产生能力之间呈负相关性。例如，像EF、KH1和KH3之类的菌株，其IL-12产生能力高，IFN-α产生能力低；相反，像LL12和ML4之类的菌株则IL-12产生能力低，IFN-α产生能力高。
另一方面，发现菌株SNK具有IL-12产生能力和IFN-α产生能力都相对高的特征。
无法从现有技术推知上述发现(日本专利申请NO.2007-30324)，推测可能是由抗原呈递细胞表达的受体对乳酸菌的识别不同所致。
[0014]结果发现，粒度接近9μm的乳酸菌(如短乳杆菌FERMBP-4693(如表1和图1A、图1B、图2所示“LBR”))的IFN-α产生能力比粒度约1μm的乳酸菌显著低。
[0015]为解决上述问题，本发明人锐意研究了可使乳酸菌细胞的粒度分布最频值降低，且阻止细胞本身发生再凝集的条件。
在研究过程中，本发明人着眼于乳酸菌的表面带有正(+)电荷，发现可通过将培养过程和加工过程的pH控制在中性区，从而使乳酸菌细胞的粒度分布最频值(以下可简称为粒度)降到1μm以下。
已知乳酸菌的形态一般会随着各培养条件的变化而变化，但本领域的技术人员尚不知，还可通过控制培养过程和加工过程的pH来将乳酸菌的尺寸调至1μm以下。
[0016]本发明人还发现，所述细胞可显著增强由抗原呈递细胞产生IFN-α的能力。
如上所述，本发明人发现，即使对于粒度大于1.0μm普通的乳酸菌细胞，也可通过在中性pH进行培养及加工处理，而将其粒度调至1.0μm以下；且此乳酸菌可增强由抗原呈递细胞产生IFN-α的能力，并可提高免疫增强活性，从而完成了本发明。
[0017]最近，浓缩的乳酸菌死细胞干粉已逐渐商品化，其旨在通过少量干粉摄入大量乳酸菌。
但即使这样的干粉中的乳酸菌本身的粒度为1.0μm以下，也由于其仅是将浓缩的细胞经干燥得到的粉末，当将其加入水中时，所述乳酸菌颗粒会互相吸附而聚集成块(见参照实施例2)。
事实上，在通常的培养条件下存在粒度为1.0μm以下的乳酸菌的可能性低(参见表1)。
[0018]具体而言，本发明提供：
(1)纳米大小的乳酸菌细胞，其中所述细胞的粒度分布最频值(a mode value)不大于1μm。
(2)(1)的细胞，其中所述细胞可通过在乳酸菌的培养过程和加工过程中将培养基的pH控制在中性区而获得。
(3)(2)的细胞，其中所述细胞可通过将所述培养基的pH控制在5-8而获得。
(4)(2)或(3)的细胞，其中在乳酸菌的培养过程中向培养基中加入葡萄糖。
(5)(1)的细胞，其中所述细胞可通过向含有将pH控制在中性区的培养基及细胞的培养物中添加和分散分散剂或赋形剂后使生成的分散物经冷冻干燥或喷雾干燥而获得。
(6)(1)-(5)中任一项的细胞，其中所述乳酸菌为乳酸乳杆菌。
(7)(6)的细胞，其中所述乳酸乳杆菌是短乳杆菌。
(8)(7)的细胞，其中所述短乳杆菌是FERM BP-4693菌株。
(9)具有免疫增强活性的组合物，其包含(1)-(8)中任一项的细胞。
(10)食品、饮料、饲料、化妆品或药品，其含有(1)-(8)中任一项的细胞或(9)的组合物。
(11)生产(1)的细胞的方法，其中在所述乳酸菌的培养过程和加工过程中，将培养基的pH控制在中性区。
(12)(11)的方法，其中将所述培养基的pH控制在5-8。
(13)(11)的方法，其包括向含有将pH控制在中性区的培养基及细胞的培养物中添加和分散分散剂或赋形剂后使生成的分散物经冷冻干燥或喷雾干燥。
发明效果
[0019]根据本发明，即使对于粒度大于1.0μm普通的乳酸菌细胞，也可通过在pH中性区培养和加工而将其粒度调至1.0μm以下。
因为如上所述获得的纳米大小的乳酸菌细胞可增强由抗原呈递细胞产生IFN-α的能力，且可提高免疫增强活性，所述细胞被认为是非常有用的细胞。

附图简述
[0020]
[图1]示乳酸菌细胞粒度与IL-12和IFN-α产生能力的相关性的坐标图。
[图2]示由乳酸菌刺激所致的IL-12产生能力与IFN-α产生能力的相关性的坐标图。
[图3]比较细胞粒度的坐标图。
[图4]示乳酸菌粉末的粒度分布(A：频率％，B：累积量％)的坐标图。
[图5]示纳米大小的乳酸菌“LABRE”的细胞粒度与其IFN-α产生能力的相关性的坐标图。
实施方式
[0021]以下进一步详细说明本发明。
本发明的纳米大小的乳酸菌细胞的粒度分布最频值(粒度)不大于1μm。
本发明所述的“粒度分布最频值”是指示细菌粒度的指数，且指当测量细胞粒度时，在颗粒分布中相对频率最高的粒度。
[0022]可用作本发明的“纳米大小的乳酸菌细胞”的乳酸菌细胞的具体例子包括：
乳杆菌(如嗜酸乳杆菌、加氏乳杆菌、马里乳杆菌、植物乳杆菌、布赫纳乳杆菌、干酪乳杆菌、约氏乳杆菌(Lactobacillus johnsonii)、鸡乳杆菌(Lactobacillus Gallinarum)、噬淀粉乳杆菌(Lactobacillus amylovorus)、短乳杆菌、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)、高加索酸奶乳杆菌、副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)和卷曲乳杆菌)、
链球菌(如嗜热链球菌)、
乳球菌(如乳酸乳球菌)、
肠球菌(如粪肠球菌和屎肠球菌)以及
双歧杆菌(如两歧双歧杆菌、长双歧杆菌、青春双歧杆菌、婴儿双歧杆菌、短双歧杆菌和链状双歧杆菌)等。
[0023]本发明的纳米大小的乳酸菌细胞可为活细胞或死细胞的形式。活细胞可在其制成产品后的运输或展示过程中发生形态变化，因此优选不再发生形态变化的死细胞。
[0024]已知在培养过程中生长条件恶化的压力下乳酸菌发生形态变化。
因此，本发明调控培养和加工条件以使乳酸菌在增殖时仍保持形状均一，并且产生具有上述粒度分布最频值的纳米大小的乳酸菌。
具体而言，如上所述着眼于乳酸菌表面带有正电荷(+)，可通过将培养过程和加工过程的pH控制在中性区以使膜稳定，从而有可能避免分裂细胞仍融合在一起的双细胞形态或细胞之间的再吸附。
[0025]所述“将pH控制在中性区”的方法可为例如用乳酸之类的酸或氢氧化钠之类的碱来进行中和。
应注意的是，本发明所述“在培养过程和加工过程中将培养基的pH控制在中性区”，不仅是指在培养过程中将pH控制在中性区，还指在培养过程完成之后的细胞灭菌、洗涤和浓缩等过程(加工过程)中将pH控制在中性区。
培养过程和加工过程的pH可优选为5-8，更优选为5.5-7.5。
[0026]因为葡萄糖的能量利用率最高，优选将葡萄糖作为培养基中营养成分的能量来源，优选将其在培养基中的含量调至约5wt％-10wt％。
可通过将葡萄糖耗尽的时间点作为培养终点，从而可避免细胞发生在营养丧失的压力下发生的细胞形态变化。
[0027]此外，本发明所述的“纳米大小的乳酸菌细胞”优选采取经分散加工的形式。
对分散加工的方法无特定限制。可为例如，于湿条件下用约150kgf/cm²(1.5Mpa)的匀浆器分散所述细菌培养基的方法。
在这种情况下，优选在培养基中预先添加已知的分散剂或赋形剂。所述分散剂或赋形剂可有效阻止细胞的再凝集。
所述分散剂或赋形剂的添加量随着细胞的性质而不同，但优选为细胞重量的1-100倍，更优选为细胞重量的2-20倍。
优选的分散剂或赋形剂可为海藻糖、糊精和脱脂奶等。
[0028]当需要最终获得本发明的“纳米大小的乳酸菌细胞”粉末时，在用已知的分散剂或赋形剂等处理细胞后优选进行冷冻干燥或喷雾干燥以使细胞不发生再凝集。这种处理可能获得在水中的分散能力优良的细胞粉末。
[0029]上述本发明的纳米大小的乳酸菌细胞的粒度已降到不大于1.0μm的纳米级。
当通过上述方法将这些细胞制成干粉且在生理消化液中再悬浮时，所述细胞仍保持粒度为1.0μm以下。应注意的是，本文所用的“生理消化液”是指通过本领域已知方法制备的人造胃液或人造肠液。
[0030]本发明的纳米大小的乳酸菌细胞可直接用作产品。但为了提高它们的风味和/或口感或为了使其形成所需形状等目的，通常通过添加或混合各种成分及进一步混合一种或多种香料来制成最终产品。
待添加或混合的所述成分可为例如，各种碳水化合物、乳化剂、甜味剂、酸味剂、水果提取物等。
[0031]更具体而言，可为例如：
糖(如葡萄糖、蔗糖、果糖和蜂蜜)、
糖醇(如山梨糖醇、木糖醇、赤藓糖醇、乳糖醇和异麦芽酮糖醇(paratinit))以及
乳化剂(如蔗糖脂肪酸酯、甘油脂肪酸脂和卵磷脂)。
还可通过混合一种或多种维生素(如维生素A、维生素B、维生素C和维生素E)、草药提取物(herb extract)、谷类成分、蔬菜成分和牛奶成分等来获得风味和口感优良的Th1诱导剂。
[0032]所述的香料可为例如，酸奶香料、浆果香料、橙香料、花梨香料、紫苏香料、柑桔香料、苹果香料、薄荷香料、葡萄香料、梨香料、乳蛋糕乳脂香料(custard cream flavor)、桃香料、甜瓜香料、香蕉香料、热带水果香料、草药香料、红茶香料和咖啡香料之类的香料。它们可单独使用或组合使用。对各香料的添加量无特定限制，但是从风味的角度考虑，可优选添加各香料约0.05wt％-0.5wt％，尤其优选约0.1wt％-0.3wt％。
[0033]可将上述本发明的纳米大小的乳酸菌细胞制成任意形式，如固体形式或液体形式。具体而言，可通过药物或食品生产领域已知的方法将它们与可药用盐、赋形剂、防腐剂、色素、矫味剂等一起制成各种形式的产品，如饮料、颗粒、片剂和胶囊。
[0034]此外，本发明的纳米大小的乳酸菌细胞也可被用于保健食品。所述“保健食品”是指用于保健或保持和促进健康的与普通食物相比具有一定积极意义的食品。它们的形式可以是液体、半固体或固体。具体例子包括，点心(如饼干、米饼、果冻、甜豆果冻、酸奶酪、蒸或烤的沾有豆酱的面包)、降温饮品、营养饮料和汤。
[0035]此外，本发明的纳米大小的乳酸菌细胞也可以各种产品形式用于外用护肤剂，如洗液(美容液)、美容霜、乳液、美容液、化妆品套装、皮肤牛奶(乳化原液)、化妆胶、粉末、唇霜、唇膏、深层美容化妆品(under makeup cosmetics)、基础化妆品(foundations)、防晒化妆品、洗澡水添加剂、身体洗发水(bodyshampoo)、浴液、香皂、清洁泡沫、软膏、皮肤粘合贴片、胶冻制剂和气雾制剂。
[0036]应注意的是，也可根据需要将在化妆品、准药品和药物(如以下将例示的)中普遍采用的各种成分和添加剂与本发明的纳米大小的乳酸菌细胞适宜混合。
具体而言，可适宜混合下列物质：
湿润剂，如甘油、矿脂、尿素、透明质酸和肝素；
紫外线吸收剂或散射剂，如PABA衍生物(对氨基苯甲酸、“ESCALOL507”(ISP Japan Ltd.)等)、肉桂酸衍生物(新肝素(neoheparin)、“PARSOL MCX”(DSM Nutrition Japan K.K.)、“SUNGUARD B”(ShiseidoCo.，Ltd.)等)、水杨酸衍生物(如水杨酸辛酯)、二苯甲酮衍生物(“ASL-24”、“ASL-24S”(Shonan Chemical Services、Inc.)等)、二苯甲酰甲烷衍生物(“PARSOL A”、“PARSOL DAM”(DSM NutritionJapan K.K.)等)、杂环衍生物(“TINUVIN”系列等)和氧化钛；
金属清除剂，如依地酸二钠、依地酸三钠、柠檬酸、柠檬酸钠、酒石酸、酒石酸钠、乳酸、苹果酸、多聚磷酸钠、偏磷酸钠和葡萄糖酸；
皮脂抑制剂，如水杨酸、硫磺、咖啡因和丹宁；
杀菌消毒剂，如苯扎氯铵、氯苄乙胺和葡萄糖酸氯己定；
消炎药，如盐酸苯海拉明、氨甲环酸、愈创蓝油烃、甘菊环、尿囊素、扁柏酚、甘草酸及其盐、甘草酸衍生物和甘草次酸；
维生素，如维生素A、维生素B(B1、B2、B6、B12、B15)、叶酸、烟酸、泛酸、生物素、维生素C、维生素D(D2、D3)、维生素E、泛醌和维生素K(K1、K2、K3、K4)；
氨基酸及其衍生物，如天冬氨酸、谷氨酸、丙氨酸、赖氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、丝氨酸、半胱氨酸、胱氨酸、酪氨酸、脯氨酸、精氨酸和吡咯烷酮羧酸；
皮肤美白剂，如视黄醇、维生素E、磷酸抗坏血酸镁、维生素C糖苷、熊果苷、曲酸、鞣花酸和胎盘提取物；
抗氧化剂，如丁基羟甲苯、丁基羟基茴香醚和没食子酸丙酯；
收敛剂，如氯化锌、硫酸锌、酚锌、氧化锌和硫酸铝钾；
糖类，如葡萄糖、果糖、麦芽糖、蔗糖、海藻糖、赤藓糖醇、甘露糖醇、木糖醇和乳糖醇；
各种植物提取物，如甘草、甘菊、马栗树、草莓鹳、芍药根、榅椁、黄芩、黄柏皮、黄连茎、鱼腥草和二叶银杏；以及
油成分、表面活性剂、增稠剂、醇类、粉末成分和色素等。
实施例
[0037]将通过下列参照实施例和实施例说明本发明，但需知本发明不应只限于下列实施例。应注意，各乳酸菌的粒度是通过粒度分布分析仪(“SALD-3100，”Shimadzu Corporation)测量的。此外，可用商品化的ELISA试剂盒检测由经各乳酸菌刺激的巨噬细胞产生的IL-12和IFN-α。
[0038]参照实施例1
[死细胞的制备]
如表1所示，从京都的“酸茎渍”，长野的“すんき渍”、格鲁吉亚共和国的Mariami和Matsoni-like、蒙古的马奶酒以及各种发酵乳制品中分离有益长寿的乳酸菌，并在MRS培养基中于36.5℃培养48h，培养期间不调pH。在培养结束后，将培养物在80℃加热10分钟以进行灭菌处理。然后用PBS洗涤细胞，并将细胞浓度调至10mg/ml。
应注意的是，表中的缩略语“LBR”指短乳杆菌菌株FERM BP-4693。
[0039][细胞粒度与IL-12和IFN-α产生能力的相关性]
乳酸菌细胞粒度与IL-12和IFN-α产生能力的相关性分别示于图1A和图1B。
已证实，当乳酸菌的尺寸(粒度)小于约1μm(见表1、图1A和图1B)时，两种细胞因子IL-12和IFN-α的产生能力均显著提高。
但是，如图2所示，发现一些菌株在IL-12产生能力和IFN-α产生能力之间呈负相关性。例如，观察到这样的特征，即EF、KH1和KH3之类的菌株的IL-12产生能力高，而IFN-α产生能力低，相反，LL12和ML4之类的菌株的IL-12产生能力低，而IFN-α产生能力高；而SNK则IL-12产生能力和IFN-α产生能力都相对高。
[0040]表1
乳酸菌的来源、粒度和细胞因子产生能力

[0041]实施例1
[纳米大小的乳酸菌EF的制备]
用已知的添加有5wt％葡萄糖的营养培养基在36.5℃培养乳酸菌菌株——粪肠球菌EF，而且在培养期间用20wt％的氢氧化钠水溶液将pH控制在6.5。将葡萄糖耗尽的时间点作为培养终点(培养过程)。
在培养结束后，将培养物在80℃加热10分钟以进行灭菌处理，然后用PBS洗涤细胞，并将其细胞浓度调至10mg/ml(加工过程)。在加工过程中，使pH保持在6.5。
[粒度的比较]
测量了在参照实施例1和实施例1中制备的乳酸菌EF细胞的粒度。结果如图3所示。
如图3所示，与通过非中和培养的细胞粒度为1.215μm，即大于1.0μm相比，通过中和培养的细胞粒度为0.701μm，即小于1.0μm。
[0042]参照实施例2
[死细胞干粉的制备]
按照实施例1的方法培养乳酸菌菌株——粪肠球菌EF。所述乳酸菌本身的尺寸为0.6μm(图4A)，且可选择性地诱导细胞因子的2μm以下的颗粒的累积分布值为99％(图4B)。从培养物中浓缩细胞，并在不添加任何赋形剂的情况下将浓缩物喷雾干燥成粉末。
[粒度的比较]
将如上所述制备的粉末再分散于水中。结果如图4A所示，粒度分布平缓上升到100μm。如图4B所示，通过淋巴集结的达到20μm的颗粒的粒度累积分布为约50％，诱导Th2细胞的3μm-7μm的颗粒的粒度累积分布为约14％，且诱导Th1细胞的2μm以下的颗粒的粒度累积分布不过1％。从而表明，决不能认为所述诱导Th1应答和Th2应答的颗粒的混合是生理上优选的情况。
[0043]考虑到体内的消化活性，所述粉末也经用本领域已知技术制备的人造胃液和人造肠液处理。即使如此，诱导Th1细胞的2μm以下的颗粒的累积分布也顶多升至10％(图4)。
这样的累积粒度分布导致了有悬念的结果，即所期待的乳酸菌本身的功能是否未得到充分展现(顶多约10％)。
[0044]实施例2[纳米大小的乳酸菌——短乳杆菌的制备]
用已知的添加有5wt％葡萄糖的营养培养基在36.5℃培养乳酸菌菌株短乳杆菌BP-4693，且在培养期间用20wt％的氢氧化钠水溶液将pH控制在6.5。将葡萄糖耗尽的时间点作为培养终点(培养步骤)。
在培养结束后，将培养物在80℃加热10分钟以进行灭菌处理，然后用PBS洗涤细胞，添加4倍于所述细胞重量的糊精作为赋形剂。在混合器中分散混合物后，将分散物经冷冻干燥制成样品。将所述样品在PBS中再悬浮，使其细胞浓度达到10mg/ml(加工步骤)。在加工步骤中，使pH保持在6.5。
[0045][细胞粒度和IFN-α产生能力的比较]
测量了在参照实施例1和实施例2中制备的短乳杆菌BP-4693的细胞粒度和IFN-α产生能力，结果如图5所示。
如图5所示，与在非中和培养(用“LBR”表示)时，细胞粒度和IFN-α产生能力分别为8.8μm和16.8pg/ml相比，在中和培养(用“NANO-LBR”表示)时，细胞粒度降到0.7μm，即小于1.0μm，且IFN-α产生能力为92.9pg/ml，即与非中和培养时相比，产生能力增强了5.5倍。
[0046]上述结果证实，可通过将培养过程和加工过程的pH控制在中性区来将细胞粒度降至1.0μm以下，可通过添加约4倍于细胞重量的赋形剂，并使混合物经分散处理，然后冷冻干燥所得分散物来获得分散能力优良的细胞粉末，并且利用所得粉末，巨噬细胞可有效产生干扰素α。